一種細胞爬片的制備方法

一種細胞爬片的制備方法
【專利摘要】一種細胞爬片的制備方法：根據需要剪裁爬片并消毒；將消毒后的爬片完全浸入培養液內，然后放入培養板內；用移液槍吸取細胞懸液，于培養板正上方處垂直地將細胞懸液一次完全打出，使細胞在沖力的作用下均勻分布在爬片上；培養板中加入固定液進行固定；免疫細胞化學染色。本發明為細胞爬片的制備及后續細胞免疫化學提供了一套良好、可靠的具體操作流程及關鍵技術改進方案。
【專利說明】一種細胞爬片的制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種細胞爬片的制備方法。
【背景技術】
[0002]細胞爬片技術是利用貼壁細胞在一定的固相表面(如蓋玻片)上貼壁生長的習性來進行體外實驗操作的一種技術。利用細胞爬片進行體外實驗時，可以排除體內諸多干擾因素的影響，方便地對細胞進行各種干預處理。因此，制備細胞爬片是體外細胞培養的一種重要技術。同時，細胞爬片的制備是免疫細胞化學、免疫熒光、TUNEL凋亡檢測等的第一步，也是能否成功獲得實驗結果的關鍵步驟。目前，隨著“3Rs”【即替代(replacement)、減少(reduction)和優化(refinement)實驗動物的使用】原則的倡導和實施以及研究工作的深入，體外細胞研究和檢測指標日益豐富，對細胞爬片的需求和質量要求越來越高。
[0003]目前文獻報導的細胞爬片制備方法，通常是把多個小蓋玻片直接置于培養皿底，加入細胞懸液進行培養。但關于制備細胞爬片的具體良好的操作流程及關鍵技術未見報導，致使科研人員在實際操作中需要對這一技術進行反復地摸索，質量難以控制。由于缺乏規范的流程參照，在制備細胞爬片時，常常出現接種細胞密度過大或過小的問題，導致細胞堆積重疊而無法在爬片上正常生長或密度太低無法進行后續檢測，甚至出現爬片上的細胞在后續處理中容易脫片等現象。這無疑極大地浪費了科研人員的精力和時間，同時也對科研資源造成浪費，極大地影響了細胞爬片在細胞免疫化學實驗中的應用。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種細胞爬片的制備方法，以改進公知技術中存在的缺陷。
[0005]為實現上述目的，本發明提供的細胞爬片的制備方法，其步驟為:
[0006]1)根據需要剪裁爬片，清洗和消毒后取出烤干備用；
[0007]2)將消毒后的爬片完全浸入培養液內，然后放入培養板內；
[0008]3)將細胞重懸于培養液中，細胞濃度為1.25~2X IO5個/ml ；
[0009]4)用移液槍吸取細胞懸液，于培養板正上方處垂直地將細胞懸液一次完全打出，使細胞在沖力的作用下均勻分布在爬片上；
[0010]5)待細胞種板后，細胞貼壁牢固時去掉上清液，加培養液繼續培養；
[0011]6)將培養板取出，棄去上清液，吸取磷酸鹽緩沖液(PBS)對細胞進行清洗，該清洗步驟可以重復進行；
[0012]7)培養板中加入固定液進行固定，固定條件是室溫30~50min,每隔IOmin輕輕搖晃培養板，使固定液與貼壁細胞充分接觸；
[0013]8)重復用PBS洗凈固定液后，加入PBS浸泡爬片并經常更換PBS，以避免環境因素對樣本的影響；
[0014]9)免疫細胞化學染色。[0015]所述細胞爬片的制備方法中，步驟I中爬片的清洗和消毒是:置于濃硫酸中浸泡，用水沖洗，再置于無水酒清中浸泡，之后用三蒸水沖洗，放在鋪有脫脂紗布的玻璃培養皿中烘干后進行高壓消毒。
[0016]所述細胞爬片的制備方法中，步驟2中的培養液是含血清的達爾伯克必需基本培養液(DMEM培養液)。
[0017]所述細胞爬片的制備方法中，步驟5中是指細胞貼壁牢固，生長面積達到培養孔的85%時去掉上清液，加不含血清的DMEM培養液繼續培養。
[0018]所述細胞爬片的制備方法中，步驟7中的固定液是4%多聚甲醛固定液。
[0019]所述細胞爬片的制備方法中，PBS的pH值為7.4。
[0020]本發明為細胞爬片的制備及后續細胞免疫化學提供了一套良好、可靠的具體操作流程及關鍵技術改進方案。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1A和圖1B是對按照公知技術制備的小鼠精原細胞GC-1spg爬片進行免疫化學染色，檢測細胞內FasL蛋白表達(1A，100X ;1B，400X)。
[0022]圖2A和圖2B是對依照實施例2制備的小鼠精原細胞GC-1spg爬片進行免疫化學染色，檢測細胞內FasL蛋白表達(2A，100X ;2B，400X)。【具體實施方式】
[0023]本發明的步驟包括:
[0024]一、爬片的準備
[0025]1、爬片可用一般的蓋玻片和專用爬片。
[0026]2、使用一般的蓋玻片時，根據自己的需要先將蓋玻片用小沙輪剪裁成直徑為20mm的圓形蓋玻片，以備置于12孔板。
[0027]3、將專用爬片或剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗15-20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，然后用三蒸水沖洗3遍，放在底部鋪有一層脫脂紗布的玻璃培養皿中烘干后進行高壓消毒。其中，清洗爬片時需要避免爬片因水流張力而重疊，可用眼科小鑷子輕輕夾住爬片的邊緣單獨沖洗干凈，這一環節對細胞牢固貼壁至
關重要。
[0028]4、高壓消毒后取出爬片放入烤箱中烤干，放入超凈臺中備用。
[0029]二、細胞爬片
[0030]1、先將無菌爬片完全浸入培養液內，然后用無菌小鑷子夾著放入12孔培養板內。由于浸過培養液的爬片依靠液體表面的張力可以使爬片與培養板孔底貼和緊密，防止添加細胞懸液時玻片漂起，利于細胞長到爬片上，避免了大部分細胞在爬片與培養板之間的空隙內生長而爬片上的細胞卻很稀少的現象。
[0031]2、用胰酶將細胞從培養瓶中消化下來，離心后將細胞重懸于2ml培養液中，計數細胞濃度。種板時細胞合適的濃度約為1.25?2X IO5個/ml左右，既能避免細胞增殖受限，使單個細胞在爬片上充分展開，又能保證細胞在種板24小時后完全貼壁且生長面積達到85%以上，有效防止了在后期操作中細胞從爬片上脫落。根據實際操作經驗，12孔板每孔接種的細胞懸液量為1ml。
[0032]3、用Iml移液槍吸取細胞懸液，于距離培養板底部約3?5cm正上方處垂直、快速地將細胞懸液一次完全打出，使細胞在沖力的作用下均勻分布在爬片上。按照傳統細胞種板方法，槍頭靠近孔底后再將細胞懸液打出，致使細胞密度不均一，大量細胞堆積。在實際操作中，即使采用十字交叉法搖勻，細胞仍然出現嚴重分布不均地現象，可能與孔徑較小有關。
[0033]4、待細胞種板24h后，細胞貼壁牢固，生長面積達到培養孔的85%時去掉上清液，加不含血清的DMEM培養液繼續培養。
[0034]三、細胞爬片的固定
[0035]1、提前一天配制4%多聚甲醛固定液:稱取4g多聚甲醛加入IOOml0.0lM PBS中溶解，65°C水浴磁力攪拌3h，待溶液完全澄清后放入4°C冷藏備用。
[0036]2、將培養板從培養箱取出后，用移液槍將上清液吸棄后，另吸取Iml預冷的PBS沿著孔壁緩慢打入，輕輕搖晃培養板10次后將PBS吸出，完成對細胞的第一次清洗，并重復2次，盡量將細胞碎片和細胞代謝產物洗凈，以免在后續的實驗中得到假陽性結果。
[0037]3、每孔加入lml4%多聚甲醛進行固定，室溫下孵育30?50min，每隔IOmin輕輕搖晃培養板，使固定液與貼壁細胞充分接觸。
[0038]4、同步驟2，用PBS將固定液洗凈，重復3次。洗凈后，加入2ml PBS浸泡已被固定的細胞，并每周換一次PBS，于4°C環境可保存半年。這種保存方法避免了環境因素對樣本的影響。
[0039]四、免疫細胞化學染色
[0040]1、取出爬片，37°C復溫。
[0041]2,0.0lM PBS (pH=7.4)浸泡洗 5min/ 次，共洗 3 次。
[0042]3、每張爬片加50 μ I的細胞通透劑曲拉通100，室溫下孵育15?35min。
[0043]4,0.0lM PBS (ρΗ7.4)浸泡洗 5min/ 次，共洗 3 次。
[0044]5、每張爬片加50 μ I正常非免疫血清，37°C孵育20min，吸去多余液體。
[0045]6、每張爬片加50 μ I的第一抗體，4°C孵育過夜或37°C lh。
[0046]7,0.0lM PBS 浸泡洗 5min/ 次，共洗 3 次。
[0047]8、每張爬片加50 μ I生物素標記的第二抗體，37°C孵育40?60min。
[0048]9,0.0lM PBS 浸泡洗 5min/ 次，共洗 3 次。
[0049]10、每張爬片加50 μ I辣根過氧化酶標記鏈親和素溶液(1:400倍稀釋)，37°C孵育40mino
[0050]11,0.0lM PBS 浸泡洗 5min/ 次，共洗 3 次。
[0051]12、每張爬片加100 μ I新鮮配制的二氨基苯聯胺(DAB)工作液，顯微鏡下觀察隨時終止反應。
[0052]13、自來水浸泡洗5min，蘇木素復染3_10min，自來水浸泡洗5min，晾干，中性樹膠封固。
[0053]14、采集圖片。
[0054]除了上面做的12孔細胞板外，本發明還做了 6孔板和24孔板的試驗，都收到了同樣的效果。6孔板和24孔板每孔接種的細胞懸液量分別為2ml和0.5ml，使其每孔中的細
胞密度基本一致。
[0055]依據上述細胞爬片的制備方法，對爬片的小鼠生精細胞進行免疫化學染色，觀測生精細胞凋亡相關膜蛋白(II型跨膜糖蛋白，FasL)的表達，進一步說明本發明，但本發明的權利要求不僅限于實施例。
[0056]實施例1:
[0057]首先將濕潤的12個無菌爬片用鑷子分別輕輕放入12孔培養板底部。然后取對數生長期的細胞，用預熱的0.25%的胰酶進行消化，將細胞吹打成單細胞懸液，將細胞密度調整為1.25 XlOVml左右，用Iml移液槍吸取Iml細胞懸液，于距離12孔板底部約3cm左右正上方垂直、快速地將細胞懸液一次完全打出，在37°C、5%C02培養箱中培養24h。次日細胞貼壁后，吸棄培養液，用PBS洗細胞一次，加入不含血清的DMEM培養液，每孔1ml。將12孔板置于37°C、5%C02培養箱中繼續培養24h后，將其從培養箱中拿出，棄去上清液，用預冷的PBS洗細胞3次后加入lml4%多聚甲醛固定30min，棄去固定液后再用預冷的PBS洗3次。
[0058]取出經過固定的爬片，37°C復溫。用0.01M PBS (pH=7.4)浸泡洗5min/次，重復三次。每張爬片加50 μ I的細胞通透劑曲拉通100，室溫下孵育15min，0.01M PBS (pH7.4)浸泡洗5min/次，重復3次。然后每張爬片加50 μ I正常非免疫血清，37°C孵育20min，吸去多余液體。每張爬片加50μ I第一抗體(FasL，l:25稀釋)，37°C孵育lh，用PBS洗三次，每張爬片加50 μ I生物素標記的第二抗體(1:200稀釋)，37°C孵育40min。PBS洗三次，每張爬片加50 μ I辣根過氧化酶標記鏈親和素溶液(1:400倍稀釋)，37°C孵育40min后用PBS洗三次，每張爬片加100 μ I新鮮配制的DAB工作液，顯微鏡下觀察隨時終止反應。自來水浸泡洗5min, 2%蘇木素復染3_10min,自來水浸泡洗5min,晾干，中性樹膠封固，在倒置顯微鏡下采集圖片。
[0059]結果顯示:細胞爬片緊貼在培養板底部，接種的細胞90%以上都在爬片上生長，且細胞均勻分布于爬片上 ，未出現細胞之間相互重疊的現象。在對細胞爬片進行免疫細胞化學染色處理時，細胞未出現脫片現象，細胞染色均勻、陽性結果明顯。
[0060]實施例2:
[0061]將濕潤的無菌爬片用鑷子輕放入12孔板底部，然后取對數生長期的細胞，用預熱的0.25%的胰酶進行消化，將細胞吹打成單細胞懸液，將細胞密度調整為1.5XlOVml左右，用Iml移液槍吸取Iml細胞懸液，于距離12孔板底部約4cm左右正上方垂直、快速地將細胞懸液一次完全打出，在37°C、5%C02培養箱中培養24h。次日細胞貼壁后，吸棄培養液，用PBS緩沖液沖洗細胞一次，加入不含血清的DMEM培養液，每孔Iml。將12孔板置于37°C、5%C02培養箱中繼續培養24h后，將其從培養箱中拿出，棄去上清液，用預冷的PBS洗細胞3次后加入lml4%多聚甲醛固定40min，棄去固定液后再用預冷的PBS洗3次。
[0062]取出經過固定的爬片，37°C復溫。用0.01M PBS (pH=7.4)浸泡洗5min/次，重復三次。每張爬片加50 μ I的細胞通透劑曲拉通100，室溫下孵育25min，0.01M PBS (pH7.4)浸泡洗5min/次，重復三次。然后每張爬片加50 μ I正常非免疫血清，37°C孵育20min，吸去多余液體。每張爬片加5(^1第一抗體^&1，1:25稀釋)，41:孵育過夜。第二天，用PBS洗三次，每張爬片加50 μ I生物素標記的第二抗體(1:200稀釋)，37°C孵育50min。PBS洗三次，每張爬片加50μ I辣根過氧化酶標記鏈親和素溶液(1:400倍稀釋)，37°C孵育40min后用PBS洗三次，每張爬片加100 μ I新鮮配制的DAB工作液，顯微鏡下觀察隨時終止反應。自來水浸泡洗5min，2%蘇木素復染3_10min，再用自來水浸泡洗5min，晾干，中性樹膠封固，在倒置顯微鏡下采集圖片如圖2A和圖2B所示。[0063]結果顯示:實施例2的結果基本同實施例1。
[0064]圖1A和圖1B是對按照公知技術制備的小鼠精原細胞GC-1spg爬片進行免疫化學染色，檢測細胞內FasL蛋白的表達(1A，100X ;1B，400X)。
[0065]圖2A和圖2B是對依照實施例2制備的小鼠精原細胞GC-1spg爬片進行免疫化學染色，檢測細胞內FasL蛋白表達(2A，100X ;2B，400X)。由圖可以看出，公知技術的爬片中，細胞呈現脫片、重疊和分布不均勻的現象；而本發明的爬片中，細胞貼壁較牢固，沒有出現脫片和重疊的現象，而且分布較均勻。
[0066]圖中:
[0067]—指不FasL蛋白表達陽性細胞,呈掠揭色。
[0068]▲指示細胞脫片。
[0069]--指示細胞密度不均勻。
[0070]_指示細胞重疊。
[0071]□指示被原位 放大400倍處。
[0072]實施例3:
[0073]將濕潤的無菌爬片用鑷子輕放入12孔板底部，然后取對數生長期的細胞，用預熱的0.25%的胰酶進行消化，將細胞吹打成單細胞懸液，將細胞密度調整為2.0XlOVml左右，用Iml移液槍吸取Iml細胞懸液，于距離12孔板底部約5cm左右正上方垂直、快速地將細胞懸液一次完全打出，在37°C、5%C02培養箱中培養24h。次日細胞貼壁后，吸棄培養液，用PBS洗細胞一次，加入不含血清的DMEM培養液，每孔Iml。將12孔板置于37°C、5%C02培養箱中繼續培養24h后，將其從培養箱中拿出，棄去上清液，用預冷的PBS洗細胞3次后加入lml4%多聚甲醛固定50min，棄去固定液后再用預冷的PBS洗3次。
[0074]取出經過固定的爬片，37 °C復溫。用0.01M PBS (pH=7.4)浸泡洗5min/次，重復3次。然后每張爬片加50 μ I的細胞通透劑曲拉通100，室溫下孵育35min，0.01M PBS(pH7.4)浸泡洗5min/次，共洗3次。之后每張爬片加50 μ I正常非免疫血清，37°C孵育20min，吸去多余液體。每張爬片加5(^1第一抗體^&1，1:25稀釋)，41:孵育過夜。第二天，用PBS洗三次，每張爬片加50μ I生物素標記的第二抗體(1:200稀釋)，371:孵育601^11。PBS洗三次，每張爬片加50 μ I辣根過氧化酶標記鏈親和素溶液(1:400倍稀釋)，37°C孵育40min后再用PBS洗三次，每張爬片加100 μ I新鮮配制的DAB工作液，顯微鏡下觀察隨時終止反應。自來水浸泡洗5min，2%蘇木素復染3_10min，自來水浸泡洗5min，晾干，中性樹膠封固，在倒置顯微鏡下采集圖片。
[0075]結果顯示:實施例3的結果基本同實施例1。
【權利要求】
1.一種細胞爬片的制備方法，其步驟為: 1)根據需要剪裁爬片，清洗和消毒后取出烤干備用； 2)將消毒后的爬片完全浸入培養液內，然后放入培養板內； 3)將細胞重懸于培養基中，細胞濃度為1.25?2X IO5個/ml ； 4)用移液槍吸取細胞懸液，于培養板正上方處垂直地將細胞懸液一次完全打出，使細胞在沖力的作用下均勻分布在爬片上； 5)待細胞種板后,細胞貼壁牢固時去掉上清液,加培養液繼續培養； 6)將培養板取出，棄去上清液，吸取磷酸鹽緩沖液對細胞進行清洗； 7)培養板中加入固定液進行固定，固定條件是室溫下30?50min,每隔IOmin輕輕搖晃培養板，使固定液與貼壁細胞充分接觸； 8)重復用磷酸鹽緩沖液洗凈固定液，加入磷酸鹽緩沖液浸泡并經常更換磷酸鹽緩沖液，以避免環境因素對樣本的影響； 9)免疫細胞化學染色。
2.根據權利要求1所述細胞爬片的制備方法，其中，步驟I中爬片的清洗和消毒是:置于濃硫酸中浸泡，用水沖洗，再置于無水酒清中浸泡，之后用三蒸水沖洗多次，放在鋪有脫脂紗布的玻璃培養皿中烘干后進行聞壓消毒。
3.根據權利要求1所述細胞爬片的制備方法，其中，步驟2中的培養液是含血清的達爾伯克必需基本培養液。
4.根據權利要求1所述細胞爬片的制備方法，其中，步驟5中是指細胞貼壁牢固，生長面積達到培養孔的85%時去掉上清液，加不含血清的達爾伯克必需基本培養液繼續培養。
5.根據權利要求1所述細胞爬片的制備方法，其中，步驟6中是重復吸取磷酸鹽緩沖液對細胞進行清洗。
6.根據權利要求1所述細胞爬片的制備方法，其中，步驟7中的固定液是4%多聚甲醛固定液。
7.根據權利要求1所述細胞爬片的制備方法，其中，磷酸鹽緩沖液的PH值為7.4。
【文檔編號】G01N1/28GK103926121SQ201410141763
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月10日 優先權日:2014年4月10日
【發明者】周顯青, 徐英, 郭芳子, 李艷博, 孫志偉 申請人:首都醫科大學