一種動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞膜電位的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞膜電位的方法，包括如下步驟：1）將從已獲得的人體臍帶靜脈血中分離出來的細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)；2）將培養(yǎng)后的細(xì)胞注入到微流室中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)；3）利用微注射泵在微流室中進(jìn)行精確的流量控制；4）利用微流室內(nèi)的氮化鎵（GaN）高電子遷移率晶體管（HEMT）器件測(cè)量流體表面的粘滯度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞膜電位。在使用本發(fā)明測(cè)量細(xì)胞膜電位的過程中，將作為生物傳感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、儲(chǔ)液瓶相連，在微注射泵提供動(dòng)態(tài)流體環(huán)境的前提下，通過HEMT器件實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流體環(huán)境下的活體多細(xì)胞膜電位。
【專利說明】一種動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞膜電位的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞膜電位的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人體體液流動(dòng)會(huì)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生剪應(yīng)力，進(jìn)而引起細(xì)胞電位的變化。剪切力能影響人體內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性的許多方面，與多種心血管疾病相關(guān)。因此，檢測(cè)細(xì)胞膜電位是否變化具有重要的生理學(xué)和病理學(xué)研究意義。
[0003]目前，測(cè)量剪切力下的細(xì)胞膜電位的方法主要包括熒光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法。
[0004]熒光染料法是利用熒光強(qiáng)度在剪切力作用下會(huì)發(fā)生改變，并且與膜片鉗得到的細(xì)胞膜電位變化趨勢(shì)相同的性質(zhì)，來測(cè)量細(xì)胞膜電位的一種方法。但這種方法反應(yīng)時(shí)間和精度都有較大差距，且目前無法證明熒光強(qiáng)度能夠代替細(xì)胞膜電位表征細(xì)胞的電生理現(xiàn)象。
[0005]微電極陣列法采用集成電路硅工藝，通過微電極陣列能夠表征大體積的單個(gè)肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)作電位。但這種方法存在測(cè)量準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)量準(zhǔn)確度和靈敏度低的缺點(diǎn)。
[0006]膜片鉗方法是目前最常用的方法，它是通過玻璃微電極測(cè)量單細(xì)胞的膜內(nèi)外的電壓或電流差，并通過一定的放大和轉(zhuǎn)換，得到細(xì)胞膜電位。但是這種技術(shù)具有以下先天性不足:生物組織是由大量細(xì)胞緊密排列形成的，而膜片鉗只能測(cè)量單細(xì)胞，并不能表征實(shí)際的多細(xì)胞膜電位對(duì)剪切力的響應(yīng)情況；測(cè)量時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞膜，改變細(xì)胞的特性，短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞將死亡，這樣就限制了對(duì)細(xì)胞膜動(dòng)作電位以及離子通道早期發(fā)生現(xiàn)象的研究；在流體環(huán)境下測(cè)試時(shí)，由于剪切力的存在，細(xì)胞容易從膜片鉗脫落；膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個(gè)細(xì)胞(或一對(duì)細(xì)胞)，每天只能獲得的數(shù)據(jù)量?jī)H為幾到幾十個(gè)，耗時(shí)耗力。
[0007]綜上所述，熒光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法均無法解決活體多細(xì)胞膜電位的測(cè)量問題，來準(zhǔn)確表征剪切力對(duì)細(xì)胞膜電位的影響。
[0008]因此，需要一種具有檢測(cè)快速、靈敏度高、實(shí)時(shí)測(cè)量、結(jié)果準(zhǔn)確、生物兼容性高、多細(xì)胞活體測(cè)量等多重優(yōu)點(diǎn)的方法，來進(jìn)行細(xì)胞膜電位的測(cè)量。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]因此，為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題而完成了本發(fā)明，本發(fā)明的目的之一在于提供一種實(shí)時(shí)的準(zhǔn)確測(cè)量剪切力影響的活體多細(xì)胞膜電位的方法，該方法使用了氮化鎵(GaN)高電子遷移率晶體管(HEMT)、微流室技術(shù)和微注射泵技術(shù)，將從人體臍帶靜脈血中分離出來的細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，然后注入到微流室中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，最后利用微注射泵在微流室中進(jìn)行精確的流量控制，用微流室內(nèi)的HEMT器件測(cè)量流體表面的粘滯度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞膜電位，實(shí)現(xiàn)了一種動(dòng)態(tài)模擬多細(xì)胞環(huán)境并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流體環(huán)境下的活體多細(xì)胞膜電位的方法。
[0010]在使用本發(fā)明測(cè)量細(xì)胞膜電位的過程中，將作為生物傳感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、儲(chǔ)液瓶相連，在微注射泵提供動(dòng)態(tài)流體環(huán)境的前提下，通過HEMT器件實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流體環(huán)境下的活體多細(xì)胞膜電位。
[0011]本發(fā)明中應(yīng)用于生物傳感器的HEMT器件的結(jié)構(gòu)為:底層為藍(lán)寶石材料，底層向上依次為1.6 μ m左右的GaN緩沖層，1.2nm AlN插入層，8?15nm左右的AlGaN勢(shì)壘層和
1.5nm GaN帽層，勢(shì)壘層鋁組分在25%?40%之間。帽層以上為Si3N4鈍化層，鈍化層中間被蝕刻出一塊長(zhǎng)方形槽狀的裸柵區(qū)域，裸柵區(qū)域無電極弓I出，尺寸在10 μ m?IOmm范圍內(nèi)。
[0012]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知或容易想到的上述HEMT器件的藍(lán)寶石襯底也可采用其他具有相似功能的材料，如碳化硅(SiC)材料。
[0013]本發(fā)明中HEMT器件的制造工藝為:
[0014](I)臺(tái)面刻蝕，采用ICP方法刻蝕異質(zhì)結(jié)材料形成器件的臺(tái)面隔離；
[0015](2)淀積源漏極歐姆金屬，采用電子束蒸發(fā)的方法獲得歐姆金屬層，歐姆金屬采用Ti/Al/Ni/Au四層結(jié)構(gòu)，并在830°C下退火形成合金，獲得良好的源漏極歐姆接觸；
[0016](3)采用PECVD方法淀積Si3N4材料作為鈍化層；
[0017](4)光刻并采用ICP方法刻蝕Si3N4，露出裸柵區(qū)域。
[0018]本發(fā)明中微流室的結(jié)構(gòu)為:在HEMT器件上方覆蓋了用高分子聚合材料制造的與裸柵相同的槽狀圖形，槽內(nèi)安裝微流室。微流室材料選用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)材料，除此以外,還可采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),聚酰亞胺(polyimide)等材料。微流室反應(yīng)室尺寸設(shè)計(jì)與器件柵極圖形保持一致。微流室兩側(cè)有封接口，作為液體流動(dòng)和細(xì)胞注入之用。微流室用于培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)完成后連接微注射泵，以提供精確的流量控制。微流室兩端有兩個(gè)直徑在0.1mm?0.5mm左右的小孔，能夠與外部相連。微流室部件與HEMT器件封接，得到一個(gè)密閉的通道，溶液能夠在通道中流動(dòng)，形成流體動(dòng)力學(xué)下的細(xì)胞膜電位檢測(cè)裝置。
[0019]本發(fā)明中微流室的制作工藝為:先采用光刻的方法或反應(yīng)離子刻蝕(RIE)的方法制造出微流室凸突的陽模，然后在陽模上澆鑄PDMS，在約50 V溫度下固化后使PDMS從陽模上剝離，即可制得微流室部件。微流室兩端的小孔采用鉆孔法或其他方法得到。微流室部件與HEMT芯片封接工藝采用熱壓法或粘合法等方法。
[0020]本發(fā)明中活體細(xì)胞的分離方法為:在無菌條件下，向已獲取的新鮮的人體臍帶靜脈血中加入lg/L膠原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1) (V/V)的混合液15mL，置于37°C水浴箱中孵育8min，將消化液收集入離心管，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗臍靜脈2次，將沖洗液一同收集入離心管，1000r/min離心lOmin，取上清液，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，取0.1mL細(xì)胞懸液用4g/L臺(tái)盼藍(lán)染色后作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。將2X 104/L細(xì)胞接種到24孔板中，每孔加入完全培養(yǎng)液lmL，置于37°C、950mL/L 02、50mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，并采用臺(tái)盼藍(lán)排斥法，將0.1mL混勻的內(nèi)皮細(xì)胞懸液與4g/L臺(tái)盼藍(lán)0.9mL混勻后，取I滴在顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞懸液中細(xì)胞存活率大于95%時(shí)，可用于進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。
[0021]本發(fā)明中活體細(xì)胞的培養(yǎng)方法為:用酒精對(duì)HEMT器件消毒后，使用纖連蛋白溶液(fibronectin)進(jìn)行處理30min,以增強(qiáng)細(xì)胞的附著度。并使用PBS沖洗,并接種細(xì)胞,使細(xì)胞密度達(dá)到5000?12000cells/mm2，并保證細(xì)胞全程置于含5%C02的37°C恒溫箱中。
[0022]本發(fā)明中裝置的使用方法為:采用微注射泵與細(xì)胞膜電位檢測(cè)裝置連接形成血液動(dòng)力系統(tǒng)，該系統(tǒng)架設(shè)在37°C恒溫箱中維持溫度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中使用PBS作為流體，并且實(shí)驗(yàn)全程通入含5%C02的空氣以保持流體環(huán)境的酸堿度。
[0023]本發(fā)明中器件裸柵上培養(yǎng)的細(xì)胞受到的剪切力由以下公式推導(dǎo):
【權(quán)利要求】
1.一種動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞膜電位的方法，所述方法包括如下步驟: 1)將從已獲得的人體臍帶靜脈血中分離出來的細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)； 2)將所述培養(yǎng)后的細(xì)胞注入到微流室中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)； 3)利用微注射泵在微流室中進(jìn)行精確的流量控制； 4)利用所述微流室內(nèi)的氮化鎵(GaN)高電子遷移率晶體管(HEMT)器件測(cè)量流體表面的粘滯度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞膜電位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，需要將所述微流室、微注射泵和儲(chǔ)液瓶依次連接，構(gòu)成一個(gè)封閉的循環(huán)系統(tǒng)；所述微流室作為液體流動(dòng)和細(xì)胞注入之用，所述微流室內(nèi)的液體通過所述微注射泵傳輸給所述儲(chǔ)液瓶，所述作為生物傳感器的HEMT器件與所述微流室耦合，用于檢測(cè)所述微流室內(nèi)細(xì)胞在動(dòng)態(tài)條件下的實(shí)時(shí)細(xì)胞膜電位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的從已獲得的人體臍帶靜脈血中分離細(xì)胞的方法為: 1)在無菌條件下，將已獲得的新鮮的人體臍帶靜脈血加入lg/L膠原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1) (V/V)的混合液15mL，置于37°C水浴箱中孵育8min ； 2)將步驟I)得到的液體收集入離心管，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗臍靜脈2次，將沖洗后的液體一同收集入離 心管，1000r/min離心10min，取上清液，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞； 3)取0.1mL細(xì)胞懸液用4g/L臺(tái)盼藍(lán)染色后作活細(xì)胞計(jì)數(shù)； 4)將2X104/L細(xì)胞接種到24孔板中，每孔加入完全培養(yǎng)液lmL，置于37°C、950mL/L02、50mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，并采用臺(tái)盼藍(lán)排斥法，將0.1mL混勻的內(nèi)皮細(xì)胞懸液與4g/L臺(tái)盼藍(lán)0.9mL混勻后，取I滴在顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的將已分離活體細(xì)胞注入到微流室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)的方法為:用酒精對(duì)HEMT器件消毒后，使用纖連蛋白溶液(fitoonectin)進(jìn)行處理30min，并使用PBS沖洗，然后接種細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到5000~12000cells/mm2，并保證細(xì)胞全程置于含5%C02的37°C恒溫箱中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的利用微注射泵在微流室中進(jìn)行精確的流量控制的方法為:采用微注射泵與細(xì)胞膜電位檢測(cè)裝置連接形成血液動(dòng)力系統(tǒng)，該系統(tǒng)架設(shè)在37°C恒溫箱中維持溫度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中使用PBS作為流體，并且實(shí)驗(yàn)全程通入含5%C02的空氣以保持流體環(huán)境的酸堿度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的用微流室內(nèi)的HEMT器件測(cè)量流體表面的粘滯度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞膜電位的方法為: 1)器件裸柵上培養(yǎng)的細(xì)胞受到的剪切力由以下公式推導(dǎo):
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)量細(xì)胞膜電位的方法，所述預(yù)先測(cè)量為:對(duì)在同一晶圓上、且采用相同版圖的常規(guī)三端HEMT器件，加相同漏源電壓VDS，測(cè)試其轉(zhuǎn)移曲線(VG-1D)，得到柵電壓在_70mV~OV處對(duì)應(yīng)的器件跨導(dǎo)值。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK103954659SQ201410134171
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】張鵬, 黃辰, 張毅奕, 馬曉華, 郝躍 申請(qǐng)人:西安電子科技大學(xué)