一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀，屬于農產品安全檢測【技術領域】。本發明所提供的基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀由三電極系統，信號檢測與處理系統，顯示與打印存儲系統和供電系統構成。三電極系統先通過酶傳感器，測定接觸樣品前后電流的變化，獲知樣品中是否含有農藥是否超標。如果有農藥超標，再使用免疫傳感器，測定接觸樣品前后電流的變化，獲知樣品中含有何種農藥及農藥的濃度等信息。本發明所提供的檢測儀具有操作簡單、價格低廉、靈敏度高、重復性好且能夠實現在線快速檢測，適用于農產品的現場快速檢測。
【專利說明】一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀，屬于農產品安全檢測【技術領域】。
技術背景
[0002]農藥是重要的農業生產資料，在農產品生產中對病、蟲、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是，農藥污染及其產生的危害后果是嚴重的，農藥對環境污染造成的損失是多方面的，包括對水環境的污染，對土壤的污染，對大氣的污染，對環境生物的影響以及對人體健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科學使用農藥知識，片面追求產量，造成目前市場上流通的農業產品都不同程度地存在農藥殘留問題，其危害也日益引起公眾的關注。我國是一個農業大國，隨著我國人民生活水平不斷提高，農產品的質量安全問題越來越受到關注，尤其蔬菜中農藥殘留問題已經成為公眾關注的焦點。我國生產和使用的殺蟲劑絕大多數品種為有機磷和氨基甲酸酯類農藥(約占70%)，其中高毒性的有機磷和氨基甲酸酷類殺蟲劑為70%左右，因此容易引起食物農藥殘留中毒。可見，加強對農廣品中農藥殘留的檢測對保護生態環境，尤其是保障人類健康有著十分深遠的意義，而農藥殘留檢測的重點應該放在有機磷和氨基甲酸酯類農藥。
[0003]目前農藥殘留分析的主要方法是氣相色譜儀、液相色譜儀、氣質聯用儀、液質聯用儀等，這些方法雖然分析精度高，定量準確，但其樣品的前處理復雜、檢測耗時長、成本高、需要技術熟練的操作人員。我國農藥殘留的速測方法是酶抑制試紙法和酶抑制分光光度法(農殘快速檢測儀)，可以實現有機磷農藥及氨基甲酸酯類農藥的現場快速檢測，具有較好的實用價值。速測卡是通過肉眼觀察卡片的顏色變化，因此一般只能用于嚴重超標的蔬菜樣品進行定性測量。酶抑制分光光度法的應用也比較廣泛，國內已有多種農藥殘留速測儀均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的變化進行檢測的，但蔬菜水果中大量的色素會對分光光度法造成很大的影響，導致檢測結果的不準確。并且上述方法存在回收率低、錯檢、漏檢比例較高、重復性差、難以滿足低殘留和定量檢測的要求等缺點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡單、價格低廉、靈敏度高、實現在線快速檢測的農藥殘留快速檢測儀。可以準確獲知樣品中含有農藥殘留是否超標且能何種農藥殘留及濃度等信息。所采取的技術方案如下:
一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀，是由三電極系統，信號檢測與處理系統，顯示與打印存儲系統和供電系統構成；
所述三電極系統由酶電極和免疫傳感器，三電極檢測電路，恒電位電路及模擬多路開關構成，酶電極和免疫傳感器從檢測樣品中采集電流信號，三電極檢測電路將電路信號傳向信號檢測與處理系統，恒電位電路為電極提供穩恒電壓，模擬多路開關分別逐次將免疫傳感器產生的電流信號采集并送入信號檢測與處理系統； 所述酶電極由一個工作電極構成，在工作電極表面固定有乙酰膽堿酯酶；所述免疫傳感器由一個圓形的電極盤構成，電極盤的中心位置有對電極和參比電極，外圍是均勻分布的陣列工作電極，陣列工作電極固定有農藥抗體；
所述信號檢測與處理系統由TLC272CP芯片，A/D轉換芯片和單片機構成，TLC272CP芯片的多路運放電路對從酶電極和免疫傳感器傳送來的電流信號進行I/V轉化，放大，濾波處理，A/D轉換芯片將轉換后的數字信號送入單片機，單片機具有微控制器，對轉換后的數字信號進行程序處理；
所述單片機的微控制器為STC89C52微控制器，單片機的程序包含數據打印與存儲，時間顯示，使用說明和對重要步驟提示的對話框，幫助用戶快速掌握儀器的使用方法以及進行數據打印和存儲；
所述顯示與打印存儲系統由顯示器電路，打印電路和存儲器電路構成，顯示器用于顯示數據并通過操作鍵進行控制，打印和存儲電路分別為微型打印機及存儲器相連進行數據打印和存儲；
所述供電系統電路由開關電源和電壓轉換電路構成，開關電源將交流電轉換成直流電經過電壓轉換電路分別向各系統電路和微型打印機供電，開關電源為+12V，1A、-12V，1A、+5V，5A三路輸出，電源與供電系統中的開關電源相連。
[0005]所述恒電位電路，為工作電極與參比電極之間提供500mV的穩恒電壓。
[0006]所述微控制器是內核為MCS-51的STC89C52RC+微控制器。
[0007]所述信號檢測與處理系統的存儲單元置入乙酰膽堿酯酶傳感器和免疫傳感器相應檢測農藥殘留的農藥濃度與電流關系的標準曲線數據庫。
[0008]所述顯示器采用3.5寸顯示屏；所述微型打印機采用微型嵌入式打印機。
[0009]一種利用所述檢測儀的檢測方法步驟如下:
1)將固定有乙酰膽堿酯酶的酶電極放入不含農藥的底物溶液中，檢測不含農藥時的電流I1，或者采用系統設定的默認值；
2)取出酶電極后，用蒸餾水沖洗，再將酶電極放入樣品液中孵育IOmin;
3)取出酶電極后，用蒸餾水沖洗，再次放入底物溶液中，檢測電流I2；
4)通過微控制器上的檢測程序根據抑制率公式，計算抑制率；
5)利用免疫傳感器替代酶電極，重復步驟I)至步驟4)過程重新檢測步驟4)所測抑制率聞于20%的樣品，并獲得超標抑制率；
6)將步驟5)所得超標抑制率與預先置入檢測儀的抑制率與農藥濃度標準曲線數據庫進行對比，獲得超標農藥種類和濃度；
7)權利要求6所述方法，其特征在于，步驟4)所述抑制率公式，具體為:
抑制率=(I1-12)/ I1Vo X 100%ο
[0010]本發明所提供的檢測儀的基本原理是:三電極系統先通過酶傳感器，測定接觸樣品前后電流的變化，獲知樣品中是否含有農藥是否超標。如果確有農藥超標，再使用免疫傳感器，測定接觸樣品前后電流的變化，獲知樣品中含有何種農藥及農藥的濃度等信息。農藥殘留檢測儀負責將三電極采集而來的微弱電流信號進行I/V轉換，放大，濾波，A/D轉換最終將數字量信號送入單片機進行程序處理。顯示與打印存儲系統將殘留的農藥濃度、抑制度等參數顯示出來，并將數據存儲下來以便用戶及時查看和進行數據分析。顯示與打印存儲系統內含微型打印機，可以將數據進行相應的打印輸出。
[0011]為了實現上述功能，所述的酶傳感器有一個工作電極構成，在工作電極表面固定乙酰膽堿酯酶，制備乙酰膽堿酯酶傳感器。所述的免疫傳感器由一個圓形的電極盤組成，中心位置有對電極和參比電極，外圍是均勻分布的工作電極，以確保對電極、參比電極與各工作電極的距離相等，其中陣列工作電極用來固定不同種類的農藥抗體。檢測儀存儲單元置入乙酰膽堿酯酶傳感器和免疫傳感器相應檢測農藥殘留的農藥濃度與電流關系的標準曲線數據庫。使用時先將固定乙酰膽堿酯酶傳感器與檢測儀相連，根據乙酰膽堿酯酶傳感器獲得的接觸樣品前后電流變化的信號，確定是否含有農藥且是否超標。如果有超標顯示，再將固定抗體的免疫傳感器陣列連接到檢測儀上，通過模擬多路開關分別逐次地將陣列免疫傳感器產生的電流信號采集送入檢測儀中，根據免疫傳感器獲得的接觸樣品前后電流的變化信號，確定具體何種農藥超標及濃度為多少。因此該檢測儀可在一次樣品取樣中同時獲取農藥是否超標，含有何種具體的農藥及濃度等信息。
[0012]本發明的有益效果:本發明所提供給的基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀，可以彌補乙酰膽堿酯酶生物傳感器和免疫傳感器存在的缺陷。乙酰膽堿酯酶傳感器只能檢測有機磷和氨基甲酸酯類，是否含有這一類農藥，而無法確定性的獲知是哪一種農藥殘留超標。免疫傳感器是抗原抗體的特異性識別，因此可以獲知具體哪一種農藥，但是抗體比較昂貴，如果沒有農藥殘留超標的信息，就沒有必要進行第二步的測量。因此本發明的一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀，既節約了檢測成本，又能確定性的獲知具體哪一種農藥殘留超標的信息，適合于農藥殘留的快速檢測。用此方法可以達到的檢測限為lug/L。準確率因為使用兩種傳感器進行檢測，所以準確度高于單純用酶傳感器和免疫傳感器的準確度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀的結構框圖。
[0014]圖2為本發明三電極與恒電位電路及A/D轉換前期處理電路。
【具體實施方式】
[0015]首先，對本發明的結構示意框圖加以說明；其次，對信號檢測及處理系統所包括的恒電位電路、A/D轉換前期處理電路加以詳細說明；最后，對整個系統的應用軟件及檢測流程加以說明。
[0016]圖1為本發明一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀的結構框圖。如圖1所示，本發明由三電極系統，信號檢測與處理系統，顯示與打印存儲系統，供電系統組成。三電極系統通過酶傳感器和免疫傳感器采集微弱電流信號；信號檢測與處理系統將三電極采集而來的微弱電流信號進行Ι/ν轉換，放大，濾波，A/D轉換最終將數字量信號送入單片機進行程序處理；顯示與打印存儲系統將殘留的農藥濃度、抑制度等參數顯示出來，并將數據存儲下來以便用戶及時查看和進行數據分析。顯示與打印存儲系統內置微型打印機，可以將數據進行相應的打印輸出。信號檢測與處理系統內部的單片機對顯示與打印存儲系統統一進行編程控制，同時也對其它系統進行響應。供電系統將交流電轉換成三路直流電為各系統電路以及微型打印機供電。所述的微控制器采用內核為MCS-51的STC89C52RC+微控制器，其上加載檢測程序。
[0017]本發明中，檢測電路中的恒電位電路為三電極系統電流/電壓轉化檢測電路提供穩定的工作電壓，圖2為恒電位儀電路及A/D轉換前期處理電路，由一個雙路運算放大器UlO TLC272CP和R44, R46, R4, C35, C16, R48構成。運放B的引腳6和7相連與A的3腳相連，A的2腳與三電極體系的工作電極相連并連上了 C16，增強抗干擾能力，R48是作為反饋電阻在放大器A上，B的5管腳外接一個電位器R46，由正5V供電激勵，R44，R46, R4通過電壓分壓供給500mv電壓給與B的5管腳形成恒電位電路，初始電壓為500mv.運放A和的引腳8接+5V電源，引腳4接-5V，U9 TLC272CP的運放B引腳7與引腳6直接相連作為電壓跟隨器，ADE引腳3與B的引腳5相連接，共同接地，起到抗干擾的作用。A的引腳2直接與三電極體系的參比電極相連接，引腳I直接與三電極體系的輔助電極相連接，之間連接電容14，目的是起隔離電路的作用，同時能提高帶負載的能力，因此U9和UlO共同構成了生物傳感器的三電極體系，所用檢測端由U9和UlO引出，采集與檢測電化學反應產生的微弱電流信號。
[0018]一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀的檢測流程是:首先，將固定乙酰膽堿酯酶的傳感器放入不含農藥的底物溶液中，測得不含農藥時的電流I1,即抑制前電流(抑制前電流也可以采用系統中設定的默認值);之后將酶傳感器的工作電極取出，用蒸餾水沖洗后，將固定乙酰膽堿酯酶的工作電極放入樣品液中孵育，等待10分鐘后取出用蒸餾水沖洗，再次放入底物溶液中，測得抑制后的電流I2;最后通過微控制器上運行的檢測程序自動計算出抑制率，計算公式如下:
抑制率=(I1-12)/ I1Vo X 100%O
[0019]如果抑制率超過20%，就使用陣列免疫傳感器重復以上操作，獲取檢測抑制率，根據陣列傳感器各通道測定電流變化的結果，再根據檢測儀置入的抑制率與農藥濃度的標準曲線數據庫對應可知道樣品中何種農藥以及農藥的濃度是多少。根據GB2763-2012中規定的食品中農藥最大殘留限量的國家標準，確定檢測的此種農藥是否超標。
[0020]微控制器根據得到的測定的抑制率做出定性結論，將結果送到顯示屏顯示，并將最后結果打印輸出，數據同時一并進行存儲供相關人員以后的查找和研究。
[0021]本發明微控制器上運行的檢測程序還包含屏幕跳轉演示和對重要步驟提示的對話框、打印提示，可以幫助用戶快速掌握儀器的使用方法。
[0022]下面就檢測過程的實施例做具體說明:首先，將鱷魚夾分別加緊三電極系統對應的三個柱狀電極，將固化酶的三電極浸入到含有碘化硫代乙酰膽堿的磷酸鹽緩沖溶液中按下檢測鍵，屏幕顯示開始檢測，約Imin后，基線達到穩定水平，約30s后，得到第一個完整的電流數據，記為I115待測樣品測試:將酶傳感器放入提取好的樣品溶液中，約lOmin，之后再將其浸入含有碘化硫代乙酰膽堿的磷酸鹽緩沖溶液中，第二次點擊檢測之后，觀察提示，顯示結果I2及抑制率；如果抑制率超過20%，屏幕提示進入第二輪測試。將各種農藥抗體的陣列免疫傳感器放入測試底液中，通過模擬多路開關分別逐次地將陣列免疫傳感器產生的電流信號采集送入檢測儀中，進行上述重復的二次測試(此時的測試底液改為鐵氰化鉀溶液)，獲得測試結果，如果測試結果中某一個免疫傳感器的電流變化抑制率超過20%，則將結果與置入的電流與農藥的標準曲線數據庫進行比對，最終顯示超標的農藥的種類及濃度。
[0023] 注意:1.若要測量下一個待測樣品，點擊復位即可。[0024]2.關機后須重新進行儀器調零和標準樣品測試。
[0025]本發明使用的一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀，可以實現農藥殘留的定性定量測量，同時本發明可以適用于同時檢測多種農藥殘留的檢測場合。上述實施例是對本發明做進一步說明，本發明不受實施例的限制。
【權利要求】
1.一種基于酶免疫傳感器的農藥殘留快速檢測儀，其特征在于，由三電極系統，信號檢測與處理系統，顯示與打印存儲系統和供電系統構成； 所述三電極系統由酶電極和免疫傳感器，三電極檢測電路，恒電位電路及模擬多路開關構成，酶電極和免疫傳感器從檢測樣品中采集電流信號，三電極檢測電路將電路信號傳向信號檢測與處理系統，恒電位電路為電極提供穩恒電壓，模擬多路開關分別逐次將免疫傳感器產生的電流信號采集并送入信號檢測與處理系統； 所述酶電極由一個工作電極構成，在工作電極表面固定有乙酰膽堿酯酶；所述免疫傳感器由一個圓形的電極盤構成，電極盤的中心位置有對電極和參比電極，外圍是均勻分布的陣列工作電極，陣列工作電極固定有農藥抗體； 所述信號檢測與處理系統由TLC272CP芯片，A/D轉換芯片和單片機構成，TLC272CP芯片的多路運放電路對從酶電極和免疫 傳感器傳送來的電流信號進行I/V轉化，放大，濾波處理，A/D轉換芯片將轉換后的數字信號送入單片機，單片機具有微控制器，對轉換后的數字信號進行程序處理； 所述單片機的微控制器為STC89C52微控制器，單片機的程序包含數據打印與存儲，時間顯示，使用說明和對重要步驟提示的對話框，幫助用戶快速掌握儀器的使用方法以及進行數據打印和存儲； 所述顯示與打印存儲系統由顯示器電路，打印電路和存儲器電路構成，顯示器用于顯示數據并通過操作鍵進行控制，打印和存儲電路分別與微型打印機和存儲器相連進行數據打印和存儲； 所述供電系統電路由開關電源和電壓轉換電路構成，開關電源將交流電轉換成直流電經過電壓轉換電路分別向各系統電路和微型打印機供電，開關電源為+12V，1A、-12V，1A、+5V, 5A三路輸出，電源與供電系統中的開關電源相連。
2.權利要求1所述檢測儀，其特征在于，所述恒電位電路，為工作電極與參比電極之間提供500mV的穩恒電壓。
3.權利要求1所述檢測儀，其特征在于，所述微控制器是內核為MCS-51的STC89C52RC+微控制器。
4.權利要求1所述檢測儀，其特征在于，所述信號檢測與處理系統的存儲單元植入乙酰膽堿酯酶傳感器和免疫傳感器相應檢測農藥殘留的農藥濃度與電流關系的標準曲線數據庫。
5.權利要求1所述檢測儀，其特征在于，所述顯示器采用3.5寸顯示屏；所述微型打印機采用微型嵌入式打印機。
6.一種權利要求1所述檢測儀的檢測方法，其特征在于，步驟如下: 將固定有乙酰膽堿酯酶的酶電極放入不含農藥的底物溶液中，檢測不含農藥時的電流I1，或者采用系統設定的默認值； 取出酶電極后，用蒸餾水沖洗，再將酶電極放入樣品液中孵育IOmin ； 取出酶電極后，用蒸餾水沖洗，再次放入底物溶液中，檢測電流I2 ; 通過微控制器上的檢測程序根據抑制率公式，計算抑制率； 利用免疫傳感器替代酶電極，重復步驟I)至步驟4)過程重新檢測步驟4)所測抑制率聞于20%的樣品，并獲得超標抑制率；將步驟5)所得超標抑制率與預先植入檢測儀的抑制率與農藥濃度標準曲線數據庫進行對比，獲得超標農藥種類和濃度。
7.權利要求6所述方法，其特征在于，步驟4)所述抑制率公式，具體為:抑制率=(I1-12)/ 11V0 X 100%O
【文檔編號】G01N27/26GK103940868SQ201410150101
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】孫霞, 郭業民, 王相友, 劉君峰, 趙文蘋 申請人:山東理工大學