絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法
【專利摘要】本發明涉及動物組織學【技術領域】的研究，具體涉及到在透射電鏡下觀察所用超薄切片的制作及染色方法。一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，其主要特點在于包括有步驟為：（1）選取成年絨山羊，從體側部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮樣；（2）樣品的固定：（3）將步驟（2）固定好的皮樣用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10-15min；（4）置入2%的鋨酸2-4℃，固定3-5h；（5）使用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10-15min；（6）脫水；（7）包埋：在按1:1純包埋劑和100%丙酮混合液中第一次浸透3-6h，然后在純包埋劑中浸透10-12h。本發明的優點是流程簡單，操作方便，獲得的切片完整，圖片結構清晰。適用于實驗室科研工作者對絨山羊皮膚形態結構的研究。
【專利說明】絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物組織學【技術領域】蛋白定位的輔助研究，具體涉及到在透射電鏡下觀察超薄切片的制作及染色方法。
【背景技術】
[0002]山羊絨是絨山羊的主要產品。毛囊是一個形態和結構較為復雜的皮膚附屬器官，它控制著毛發的生長。初級毛囊生長粗毛，次級毛囊生長絨。皮膚和毛囊的結構特征不僅是其生物學特性的重要內容，且對毛產量和品質有直接重要的影響。目前運用透射電鏡對毛囊進行超微結構的觀察是最普遍且最佳的方法，但由于皮膚缺乏實質的組織，角化程度又比較高，相對比較脆，這個在超薄切片過程中會帶來很大的挑戰。擁有一套最佳的樣品處理方法，和對毛囊中不同組織和結構的識別技能，為毛囊組織學的研究提供技術指導和理論依據，對實現人工調控絨生長和加快絨山羊育種進展具有重要意義。
[0003]前人研究所用方法基本停留在光鏡水平，偶有涉及透射電鏡的，也只是對所用方法大概的描述，且步驟較為繁瑣。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法。以解決切片完整，沒有碎裂，透射電鏡下觀察結構清晰，細胞器結構完整，用于絨山羊皮膚超微結構的研究。
[0005]為實現上述目的，本發明采取的技術方案為:一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，其主要特點在于包括有步驟為:
[0006](I)選取成年的絨山羊，從體側部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮樣；
[0007](2)樣品的固定:
[0008]①第一次固定:剪取0.8-1.2cm2的皮樣，展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器內固定，2-4°C,6_12h ；
[0009]②第二次固定:從第一次固定好的皮樣上采取1-1.2mm3的電鏡樣，置于2.5-3%的第二次固定液中固定，2-4°C，5-6h ；
[0010](3)將步驟(2)固定好的皮樣用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10-15min ；
[0011](4)置入 2% 的鋨酸 2-4。。，固定 3-5h ；
[0012](5)使用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10_15min ；
[0013](6)脫水:使用50%-100%酒精，脫水4-6次，每次10min_15min ;使用100%丙酮脫水10-15min ;然后再次使用100%丙酮脫水10_15min ；
[0014](7)包埋:在按1:1純包埋劑和100%丙酮混合液中第一次浸透3_6h，然后在純包埋劑中浸透10-12h。
[0015]所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，還包括步驟為:[0016](8)染色:第一次使用5%醋酸鈾乙醇溶液30_40min染色，然后第二次使用鉛5-10min 染色。
[0017]所使用的5%醋酸鈾乙醇溶液的配方:醋酸鈾5克；70%乙醇溶液100mL。
[0018]所使用的鉛配方:硝酸鉛2.0克；醋酸鉛1.0克；枸櫞酸鈉3.5克；4%NaOH水溶液18ML ;雙蒸水定容至100ML。
[0019]所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，所述的第一次固定液為3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀釋液為0.2mol/L的磷酸緩沖液，PH為7.2 ;第二次固定液為0.2M磷酸緩沖液50ml，25%戊二醛12ml，蔗糖8g，超純水定容至100mL，
[0020]所述的絨山羊皮膚用于電鏡觀察的超薄切片的制備方法，所述的包埋劑為20ML，其中MNA (甲基內次甲基四氫鄰苯二甲酸酐)7ml，SP1-P0N812 (環氧樹脂812)9.12ml，DDSA(十二烷基琥珀酸酐)6.17ml，DMP-30 (2，4，6-三【(二甲氨基)甲基】苯酚)0.3ml。
[0021]本發明的有益效果:本發明流程簡單，操作方便，獲得的切片完整，圖片結構清晰。適用于實驗室科研工作者對絨山羊皮膚形態結構的研究。
[0022]在透射電鏡下進行觀察，本發明能夠清晰的呈現毛囊的各層超微結構，且在切片過程中不容易發生碎片現象。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0023]圖1是絨山羊皮膚毛囊完整的橫切超微結構顯微圖；
[0024]圖2是絨山羊皮膚毛囊外根鞘(ORS)和內根鞘(IRS)超微結構顯微圖。
【具體實施方式】
[0025]以下結合實施例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。
[0026]實施例1:一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，包括有步驟為:
[0027](I)選取成年的絨山羊，從體側部用剪刀剪取0.8cm2的皮樣；
[0028](2)樣品的固定:
[0029]①第一次固定:剪取0.8cm2的皮樣，展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器內固定，2°C,6h ；
[0030]②第二次固定:從第一次固定好的皮樣上采取Imm3的電鏡樣，置于2.5%的第二次固定液中固定，2°C，5h ；
[0031]所述的第一次固定液為3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀釋液為0.2mol/L的磷酸緩沖液，PH為7.2 ;第二次固定液為0.2M磷酸緩沖液50ml，25%戊二醛12ml,鹿糖8g,超純水定容至100ml。
[0032](3)將步驟(2)固定好的皮樣用0.lmol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次IOmin ；
[0033](4 )置入2%的鋨酸2 °C，固定3h ;
[0034](5)使用0.lmol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次IOmin ；
[0035](6)脫水:使用50%-100%酒精，脫水4次，每次10min_15min ;使用100%丙酮脫水IOmin ;然后再次使用100%丙酮脫水IOmin ；
[0036](7)包埋:在按1:1純包埋劑和100%丙酮混合液中第一次浸透3h，然后在純包埋劑中浸透10h。
[0037]所述的包埋劑為20ML，其中MNA (甲基內次甲基四氫鄰苯二甲酸酐)7ml，SP1-P0N812 (環氧樹脂 812)9.12ml，DDSA (十二烷基琥珀酸酐)6.17ml，DMP_30 (2，4，6-三【(二甲氨基)甲基】苯酚)0.3ml。
[0038]實施例2:—種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，包括有步驟為:
[0039](1)選取成年的絨山羊，從體側部用剪刀剪取1.2cm2的皮樣；
[0040](2)樣品的固定:
[0041]①第一次固定:剪取1.2cm2的皮樣，展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器內固定，4°C，12h ；
[0042]②第二次固定:從第一次固定好的皮樣上采取1.2mm3的電鏡樣，置于3%的第二次固定液中固定，4°C，6h ；
[0043]所述的第一次固定液為3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀釋液為0.2mol/L的磷酸緩沖液，PH為7.2 ;第二次固定液為0.2M磷酸緩沖液50ml，25%戊二醛12ml,鹿糖8g,超純水定容至100ml。
[0044](3)將步驟(2)固定好的皮樣用0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次15min ；
[0045](4)置入2%的鋨酸4°C，固定5h ;
[0046](5)使用0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次15min ；
[0047](6)脫水:使用50%-100%酒精，脫水6次，每次10min_15min ;使用100%丙酮脫水15min ;然后再次使用100%丙酮脫水15min ；
[0048](7)包埋:在按1:1純包埋劑和100%丙酮混合液中第一次浸透6h，然后在純包埋劑中浸透12h。
[0049]所述的包埋劑為20ML，其中MNA (甲基內次甲基四氫鄰苯二甲酸酐)7ml，SP1-P0N812 (環氧樹脂 812)9.12ml，DDSA (十二烷基琥珀酸酐)6.17ml，DMP_30 (2，4，6-三【(二甲氨基)甲基】苯酚)0.3ml。
[0050]實施例3:所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，還包括步驟為:
[0051]步驟(1)至步驟(7)與實施例1或實施例2相同。
[0052](8)染色:第一次使用5%醋酸鈾乙醇溶液30min染色,然后第二次使用鉛5min染色。
[0053]所使用的5%醋酸鈾乙醇溶液的配方:醋酸鈾5克；70%乙醇溶液100mL。
[0054]所使用的鉛配方:硝酸鉛2.0克；醋酸鉛1.0克；枸櫞酸鈉3.5克；4%NaOH水溶液18ML ;雙蒸水定容至100ML。
[0055]實施例4:所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，還包括步驟為:
[0056]步驟(1)至步驟(7 )與實施例1或實施例2相同。
[0057](8)染色:第一次使用5%醋酸鈾乙醇溶液40min染色,然后第二次使用鉛IOmin染色。
[0058]所使用的5%醋酸鈾乙醇溶液的配方:醋酸鈾5克；70%乙醇溶液IOOml。
[0059]所使用的鉛配方:硝酸鉛2.0克；醋酸鉛1.0克；枸櫞酸鈉3.5克；4%NaOH水溶液18ML ;雙蒸水定容至100ML。
[0060]實驗例1:一種河西絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法
[0061]I材料與方法
[0062]1.1樣品采集
[0063]實驗材料來自甘肅省天祝縣牧戶羊群，選取周歲的河西絨山羊6只，連續在一年中每個月的月初從體側部用剪刀剪取約Icm2的皮樣。皮膚切口處撒上青霉素或鏈霉素即可自愈。
[0064]1.2樣品的固定
[0065]①第一次固定
[0066]采取的Icm2的皮樣先快速的展平在事先準備好的玻璃片上，放入放有固定液(3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀釋液為0.2mol/L的磷酸緩沖液，PH為
7.2)的容器內，4°C，12h。
[0067]②第二次固定:從第一次固定好的皮樣上采取約Imm3的電鏡樣，固定于3%的戊二醛，4°C，5h。
[0068]3%戊二醛固定液配方(IOOml為例):
[0069]
0.2 M PBSOniI
25% 戊二醛12ml
蔗糖8g
超純水定荇個:1OOml
[0070]1.3樣品的制備
[0071]按照皮膚樣品特有的性質設計的方法。流程如下:
[0072]①固定好的電鏡樣用0.2mol/L的磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次(每次lOmin)。
[0073]②2%的鋨酸4°C固定3h。
[0074]③PBS漂洗3次(每次IOmin)。
[0075]④脫水:依次進行:
[0076]
50% 酒精:l5min
70% 酒精15min
80%酒精15 min
90% 酒精IOmin
[0077]
【權利要求】
1.一種絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，其特征在于包括有步驟為: (1)選取成年的絨山羊，從體側部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮樣； (2)樣品的固定: ①第一次固定:剪取0.8-1.2cm2的皮樣，展平在事先準備好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器內固定，2-4°C，6-12h ； ②第二次固定:從第一次固定好的皮樣上采取1-1.2mm3的電鏡樣，置于2.5_3%的第二次固定液中固定，2-4°C，5-6h ；(3)將步驟(2)固定好的皮樣用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10_15min ； (4)置入2%的鋨酸2-4°C，固定3-5h； (5)使用0.1-0.2mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10_15min ； (6)脫水:使用50%-100%酒精，脫水4-6次，每次10min-15min;使用100%丙酮脫水10-15min ;然后再次使用100%丙酮脫水10_15min ； (7)包埋:在按1:1純包埋劑和100%丙酮混合液中第一次浸透3-6h，然后在純包埋劑中浸透10-12h。
2.如權利要求1所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，其特征在于還包括步驟為: (8)染色:第一次使用5%醋酸鈾乙醇溶液30-40min染色,然后第二次使用鉛5_10min染色； 所使用的5%醋酸鈾乙醇溶液的配方:醋酸鈾5克;70%乙醇溶液100mL ； 所使用的鉛配方:硝酸鉛2.0克；醋酸鉛1.0克；枸櫞酸鈉3.5克；4%NaOH水溶液18ML ；雙蒸水定容至100ML。
3.如權利要求1所述的絨山羊皮膚用于透射電鏡觀察的超薄切片的制備方法，其特征在于所述的第一次固定液為3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀釋液為0.2mol/L的磷酸緩沖液，PH為7.2 ;第二次固定液為0.2M磷酸緩沖液50ml，25%戊二醛12ml,鹿糖8g,超純水定容至100ml。
4.如權利要求1所述的絨山羊皮膚用于電鏡觀察的超薄切片的制備方法，其特征在于所述的包埋劑為 20ML，其中 MNA7ml，SP1-PON8129.12ml, DDSA6.17ml, DMP-300.3ml。
【文檔編號】G01N1/28GK103900883SQ201410142418
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月10日 優先權日:2014年4月10日
【發明者】賀延玉, 劉秀, 程李香 申請人:甘肅農業大學