檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法。方法步驟為：1）豬瘟全病毒抗原的制備、滅活和96孔聚苯乙烯反應板包被；2）利用懸掛棉繩法，采集唾液，處理后獲得唾液一抗；3）將唾液一抗，按編號加入抗原包被的反應板上，22-28℃飽和濕度反應1小時，洗滌；4）將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，按順序加入到反應板上，22-28℃飽和濕度避光反應30分鐘，洗滌；5）將TMB顯色劑A液和B液1:1混合后，按順序加入到反應板上，避光反應15分鐘，加入終止液；6）放入酶標儀中，讀取OD650數據，判定結果。本發明避免了單個動物采血的問題，適用于豬群大面積的豬瘟抗體調查。
【專利說明】檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法。
【背景技術】
[0002]豬瘟(Classical swine fever, CSF)是目前危害我國養豬業最重要的疾病，其病理特征表現為小血管壁的變性，致使內臟器官多發性出血、梗塞和壞死，以出血和發熱為主要特征，呈急性或慢性經過，對養豬業危害極大。
[0003]豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是引起豬痕的病原,該病具有高度接觸性和致死性、傳播速度快、流行廣泛、發病率和死亡率高等特點。臨床上，該病可分為急性、亞急性、慢性、非典型性和不明顯型。急性CSF由強毒株引發，一般導致高發病率和死亡率，而弱毒病毒感染則表現不明顯。
[0004]豬瘟的發現已有180多年歷史，世界各國均對該病的防控做出了巨大的努力，目前北美、澳洲和北歐的一些地區已成功地消滅了豬瘟，但豬瘟在其他許多地區仍廣泛流行。墨西哥、巴西、南美的大部分地區豬瘟仍呈地方性流行，在加勒比地區古巴、海地和多米尼加都存在豬瘟，在東南亞地區的大多數國家仍存在豬瘟的間歇發生。
[0005]自從1969年在我國使用兔化弱毒疫苗后，豬瘟的暴發明顯減少。目前在我國大陸和臺灣地區仍有有豬瘟流行，其中大陸多以散發和慢性病例為主，但從20世紀80年代以后，臨床癥狀不典型且病程變長的非典型性豬瘟(或慢性豬瘟)成為該病的主要發生形式，持續感染普遍存在，疫苗的預防效果明顯下降，使豬瘟防制遇到了新的困難。據估計，臨床健康的豬群中，大約20%-30%的動物持續帶毒；我國每年由豬瘟致死的豬占總死亡數的1/3，經濟損失在20億元左右。
[0006]目前，疫苗免疫依然是我國豬瘟防控的最主要手段。采集免疫后豬只血液樣本，分離血清，并檢測特異性的血清抗體，是目前監控豬瘟主要的手段，對豬瘟疫苗免疫效果評價、免疫程序制定、流行狀態監測均具有重要意義。然而這種采樣方式存在諸多限制，一方面這種采集血液、分離血清的方法費時費力，采集的樣本數量不大，占豬群的比例不高,且對動物的應激非常大。固定一頭體重在50公斤左右的生長豬，并從前腔靜脈采集血液，通常需要2-3個人，平均花費10分鐘左右。而本專利設計的唾液樣本采集方法，則以同一欄的豬為單位采集(15-20頭)，只需一個人，平均花費5分鐘，懸掛和收集唾液采集繩，即可。相對而言，唾液采集法獲得的樣本可覆蓋整群動物，數據基本可代表整群動物的平均免疫情況，更能反映豬群抗體的總體水平。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法。
[0008]檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法包括如下步驟:1)豬瘟全病毒抗原的制備、滅活和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板；
2)利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗，保存備用；
3)將唾液一抗，以PBST溶液1:1稀釋后，按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加IOOul，22-28°C飽和濕度反應I小時，洗滌備用；
4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST溶液1:2000稀釋后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加IOOul，22-28°C飽和濕度避光反應30分鐘，以PBST洗滌備用；
5)將TMB顯色劑A液和B液1:1混合后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加50ul,避光反應15分鐘，隨后每個反應孔加入50ul 2M濃硫酸,終止反應；
6)放入酶標儀中，讀取0D650數據，判定結果。
[0009]所述的步驟I)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬瘟C株全病毒純化滅活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，并以5%脫脂奶粉封閉，獲得ELISA反應的抗原基質，置于4°C備用。
[0010]所述的步驟2)為:以6股、直徑3mm、長Im的全棉繩索懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集與無菌的50ml離心管中，以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，保存備用。
[0011]所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陽性樣品與已知陰性樣品的比值P/N≥2.1，而且已知陽性樣品的OD值≥0.35 ;在上述條件成立的情況下，如果待檢唾液樣品與已知陰性樣品的比值P/N≥2.1，而且待檢唾液樣品的OD值≥0.35，則判為陽性、即對應群體豬瘟抗體的陽性率> 80% ;否則判為陰性，即對應群體豬瘟抗體的陽性率< 80%。
[0012]本發明提供的豬瘟病毒唾液抗體采集和檢測方法，避免了對單個動物采血的問題，相對于傳統的血清抗體采集和檢測方法，具有以下優點:1)唾液抗體的棉繩采集法對豬群沒有任何應激，2)節省采樣時間達80%以上，3)節省2/3的采樣人員，4)唾液樣品對溫度、環境、污染物的抵抗力更強，運輸和保存更方便，4)可以對整個豬群實行大面積采樣，所得結果更客觀全面，5)豬瘟病毒唾液抗體檢測與血清抗體檢測的符合率在94%以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法的過程示意圖；
圖2是本發明的利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗的示意圖。
【具體實施方式】
[0014]檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法包括如下步驟:
1)豬瘟全病毒抗原的制備、滅活和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板；
2)利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗，保存備用；
3)將唾液一抗，以PBST溶液1:1稀釋后，按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加IOOul，22-28°C飽和濕度反應I小時，洗滌備用；
4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST溶液1:2000稀釋后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加IOOul，22-28°C飽和濕度避光反應30分鐘，以PBST洗滌備用；
5)將TMB顯色劑A液和B液1:1混合后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加50ul,避光反應15分鐘，隨后每個反應孔加入50ul 2M濃硫酸,終止反應；
6)放入酶標儀中，讀取0D650數據，判定結果。
[0015]所述的步驟I)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬瘟C株全病毒純化滅活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，并以5%脫脂奶粉封閉，獲得ELISA反應的抗原基質，置于4°C備用。
[0016]所述的步驟2)為:以6股、直徑3mm、長Im的全棉繩索懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集與無菌的50ml離心管中，以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，保存備用。
[0017]所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陽性樣品與已知陰性樣品的比值P/N ≥2.1，而且已知陽性樣品的OD值≥0.35 ;在上述條件成立的情況下，如果待檢唾液樣品與已知陰性樣品的比值P/N≥2.1，而且待檢唾液樣品的OD值≥0.35，則判為陽性、即對應群體豬瘟抗體的陽性率> 80% ;否則判為陰性，即對應群體豬瘟抗體的陽性率< 80%。
實施例
[0018]I)以商品化的豬瘟病毒疫苗C株，1000 TCID50/ml (半數細胞感染量/毫升)濃度，感染ST細胞，培養48小時后，收集病毒液，4000g離心10min，取上清；35000g離心lh，獲得純化病毒，并滴定TCID50。將病毒液置于65°C水浴中，滅活30min，獲得豬瘟全病毒純化滅活抗原。將滅活抗原以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，，飽和濕度下，22-28°C孵育lh，然后轉到4°C孵育16h。隨后棄去包被液，拍干ELISA板，加入以PBST (pH7.3,0.05% tween-20)稀釋的5%脫脂奶粉IOOul/孔，于22-28°C封閉2h。棄去封閉液，拍干ELISA板，每孔加入150 ul洗液(PBST)，洗滌5 minX3次，拍干ELISA板，置于4°C備用，見圖1。
[0019]2)以定制全棉繩索(6股、直徑3mm、長Im)懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外，用力擰繩索，擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集于無菌的50ml離心管中，用于初步保存和運輸(常溫下、6小時內，或4°C下、72小時內運至實驗室)。將唾液以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，并與4°C (<7d)或_20°C (<60d)保存備用，見圖2。
[0020]3)將處理備用的唾液一抗，以PBST (1:1)稀釋后，按編號加入抗原包被的反應板上，IOOul/孔，每個樣品3個重復，同時設置PBST陰性和血清陽性抗體對照個3個孔。飽和濕度下，22-28°C孵育lh。隨后棄去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST)，洗滌5 minX3次，拍干ELISA板，備用，見圖1。
[0021]4)將辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST為稀釋液，作1:2000倍稀釋后，按IOOul/孔加入到上述一抗包被的反應孔中，22-28°C /飽和濕度反應30分鐘，隨后棄去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST)，洗滌5minX3次，拍干ELISA板，備用，見圖1。
[0022]5) TMB顯色劑由A液(TMB原粉以乙醇溶解配成4.0mg/ml，用時以超純水稀釋20倍)和B液(尿素過氧化氫以pH5.2磷酸鹽緩沖液配制成0.15mg/ml終濃度)兩種儲存溶液組成，現用現配，配制比例為1:1。將配制好的TMB顯色液按50ul/孔加入到上述反應孔中，室溫避光反應15min，隨后加入50ul/孔終止液(2M濃硫酸)，終止反應，見圖1。
[0023]6)將終止后的反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陽性樣品與已知陰性樣品的比值(P/N)≥2.1，而且已知陽性樣品的OD值≥ 0.35 ;在上述條件成立的情況下，如果待檢口水樣品與已知陰性樣品的比值(P/N)≥2.1，而且待檢唾液樣品的OD值≥0.35，則判為陽性、即對應群體豬瘟抗體的陽性率≥80% ;否則判為陰性，即對應群體豬瘟抗體的陽性率< 80%。
[0024]本發明以相同的抗原包被板和分別優化的反應程序，對浙江省某4000頭基礎母豬的地規模化豬場，進行了唾液抗和血清抗體的檢測對照實驗。實際采樣覆蓋動物180頭，采集唾液樣本17個,采集血清樣本180份。。如表1所示，相對血清抗體的采集(前腔靜脈采血)，唾液抗體樣本的采集在時間和人力需求上，具有明顯優勢。如表2所示，唾液抗體和血清抗體在最終結果的判斷上，符合率在94%以上，完全可以滿足臨床大樣本的抗體調查需要。
[0025]表1兩種抗體田間采樣所需人員和時間的對比
【權利要求】
1.一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)豬瘟全病毒抗原的制備、滅活和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板； 2)利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗，保存備用； 3)將唾液一抗，以PBST溶液1:1稀釋后，按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加IOOul，22-28°C飽和濕度反應I小時，洗滌備用； 4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以PBST溶液1:2000稀釋后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加IOOul，22-28°C飽和濕度避光反應30分鐘，以PBST洗滌備用； 5)將TMB顯色劑A液和B液1:1混合后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加50ul,避光反應15分鐘，隨后每個反應孔加入50ul 2M濃硫酸,終止反應； 6)放入酶標儀中，讀取0D650數據，判定結果。
2.根據權利要求1所述的一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于，所述的步驟I)為:以PH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬瘟C株全病毒純化滅活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，并以5%脫脂奶粉封閉，獲得ELISA反應的抗原基質,置于4°C備用。
3.根據權利要求1所 述的一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于，所述的步驟2)為:以6股、直徑3mm、長Im的全棉繩索懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集與無菌的50ml離心管中，以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，保存備用。
4.根據權利要求1所述的一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于，所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陽性樣品與已知陰性樣品的比值P/N ^ 2.1，而且已知陽性樣品的OD值> 0.35 ;在上述條件成立的情況下，如果待檢唾液樣品與已知陰性樣品的比值P/N≤2.1，而且待檢唾液樣品的OD值≤0.35，則判為陽性、即對應群體豬瘟抗體的陽性率> 80% ;否則判為陰性，即對應群體豬瘟抗體的陽性率< 80%。
【文檔編號】G01N33/569GK103995119SQ201410147371
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】李龍, 章葉恩, 曹洋洋 申請人:杭州貝爾塔生物技術有限公司