液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法
【專利摘要】本發明涉及一種液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法。涉及的真菌毒素為：DON，D3G，NIV，3ADON，15ADON，FUSX及DOM等毒素。該方法采用改進的分散固相萃取法去除樣品中脂類等干擾物質，然后處理后的樣品通過液相色譜串聯三重四級桿質譜儀進行定性定量分析。本發明方法具有樣品前處理簡單快速經濟、分析時間短、靈密度及回收率高、重現性和專屬性好等優點，可適用于飼料及谷物樣本中多組分真菌毒素的檢測。為保障我國飼料及谷物類安全提供有效的技術支撐。
【專利說明】液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及飼料及谷物中真菌毒素測定的方法，具體涉及采用液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法。
【背景技術】
[0002]真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌產生的次級代謝產物。它們在農作物產品、食品及飼料中的污染情況日趨嚴重，對人和動物的健康造成了極大的危害。其中，B類單端孢霉烯族毒素是全球范圍內發生率最高的一類真菌毒素。它是由鐮刀菌產生且廣泛污染小麥、大麥、玉米等谷物及其產品。此類毒素主要包括5種:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(D0N)，雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)，3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3AD0N)，15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15AD0N)以及鐮刀菌酮-X(FUSX)。
[0003]DON能夠引起動物拒食、嘔吐、惡心、生長遲滯、神經內分泌紊亂和免疫抑制等癥狀。同時，它還具有很強細胞毒性(抑制DNA、RNA、蛋白質合成)、胚胎毒性(胚胎死亡、胎兒生長遲緩、功能發育不全)、一定致畸性、弱致癌性，并且影響人和動物的免疫系統。3AD0N及15AD0N是DON的乙酰化化合物。相較于DON的毒性，這兩種毒素具有相似甚至更高的毒性。研究表明，這兩種毒素在動物體內能夠脫乙酰化形成D0N，潛在地增加了 DON的攝入量。目前關于NIV及FUSX的毒理學研究較少。但是少數研究發現肉雞飼喂lmg/kg含NIV的飼料可出現輕微病理變化，而飼喂5mg/kg含DON的飼料則沒有明顯病變。
[0004]某些真菌毒素在植物體內酶的作用下能夠結合一些極性較強的物質，如糖、氨基酸、硫酸鹽等。這些結合態的毒素常規分析方法通常檢測不到，因此被稱為隱蔽型真菌毒素。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(D3G)是近年來報道最多的隱蔽型毒素，它被廣泛發現于谷物糧食類及啤酒發酵液中。研究表明，D3G毒性較低，但是人和動物攝入后在體內微生物的作用下它能夠被水解為DON毒素單體而發揮毒性作用，目前飼料中隱蔽型DON的污染情況還沒有報道。由于D3G潛在的健康風險，它引起了人們極大地關注。另外，脫環氧-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DOM)是DON在體內的主要代謝產物。在自然谷物類中還沒有被發現。考慮到動物源性組織可能被添加至飼料中作為蛋白質源，DOM也有必要進行檢測。
[0005]歐盟于2006年頒布了豬飼料及飼料用谷物中DON的建議限量值分別為900 μ g/kg和8000 μ g/kg ;我國于2007年頒布了配合飼料中DON限量標準《GB13078.3-2007配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的允許量》規定:豬配合飼料、犢牛配合飼料及泌乳期動物配合飼料中最大限量為1000 μ g/kg，牛配合飼料及家禽配合飼料中最大限量為5000 μ g/kg。另夕卜，聯合國糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)在于2010年召開的第72次會議上，建議制定包含D0N、3AD0N及15AD0N毒素總量的限量標準。同時D3G被JECFA認為是潛在的DON攝入來源。對于NIV，FUSX由于缺乏相關的毒理學研究，目前還沒有制定相關的限量標準。
[0006]目前谷物及食品中B類單端孢霉烯族毒素及D3G的檢測方法已經有報道:《Journal of agricultural and food chemistry》，2012,46,11638 和《Mycotoxinresearch》，2012，28，181通過多功能MycoS印226或225柱凈化后液相串聯質譜法測定谷物、玉米及其產品中D0N，D3G，3AD0N及15AD0N的含量。此類方法前處理操作繁瑣且成本較高，而且對D3G 回收率偏低(50% -60% );《Food additives and contaminants:Part A》,2009，26，507樣本提取后未凈化直接液相串聯質譜法測定小麥和玉米中DON及D3G含量。此方法雖然前處理簡單快捷，但是樣品中含有的脂類等干擾物質嚴重減低檢測靈敏度，而且長期使用對質譜離子源造成極大損壞。
[0007]目前飼料中隱蔽型DON及B類單端孢霉烯族類真菌毒素的污染情況還沒有報道。同時，現有的檢測此類真菌毒素的方法主要集中于食品及谷物類，未包括動物飼料。為了確保飼料安全及動物生產效率，有必要建立有效且可靠的分析方法來監控其發生及污染情況。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足，而提供一種前處理方法簡單經濟快捷、靈敏度及準確度高的液相串聯質譜法測定飼料及其谷物中B類單端孢霉烯族類及隱蔽型DON的方法。
[0009]為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案，具體包括如下步驟:
[0010](I)準確稱取樣品2g(精確至0.0lg)置于50mL離心管中，加入8mL乙腈/水溶液(84/16, ν/ν) ο潤旋振蕩2min后，超聲提取0.5h。然后在4000r/min下離心5min,取2mL上清液待凈化。
[0011](2)將2mL上清液轉移至15mL錐形離心管中，然后加入IOOmg無水硫酸鎂及ImL正己燒，劇烈潤旋Imin后在4000r/min下離心5min,正己燒層去除。剩余的溶液在40°C下氮氣吹干，加入500 μ L醋酸銨水溶液(5mM)劇烈渦旋，最后樣品溶液過0.22 μ m尼龍濾膜待分析。
[0012](3)將步驟⑵獲得的待檢測樣品通過液相色譜串聯質譜儀進行分析，分別獲得B族單端孢霉烯族類及D3G殘留量的結果。
[0013](4)步驟(3)中所使用的液相分析條件具體如下:
色譜柱:Agilent Extend_C18column (150mmX 3.0mm, 3.5 μ m),柱溫:40°C,流速:
0.3mL/min,進樣量:5 μ L ;
流動相:Α相:5mM醋酸銨水溶液，B相:甲醇；
梯度洗脫程序:0-lmin，20 % B ； l_5min，90 % B, 5_6min90 % B, 6-6.5min, 20 % B,
6.5-8min20% B ；
[0014](5)步驟(3)中所使用的質譜分析條件具體如下:
離子源模式:正負離子模式(ESI+和ESF);噴霧電壓:4.5kv(ESI+)和-3.5ky (ESF)；加熱塊溫度:400°C ;離子傳輸管溫度:250°C ;霧化氣及干燥氣流速:3mL/min和15mL/min ；7種真菌毒素的質譜參數見表I。
表I各真菌毒素的質譜參數
【權利要求】
1.一種液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (1)稱取粉碎后飼料或谷物樣品，加入提取溶液，渦旋及超聲振蕩提取后離心，取上清液待凈化； (2)上清液轉移至含有無水硫酸鎂及脫脂溶劑的離心管中，渦旋振蕩后，去除正己烷層；剩余溶液氮氣吹干后定容； (3)定容后的樣品通過液相色譜串聯質譜儀進行7種真菌毒素的定性定量分析。
2.如權利要求1所述一種液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法，其特征在于所述步驟(I)中飼料及谷物樣本為:豬飼料，雞飼料及玉米。
3.如權利要求1所述液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法，其特征在于所述步驟(I)中的提取溶液為84%乙腈-水溶液，及其甲醇-水溶液。
4.如權利要求1所述一種液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法，其特征在于所述步驟(2)中脫脂劑為包括正己烷、石油醚，及其它可以去除脂類物質的有機溶劑。
5.如權利要求1所述一種液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法，其特征在于所述步驟(3)中所測真菌毒素包括:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)，3_乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3AD0N)，15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15AD0N)以及鐮刀菌酮-X (FUSX)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇_3_葡萄糖苷(D3G)及脫環氧-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DOM)。
6.如權利要求1所述一種液相色譜串聯質譜法測定飼料及谷物中7種真菌毒素的方法，其特征在于所述步驟(3)中液相串聯質譜中色譜柱為包括但不限于C18，C8色譜柱，流動相包括但不限于甲醇、乙腈或含水溶液。
【文檔編號】G01N30/02GK103969364SQ201410152909
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月10日 優先權日:2014年4月10日
【發明者】武愛波, 趙志勇, 宋素泉, 王建華, 劉娜, 聶冬霞, 楊憲立, 林善海 申請人:上海市農業科學院, 上海科立特農產品檢測技術服務有限公司