基于兩種量子點之間能量轉移的赭曲霉毒素a檢測方法

基于兩種量子點之間能量轉移的赭曲霉毒素a檢測方法
【專利摘要】本發明屬于分析檢測領域，公開了一種基于兩種量子點間能量轉移的赭曲霉毒素A檢測方法。本發明選擇綠色量子點與OTA偶聯，紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯，二者混合后，由于抗原抗體特異性結合，兩種量子點間距離靠近而發生能量共振轉移，導致綠色量子點熒光下降，紅色量子點熒光增強。當反應體系含有OTA時，游離的OTA與綠色量子點偶聯的OTA共同競爭紅色量子點偶聯的抗體，OTA的濃度直接影響綠色量子點能量轉移效率，且在一定范圍內綠色量子點能量轉移效率與OTA濃度對數成反比例關系。本發明方法具有檢測時間短，靈敏度和準確性高，操作流程簡單和檢測成本低等特點。
【專利說明】基于兩種量子點之間能量轉移的赫曲霉毒素A檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物物理學分析檢測【技術領域】，涉及一種赭曲霉毒素A檢測的方法。【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素A (OTA)是糧食制品易污染的真菌毒素，對人體危害極大。加強對它的檢測監控對維護人類健康有著重要意義。目前快速篩查方法多為基于免疫學檢測方法對其進行定性定量分析，如酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、免疫層析柱測定法和基于不同標記物顯色的快速篩查試紙條等等。
[0003]1993年比利時科學家首次在Nature報道:在駱駝科動物血液中的抗體，只包含一個重鏈可變區(variable domain of heavy chain of HCAb, VHH)和兩個常規的 CH2 與CH3區，更重要的是單獨克隆并表達出來的VHH區具有很好的結構穩定性與抗原結合活性，VHH是目前可以得到的具有完整功能的穩定的可結合抗原的最小單位。其相對分子質量為15 000，僅為常規抗體的1/10左右，分子高度4.8 11111，直徑2.2 nm，所以VHH也稱納米抗體或單域抗體。
[0004]突光共振能量轉移(FGrsterresonance energy transfer,簡稱 FRET),是指受激發的能量供體將能量傳 遞給基態受體的一個非輻射能量轉移過程，它對能量供受體對之間的距離及相對偶極方向的納米范圍內變化非常敏感，只有在非常近的距離(10 nm)以內，才能夠發生有效的能量共振轉移，且這種能量轉移效率與供受體之間距離的6次方成反比(見公式I)。因此FRET被稱為一種高效的“光學分子尺”，近年來，該技術已經在物理、化學及生物學領域得到了廣泛的研究與應用。
[0005]公式1:E=nRQ6/ (n R06+r6)
公式I中E為能量轉移效率；n為每個能量供體分子對應的平均能量受體分子個數；r為能量供受體之間的距離^是距離常數。
[0006]將單域抗體和抗原分別與能量供受體偶聯，抗原抗體間特異性結合會使能量供受體之間靠近并發生能量共振轉移。而相對于傳統抗體，單域抗體體積小，按照公式I中能量轉移效率與能量供受體之間距離6次方成反比，即距離越近檢測靈敏度越高，可以大大提高能量轉移效率。并且，由于整個反應為均相的免疫學檢測反應，免疫學反應效率大大高于目前常規的半固相免疫學反應，既提高了檢測靈敏度，又能縮短檢測時間，如果配有高通量熒光檢測器，可以同時測定大量樣品。
[0007]量子點是一種隨粒徑大小變化可激發出不同波長熒光的納米晶體，隨粒徑或最大發射波長的變化，量子點呈現出不同的顏色。如在最大發射波長530 nm至550 nm范圍內的量子點呈現綠色，而在最大發射波長590 nm至620 nm范圍內的量子點呈現紅色。量子點的優點是熒光產率高，光穩定性好，激發光譜廣而發射光譜窄，并且量子點表面可以修飾任何所需的化學基團，能方便的標記在生物分子上，是作為FRET能量供受體的良好材料。

【發明內容】
[0008]本發明的創新性在于提出了一種新的快速、靈敏和廉價的免疫學定量檢測OTA的方法，即基于紅、綠量子點間能量共振轉移信號來定量檢測痕量的0ΤΑ。本發明基于兩種量子點之間能量轉移的OTA檢測方法，包括紅色量子點與OTA偶聯物(試劑I )，綠色量子點與抗OTA單域抗體偶聯物(試劑2)和結合緩沖液(試劑3)。其中紅、綠量子點的選擇前提是二者發射光譜沒有重疊，且綠色量子點的發射光譜在紅色量子點吸收光譜范圍內，具體為:綠色量子點最大發射波長介于530 nm至550 nm，表面氨基化修飾；紅色量子點最大發射波長介于590 nm至620 nm,表面羧基化修飾。
[0009]抗OTA單域抗體由OTA人工抗原免疫羊駝后由羊駝血液中分離獲得。
[0010]試劑I和試劑2在激發光下都有特征發射波譜出現，當試劑I和試劑2以一定比例與試劑3混合孵育片刻后，由于抗原抗體結合，兩種量子點靠近而產生能量共振轉移，綠色量子點的能量轉移給紅色量子點，使二者能量一升一降，體現在發射光譜上就是綠色量子點特征發射光檢測值下降而紅色量子點特征發射光檢測值提高，且升降幅度可以達到35%以上。在試劑1、試劑2和用試劑3倍比稀釋的OTA溶液混合孵育片刻后，由于游離的OTA與試劑I共同競爭試劑2，導致部分試劑I與試劑2不能結合而使綠色量子點能量回升，能量轉移效率下降。也就是說，OTA的濃度直接影響綠色量子點能量轉移效率，且在一定范圍二者成線性的反比例關系。以游離的OTA濃度對數值為橫坐標，綠色量子點能量轉移效率為縱坐標，繪制出的檢測OTA濃度的標準曲線。檢測食品樣品中OTA含量時，試劑1、試劑2和待測食品樣品中OTA提取溶液(以下簡稱待測樣液)混合孵育片刻后，測定熒光強度，代入公式I (參見實施例1)，按照計算出的能量轉移效率，可以根據標準曲線計算出對應的OTA含量。
[0011]本發明所述的一種基于兩種量子點之間能量轉移的赭曲霉毒素A檢測方法，技術方案包含下列步驟:
一種基于兩種量子點之間能量轉移的赭曲霉毒素A檢測方法，包含以下步驟:(1)分別制備綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯物；(2)將綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯物混合，并與梯度濃度的OTA標準品溶液在結合緩沖液中共孵育，在波長450 nm的激發光下測定綠色量子點能量轉移效率；以OTA標準品溶液濃度對數值為橫坐標，綠色量子點能量轉移效率為縱坐標，繪制檢測OTA的標準曲線；(3)將待測樣品提取液、綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯物在結合緩沖液中共孵育，測定綠色量子點能量轉移效率，與標準曲線比對即得到待測樣品提取液中OTA含量。
[0012]所述綠色量子點和紅色量子點滿足:二者發射光譜要分的足夠開，即二者的發射峰形不能有交疊，具體為:綠色量子點最大發射波長介于530 nm至550 nm，表面氨基化修飾；紅色量子點最大發射波長介于590 nm至620 nm,表面羧基化修飾。
[0013]所述步驟(I)中綠色量子點與OTA偶聯，采用NHS、DCC法活化0ΤΑ，再與綠色量子點偶聯，葡萄糖酸封閉綠色量子點表面殘留的氨基位點；量子點與OTA偶聯摩爾比為1:2?1:20，優選為1:10。
[0014]所述步驟(I)中紅色量子點與抗OTA單域抗體偶聯，采用EDC，NHSS介導將紅色量子點與抗OTA單域抗體偶聯，氨基葡萄糖封閉紅色量子點表面殘留的羧基位點；量子點與抗OTA單域抗體偶聯摩爾比為1:1。[0015]步驟(2)綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA單域抗體偶聯物混合摩爾比為1:1?1:6，優選為1:5。
[0016]使用的EDC和NHSS的物質量分別是量子點的100?500倍和50?100倍；活化時間是20?40min ;偶聯時將pH值調至7?8,偶聯時間是20?40min ;封閉劑葡萄糖酸或氨基葡萄糖的終濃度是0.1%?2%，封閉時間是0.5?I小時；封閉后調pH值至弱酸性為pH 4.5至5.5 ;偶聯產物用高速離心方法分離出來，離心條件是4°C?10°C，16000r/min?20000r/min，20?40min ;復溶液為含有20%至30%丙三醇的0.05mol/L碳酸氫鈉溶液或0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。
[0017]結合緩沖液為含10%甲醇的0.01 M磷酸鹽緩沖液，溶液pH值為7.4，結合溫度為37°C,結合時間20分鐘。
[0018]基于兩種量子點之間能量轉移的赭曲霉毒素A檢測方法，具體包括如下步驟:
(I)試劑I的制備:試劑I即綠色量子點與OTA偶聯物。采用NHS法制備OTA與綠色
量子點偶聯物，首先，OTA與NHS在DCC的輔助下脫水形成共價連接，DCC吸水形成相應的不溶物通過離心而除去；然后，加入表面氨基修飾的綠色量子點，量子點表面氨基取代NHS與OTA偶聯；之后，用葡萄糖酸封閉量子點表面殘留的氨基，調pH值至弱酸性后離心純化，沉淀部分加入復溶液復溶。
[0019](2)試劑2的制備:試劑2即紅色量子點與抗OTA單域抗體偶聯物。將表面羧基修飾的紅色量子點用水溶性碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉(NHSS)活化，與抗OTA單域抗體偶聯，之后用氨基葡萄糖封閉，調pH值至弱酸性，離心純化，加入復溶液復溶。
[0020](3) OTA濃度標準曲線的制作:試劑I單獨與試劑3 (即結合溶液，含10%甲醇的
0.0lM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)混合，在激發光下測定綠色量子點特征發射熒光強度，得到數據記為F。將試劑1、試劑2和用試劑3倍比稀釋的OTA溶液共同混合孵育后，在激發光下測定綠色量子點特征發射熒光強度，得到數據記為Fn，其中N代表OTA溶液的濃度。將(F -Fn)/ FX 100%記錄為熒光能量轉移效率E (%)。以OTA濃度對數為橫坐標，綠色量子點能量轉移效率E (%)為縱坐標，繪制出檢測OTA濃度的標準曲線。
[0021](4)0TA的檢測:疑似含有OTA的待測樣液與試劑I和試劑2在37°C下孵育20min，在激發光下測定綠色量子點特征發射熒光強度，得到數據帶入公式中Fn位置，計算得到E值，根據標準曲線計算得到待測樣液中OTA含量。
[0022]更具體的，包括如下步驟:
I)試劑I即綠色量子點與OTA偶聯物的制備:
1.1) OTA的活化:每Img OTA溶解于0.1mg無水四氫呋喃,加入0.6 mg N-輕基琥拍酰亞胺(NHS)及2mg N, N- 二環己基碳二亞胺(DCC)于室溫下避光劇烈搖動I小時，活化后4000r/min離心15min。取上清,揮發四氫呋喃,殘留物溶解于0.2mL 二甲基甲酰胺；
1.2)偶聯:每在潔凈的小燒杯中加入0.2mL硼酸鹽緩沖液和5 μ L濃度為ΙΟμΜ的綠色量子點，緩慢加入濃度為ΙΟμΜ的OTA活化物50 μ L，使OTA與綠色量子點偶聯摩爾比為10，室溫、避光下偶聯1.5h ；
1.3)封閉:加入1%葡萄糖酸100 μ L封閉45min,緩調pH至5.0 ;
1.4)純化:4°C，19000r/min，離心30min，吸去上清液，沉淀部分用20%甘油水溶液20 μ L復溶，得到的復溶液為后續實驗的1，000Χ試劑I母液； 2)試劑2即紅色量子點偶聯OTA單域抗體的制備:
2.1)紅色量子點活化:每在潔凈小燒杯中加入0.2mL硼酸水溶液，緩慢加入5 μ L濃度為ΙΟμΜ的紅色量子點，將8 μ L 0.5mg/mL 1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和2 μ L 0.5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHSS):混勻后加入，室溫活化20min:
2.2)偶聯:逐滴加入濃度為ΙΟμΜ的OTA單域抗體5 μ L，使OTA單域抗體與紅色量子點偶聯摩爾比為3:1，用0.1M NaOH調pH至7.4，室溫偶聯30min ；
2.3)封閉:加入5%氨基葡萄糖100 μ L封閉45min，用0.1M鹽酸緩調pH至5.0 ;
2.4)純化:4°C，19000r/min,離心30min，吸去上清液，沉淀部分用含有20%甘油的磷酸緩沖液(0.0lmol PB, pH7.4) 20 μ L復溶，得到的復溶液為后續實驗的200Χ試劑2母液；
3)0ΤΑ濃度標準曲線的制作:每各取試劑I和試劑2母液Iμ L，分別用ImL和0.2mL超純水稀釋，得到試劑I和試劑2待用液;10μ L試劑I與90μ L試劑3(含10%甲醇的1XPBS，ΡΗ7.4)混合，在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度(F2700型分光光度計，日立)，得到數據記為F ;將10 μ L試劑1、10 μ L試劑2和用80 μ L試劑3倍比稀釋的OTA溶液(Ong/mL至20ng/mL)，37°C孵育20min后，在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度，得到數據記錄為Fn，分別代表Ftl, F0.01, F0.06, F0.08, Fa 1、F0.3> Fa 5、F1和F5，其中下標數值代表OTA溶液濃度(ng/mL);將(F — Fn) / FX 100%記錄為熒光能量轉移效率E (%)；以OTA濃度對數值為橫坐標，熒光能量轉移效率E (%)為縱坐標，繪制出的檢測OTA濃度的標準曲線；
4)OTA的檢測:
4.1)待測樣品溶液準備:每取待測樣品lg，用5mL 60%甲醇水溶液震蕩提取5min，5000g離心IOmin,上清液經0.45 μ m濾器過濾，取100 μ L體積加入100 μ L 0.01Μ, ρΗ7.4的2 X PBS和400 μ L的ρΗ7.4的I XPBS稀釋，即得30倍稀釋的待測樣液；
4.2)取80 μ L待測樣液與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度，計算待測物的E (%)值，代入OTA濃度的標準曲線即得到待測樣液中OTA含量。
[0023]本發明技術方案具有如下優點:
(I)本發明技術方案靈敏度高，由于巧妙的運用了兩種量子點作為OTA和其單域抗體的標記物，利用抗原抗體反應的特異性確保了檢測的準確性。而量子點間的熒光能量共振轉移這一“分子尺”直接用于測定OTA的濃度信號，單域抗體的小尺寸大大縮小了紅綠量子點之間的距離，提高能量轉移效率。由于整個反應為均相的免疫學檢測反應，免疫學反應效率大大高于目前常規的半固相免疫學反應，提高了檢測靈敏度，且免去了常規ELISA反復洗板的繁瑣過程。
[0024](2)本發明技術方案操作方法簡單，檢測時間短。由于量子點具有優良的光化學穩定性，測試者在一臺熒光分光光度計做好OTA的標準曲線后，每次檢測只需要將3種試劑與待測樣液混合20min，讀取I個熒光數據，帶入公式即可得到準確的OTA濃度，整個檢測過程可在30min內完成。如果配有高通量熒光檢測器,此方法可以同時測定大量樣品。
[0025](3)本發明技術方案樣品和試劑用量少，檢測成本低。I微摩爾偶聯OTA的綠色量子點和5微摩爾偶聯OTA單域抗體的紅色量子點可以檢測5萬份OTA疑似污染的樣品。【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發明基于綠色量子點和紅色量子點間能量共振轉移建立的OTA檢測方法的熒光掃描圖。圖中實線是?ο μ L試劑I——偶聯OTA的綠色量子點(最大發射波長530nm)和10 μ L試劑2——偶聯單域抗體的紅色量子點(最大發射波長620nm)分別在90 μ L磷酸鹽緩沖液中的熒光發射掃描圖譜，即紅、綠量子點原有的能量發射圖譜；虛線圓點是10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在磷酸鹽緩沖液中37°C孵育20min后的熒光發射掃描圖譜，此時因抗原抗體結合使兩種量子點靠近而發生能量共振轉移，導致綠色量子點能量下降而紅色量子點能量升高；虛線短線是10 μ L試劑I和10 μ L試劑2與80 μ L濃度為3 ng/mL OTA的試劑3 (含10%甲醇的磷酸鹽緩沖液)37°C孵育20min后的熒光發射掃描圖譜，由于游離的OTA介入，能量轉移強度下降。上述激發波長均為450nm ；
圖2為實施例1中制作的OTA濃度的標準曲線。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
基于最大發射波長為530 nm的綠色量子點和最大發射波長為620 nm紅色量子點間能量共振轉移建立的OTA檢測方法，包括以下主要步驟。
[0028](I)綠色量子點與OTA偶聯物(試劑I)的制備:綠色量子點(貨號QSA a -530-20,表面氨基化修飾，Oceannano公司，美國)，OTA (Sigma公司，美國)；
DOTA的活化:每Img OTA溶解于0.1mg無水四氫呋喃，加入0.6 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及2mg N, N- 二環己基碳二亞胺(DCC)于室溫下避光劇烈搖動I小時，之后4000r/min離心15min。取上清，揮發四氫呋喃，殘留物溶解于0.2mL 二甲基甲酰胺；
2)偶聯:每在潔凈的小燒杯中加入0.2mL硼酸鹽緩沖液和5 μ L濃度為ΙΟμΜ的綠色量子點，緩慢加入濃度為ΙΟμΜ的OTA活化物50 μ L，使OTA與綠色量子點偶聯摩爾比為10，室溫、避光下偶聯1.5h。偶聯全過程用磁力攪拌器勻速緩慢攪拌；
3)封閉:加入1%葡萄糖酸100μ L封閉45min，緩調pH至5.0 ;
4)純化:4°C，19000r/min,離心30min，吸去上清液，沉淀部分用20%甘油水溶液20μ L復溶，得到的復溶液為后續實驗的1，000Χ試劑I母液。
[0029](2)紅色量子點與OTA單域抗體偶聯物(試劑2)的制備:量子點(貨號QSHb-620-20，表面羧基化修飾，Oceannano公司，美國)，OTA單域抗體(通過免疫羊駝、分離血清獲得);
1)量子點活化:每在潔凈小燒杯中加入0.2mL硼酸水溶液，緩慢加入5 μ L濃度為ΙΟμΜ的量子點，將8yL 0.5mg/mL 1_乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和2 μ L 0.5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHSS) '混勻后加入，室溫活化20min:
2)偶聯:逐滴加入濃度為ΙΟμΜ的OTA單域抗體5μ L，使OTA單域抗體與量子點偶聯摩爾比為1:1，用0.1M NaOH調pH至7.4，室溫偶聯3011^11 ；
3)封閉:加入5%氨基葡萄糖100μ L封閉45min，用0.1M鹽酸緩調pH至5.0 ;
4)純化:4°C，19000r/min,離心30min，吸去上清液，沉淀部分用含有20%甘油的磷酸緩沖液(0.01mol PB, pH7.4) 20 μ L復溶，得到的復溶液為后續實驗的200Χ試劑2母液。[0030](3)綠色量子點偶聯OTA、紅色量子點偶聯單域抗體后兩種量子點之間相互作用的考察:使用熒光掃描(附圖1)考察了兩種量子點偶聯抗原抗體后具體的行為關系。
[0031](4) OTA濃度標準曲線的制作:每各取試劑I和試劑2母液I μ L，分別用ImL和
0.2mL超純水稀釋，得到試劑I和試劑2待用液；10 μ L試劑I與90 μ L試劑3 (含10%甲醇的1XPBS，ΡΗ7.4)混合，在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度(F2700型分光光度計，日立)，得到數據記為F ;將10 μ L試劑1、10 μ L試劑2和用80 μ L試劑3倍比稀釋的OTA溶液(Ong/mL至5ng/mL)，37°C孵育20min后，在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度，得到數據記錄為Fn，分別代表Ftl, F0.01, F0.06, F0.08,F0.” F0.3、F0.5、F1和F5，其中下標數值代表OTA溶液濃度(ng/mL);將(F — Fn) / FX 100%記錄為熒光能量轉移效率E (%)；以OTA濃度對數值為橫坐標，熒光能量轉移效率E (%)為縱坐標，繪制出的檢測OTA濃度的標準曲線。得到的標準曲線方程為:0ΤΑ含量(ng/mL) =e
(E—16.54)/ 5.54
[0032](5) OTA 的檢測:
1)待測樣品溶液準備:每取待測樣品lg，用5mL60%甲醇水溶液震蕩提取5min，5000g離心10min,上清液經0.45 μ m濾器過濾，取100 μ L體積加入100 μ L 0.01Μ, ρΗ7.4的2 X PBS和400 μ L的ρΗ7.4的I XPBS稀釋，即得30倍稀釋的待測樣液；
2)取80μ L待測樣液與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度，計算待測物的E (%)值，代入OTA濃度的標準曲線方程即得到待測樣液中OTA含量，再乘以稀釋倍數30即得到對應樣品中OTA含量(μ g/kg)。
[0033]實施例2
基于最大發射波長為535 nm的綠色量子點和最大發射波長為620 nm的紅色量子點間能量共振轉移建立的OTA檢測方法，使用高通量檢測設備(全波長掃描式多功能讀數儀，熱電公司，美國)和96孔黑色熒光板(3603型，康寧，美國)。
[0034](I)綠色量子點與OTA偶聯物(試劑I)的制備:使用最大發射波長為535 nm的綠色量子點(QSA a-535-20，表面氨基化修飾，Oceannano公司，美國)，基本操作步驟同于實施例I。
[0035](2)紅色量子點與OTA單域抗體偶聯物(試劑2)的制備:基本操作步驟同于實施例I。
[0036](3) OTA濃度標準曲線的制作:分別取I μ L試劑I母液和5 μ L試劑2母液，各用ImL超純水稀釋，得到試劑I和試劑2。10 μ L試劑I與90 μ L試劑3 (即結合溶液，含10%甲醇的lXPBS，pH7.4)混合，加入96孔黑色熒光板孔al ;再將10 μ L試劑1、10yL試劑2和 80 μ L 試劑 3 稀釋的 OTA 溶液(濃度分別為 0.06ng/mL, 0.08 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.5 ng/mL, I ng/mL和5 ng/mL)于37°C孵育20min后,加入96孔黑色突光板孔a2至a8。在激發光450nm下測定535nm處熒光強度，孔al數據記為F。孔a2至a8得到數據分別記為匕^匕吣匕^匕丨匕^匕和匕代入公式丨(見實施例1)中Fn的位置，計算E (%)值。以游離的OTA濃度對數為橫坐標，E (%)為縱坐標，繪制檢測OTA濃度的標準曲線。
[0037](4) OTA的檢測:24份可疑含有OTA的花生樣品和24份玉米樣品分別粉碎，各稱取Ig待測。每份樣品用5mL 60%甲醇水溶液震蕩提取15min，9000 g離心10min，上清液經 0.45 μ m 濾器過濾，取 100 μ L 體積加入 100 μ L 的 2XPBS (0.01Μ, ρΗ7.4)和 400 μ L 的I XPBS (ρΗ7.4)稀釋，即得30倍稀釋的待測樣液。每份待測樣液分別取80 μ L與10 μ L試劑I和1(^1^試劑2在371:下孵育20min，加入黑色熒光板相應各孔，在激發光450nm下測定540nm處熒光強度，得到每個樣品的數據分別帶入公式(I)(見實施例1)中Fn位置，計算得到E值，根據標準曲線計算即得到待測樣液中OTA含量，再乘以稀釋倍數30即得到對應樣品中OTA含量(μ g/kg)。
[0038]實施例3
基于最大發射波長為540 nm的綠色量子點和最大發射波長為610 nm的紅色量子點間能量共振轉移建立的OTA檢測方法。
[0039](I)綠色量子點與OTA偶聯物(試劑I)的制備:使用最大發射波長為540nm的綠色量子點(QSAa-540-20，表面氨基化修飾，Oceannano公司，美國)，基本操作步驟同于實施例I。
[0040](2)紅色量子點與OTA單域抗體偶聯物(試劑2)的制備:使用最大發射波長為610nm的紅色量子點(QSHb-610-20，表面羧基化修飾，Oceannano公司，美國)，基本操作步驟同于實施例1。
[0041](3) OTA濃度標準曲線的制作:基本操作步驟同于實施例1。
[0042](4) OTA的檢測:可疑含有OTA的待測樣液(制備方法同實施例2) 80 μ L與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發光450nm下測定520nm熒光強度，得到數據帶入公式(I)(見實 施例1)中Fn位置，計算得到E值，根據標準曲線公式即得到待測樣液中OTA含量。
【權利要求】
1.一種基于兩種量子點之間能量轉移的赭曲霉毒素A檢測方法，其特征在于包含以下步驟:(1)分別制備綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯物；(2)將綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯物混合，并與梯度濃度的OTA標準品溶液在結合緩沖液中共孵育，在波長450 nm的激發光下測定綠色量子點能量轉移效率；以OTA標準品溶液濃度對數值為橫坐標，綠色量子點能量轉移效率為縱坐標，繪制檢測OTA的標準曲線；(3)將待測樣品提取液、綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯物在結合緩沖液中共孵育，測定綠色量子點能量轉移效率，與標準曲線比對即得到待測樣品提取液中OTA含量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述綠色量子點和紅色量子點滿足:綠色量子點最大發射波長介于530 nm至550 nm，表面氨基化修飾的量子點；紅色量子點最大發射波長介于590 nm至620 nm,表面羧基化修飾的量子點。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中綠色量子點與OTA偶聯，采用NHS活化法制備OTA與綠色量子點偶聯物，葡萄糖酸封閉綠色量子點表面殘留的氨基位點；量子點與OTA偶聯摩爾比為1:2~1:20，優選為1:10。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中紅色量子點與抗OTA單域抗體偶聯，抗OTA單域抗體 通過免疫羊駝后分離血清獲得，采用EDC，NHSS介導將紅色量子點與抗OTA的單域抗體偶聯，氨基葡萄糖封閉紅色量子點表面殘留的羧基位點，量子點與抗OTA的單域抗體偶聯摩爾比為1:1。
5.如權利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)綠色量子點與OTA偶聯物、紅色量子點與抗OTA單域抗體偶聯物混合摩爾比為1:1~1:6，優選為1:5。
6.如權利要求3或4所述方法，使用的EDC和NHSS的物質量分別是量子點的100~500倍和50~100倍；活化時間是20~40min ;偶聯時將pH值調至7~8，偶聯時間是20~40min ;封閉劑葡萄糖酸或氨基葡萄糖的終濃度是0.1%~2%，封閉時間是0.5~I小時；封閉后調PH值至弱酸性為pH 4.5至5.5 ;偶聯產物用高速離心方法分離出來，離心條件是 4°C~10°C，12000r/min ~20000r/min ,20 ~40min ;復溶液為含有 20% 至 30% 丙三醇的O至0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。
7.如權利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)結合緩沖液為含10%甲醇的0.01M磷酸鹽緩沖液，溶液PH值為7.4，結合溫度為37°C，結合時間20分鐘。
8.如權利要求1所述方法，其特征在于具體包括如下步驟: (1)試劑I即綠色量子點與OTA偶聯物的制備: I)OTA的活化:每Img OTA溶解于0.1mg無水四氫呋喃，加入0.6 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及2mg N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)于室溫下避光劇烈搖動I小時，活化后4000r/min離心15min ;取上清，揮發四氫呋喃，殘留物溶解于0.2mL 二甲基甲酰胺；2)偶聯:每在潔凈的小燒杯中加入0.2mL硼酸鹽緩沖液和5 μ L濃度為ΙΟμΜ的綠色量子點，緩慢加入濃度為ΙΟμΜ的OTA活化物50 μ L，使OTA與綠色量子點偶聯摩爾比為10，室溫、避光下偶聯1.5h ; 3)封閉:加入質量濃度1%的葡萄糖酸100 μ L封閉45min，緩調pH至5.0 ;4)純化:4°C，19000r/min，離心30min，吸去上清液，沉淀部分用20%甘油水溶液20 μ L復溶，得到的復溶液為后續實驗的1000Χ試劑I母液； (2)試劑2即紅色量子點與OTA單域抗體偶聯物的制備:1)紅色量子點活化:每在潔凈小燒杯中加入0.2mL硼酸水溶液，緩慢加入5 μ L濃度為ΙΟμΜ的紅色量子點，將8yL 0.5mg/mL 1_乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和2 μ L 0.5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHSS)混勻后加入，室溫活化.20min ； 2)偶聯:逐滴加入濃度為ΙΟμΜ的OTA單域抗體5 μ L，使OTA單域抗體與紅色量子點偶聯摩爾比為1:1，用0.1M NaOH調pH至7.4，室溫偶聯30min ； 3)封閉:加入5%氨基葡萄糖100 μ L封閉45min,用0.1M鹽酸緩調pH至5.0 ; 4)純化:4°C, 19000r/min,離心.3 0min,吸去上清液，沉淀部分用含有20%甘油的磷酸緩沖液(0.01mol PB, pH7.4) 20 μ L復溶，得到的復溶液為后續實驗的200Χ試劑2母液； (3)OTA濃度標準曲線的制作:每各取試劑I和試劑2母液I μ L，分別用ImL和0.2mL超純水稀釋，得到試劑I和試劑2待用液；10 μ L試劑I與90 μ L試劑3 (含10%甲醇的lXPBS，pH7.4)混合，在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度，得到數據記為F ;將10 μ L試劑1、10 μ L試劑2和用80 μ L試劑3倍比稀釋的OTA溶液(O ng/mL至5 ng/mL), 37°C孵育20min后,在激發光450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度，得到數據記錄為Fn，分別代表FcFdFdFdFdFc^FdF1和F5，其中下標數值代表OTA溶液濃度(ng/mL) df(F — Fn) / FX 100%記錄為熒光能量轉移效率E (%)；以OTA濃度對數值為橫坐標，熒光能量轉移效率E (%)為縱坐標，繪制出的檢測OTA濃度的標準曲線； (4)OTA的檢 測: .1)待測樣品溶液準備:每取待測樣品lg，用5mL60%甲醇水溶液震蕩提取5min，5000g離心10min,上清液經0.45 μ m濾器過濾，取100 μ L體積加入100 μ L 0.01Μ, ρΗ7.4的.2 X PBS和400 μ L的ρΗ7.4的I XPBS稀釋，即得30倍稀釋的待測樣液； . 2)取80μ L待測樣液與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發光.450nm下測定綠色量子點最大發射波長下的熒光強度，計算待測物的E (%)值，代入OTA濃度的標準曲線即得到待測樣液中OTA含量。
【文檔編號】G01N21/64GK103983622SQ201410151512
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月16日 優先權日:2014年4月16日
【發明者】熊勇華, 江湖, 許楊, 郭亮, 許恒毅 申請人:南昌大學