一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，利用大腸菌群在37℃可以發酵乳糖產酸、產氣特性，以自制培養基為主，其中添加指示劑溴甲酚紫和TTC溶液，大腸菌群發酵培養后不僅能生產紅色沉淀，而且可使培養液發生了由紫色變為黃色的顏色變化，利用該發酵液顏色的變化程度與溶液中所含大腸菌群數量成正相關的特性，可得出待檢樣品液中大腸菌群的含量。本發明方法相比于現行國標方法，在檢測時間上有了大幅縮減，在加樣后培養60min-400min即可檢測樣品中的大腸菌群數值，試用范圍較廣，滿足了眾多檢測領域要求檢測時間短的需求，在未來快速檢測領域會有較好的應用前景。
【專利說明】一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測【技術領域】，涉及大腸菌群的檢測，尤其是一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法及應用。
【背景技術】
[0002]大腸菌群是指在37°C下能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，主要來源于人畜糞便。大腸菌群在樣品中的含量是檢驗食品衛生安全的重要指標。目前常用的檢測方法有傳統發酵法、紙片快速法、濾膜法、酶底物法、聚合酶鏈式法、熒光原位雜交法，但這些已知檢測方法檢測時間仍需24h-72h不等，對于工業廢水、食品等生產檢測而言，大腸菌群檢測周期較長，導致大量樣品滯留無法及時處理。為了解決已有方法的不足，縮短檢測時間，提高水質檢測、食品生產中檢驗的工作效率，探尋大腸菌群的快速檢測方法是十分必要的。
[0003]目前，現有技術中大腸菌群檢測技術例如濾膜法、酶底物法，分子生物學檢測法存在成本較高、操作較為繁瑣的缺陷；另外，目前紙片法也是大部分領域檢測較為常用的方法，但紙片培養基存在需低溫保存的缺點，不適宜野外作業。
[0004]通過檢索，發現一篇與本發明專利申請相關的如下專利公開文獻:
[0005]一種大腸菌群的快速檢測方法(CN101914609A)，本發明涉及一種大腸菌群的快速檢測方法。利用大腸菌群細胞在短時間培養過程中會產氣，可以發酵乳糖產酸，使大腸菌群細胞與伊紅美蘭結合，而使伊紅美蘭混合培養溶液生成的紫黑色或紫紅色沉淀，通過生物顯微鏡鏡檢計數，將紫黑色或紫紅色沉淀細菌經過革蘭氏染色呈現陰性的細菌的圖像個數，來計數大腸菌群數量的大腸菌群快速檢測方法；或者由于伊紅美蘭混合培養溶液生成的紫黑色或紫紅色的沉淀，而使伊紅美蘭混合培養溶液顏色變化，利用伊紅美蘭混合培養溶液顏色變化的程度與大腸菌群細胞數量相關的特性，識別大腸菌群細胞數的大腸菌群快速檢測方法，本發明方法適合生物學界、醫藥界、食品界以及各種物品中大腸菌群的快速檢測。
[0006]經過對比，本發明與上述專利公開文件存在的區別在于培養基成分不同，液體培養基成分經過改良以縮短培養時間，變色原因不同，檢測特殊納米值不同，因此標曲不同，而且是國標承認紙片法所用指示劑成分(含溴甲酚紫和TTC)第一次用于液體培養基后分光光度法來檢測，因此本發明專利申請與上述專利公開文件存在本質的不同。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種方法簡單、可快速檢測樣品中的大腸菌群數量的分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，該方法可以應用于水質監測、生物、食品、衛生方面的大腸菌群的快速檢測。
[0008]為了實現上述目的，本發明所采用的的技術方案如下:
[0009]一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，步驟如下:[0010]⑴溶液配制:
[0011]乳糖發酵檢測培養液:50-90 μ L2% (質量濃度)溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸鈉、0.0lg脫氧膽酸鈉、IOOmL蒸懼水，pH6.8-7.2，115°C，15min 滅菌后待用；
[0012]TTC溶液:TTC加入無菌水制成0.5-3% (質量濃度)溶液，避光保存、待用；
[0013]⑵檢測過程:
[0014]①樣品勻液的制備:
[0015]無菌操作取待檢樣品，8000r/min?10000r/min均質Imin?2min,制成體積比為1:10的樣品勻液，或質量:體積(g:L)為1:10的樣品勻液；
[0016]或者，如果液體待檢樣品檢出限< 10cfu/mL時，直接用原液進行檢測；
[0017]②過濾:
[0018]用中速定量濾紙過濾樣品勻液，得濾液；按濾液:濃縮的待檢液的體積比為5-10:I的比例用膜過濾器過濾濾液，得濃縮的待檢液；取濃縮的待檢液按體積比為1:5-10的比例加入含有乳糖發酵檢測培養液中，同時，按濃縮的待檢液=TTC溶液的體積比mL: μ L為I:30-80的比例取TTC溶液到乳糖發酵檢測培養液中，置于37°C培養；
[0019]③標準曲線的繪制:
[0020]培養60_400min后，檢測培養基中有顏色變化并伴有紅色沉底物質生產，取檢測管中的培養液，經離心處理發酵液，5000-7000r/min離心，離心2min_5min，取上清液置于石英比色皿中用分光光度計進行檢測，測量360nm—500nm特殊納米處的吸光值,建立不同含量大腸菌群混合培養液顏色和大腸菌群含量之間的對應線性關系，繪制標準曲線；
[0021]④待檢樣品的檢測:
[0022]檢測樣品時，按步驟①-③的方法進行處理和培養待檢樣品，培養液有變色和沉淀現象，按前述步驟將培養液離心后，取上清液在360nm—500nm處測定吸光值,記錄數據，與③中標準曲線進行比對，根據對比結果確定未知樣品中所含大腸菌群數，最終得出待檢樣品中所含大腸菌群數值。
[0023]而且，所述步驟⑵③中標準曲線的的回歸方程為:
[0024]IgY= 14.89X-1.33
[0025]R2=0.991
[0026]公式中:Y:未知樣品中大腸菌群的預計含量
[0027]X: 360nm一 500nm 處的 OD 值
[0028]R:相關系數。
[0029]如上所述的分光光度法快速檢測大腸菌群的方法在水質監測、生物、食品、衛生方面的大腸菌群的快速檢測方面中的應用。
[0030]本發明的優點和積極效果是:
[0031]1、本發明方法相比于現行國標方法，在檢測時間上有了大幅縮減，在加樣后培養60min-400min即可檢測樣品中的大腸菌群數值，試用范圍較廣，滿足了眾多檢測領域要求檢測時間短的需求，在未來快速檢測領域會有較好的應用前景。
[0032]2、本發明方法操作較為簡便，培養基成本較低，不需低溫保存，使用方便。【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為本發明的大腸菌群含量對數值和吸光度的關系圖。
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例，對本發明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
[0035]本發明中所使用的方法，如無特殊說明，均為本領域的常規方法；本發明中所使用的試劑，如無特殊說明，均為本領域的常規試劑；本發明中的各原料百分數含量如無特殊規定，均為質量體積比。
[0036]本發明的整體思路及檢測原理如下:
[0037]本發明利用大腸菌群在37°C可以發酵乳糖產酸、產氣特性，以自制培養基為主，其中添加指示劑溴甲酚紫和TTC (無色氯化三苯四氮唑)溶液，以溴甲酚紫和TTC作為指示劑，將溴甲酚紫和TTC加入乳糖發酵培養基中，配制成混合培養液，利用大腸菌群發酵乳糖產酸可以使得溴甲酚紫變黃，同時，由于甲酸脫氫酶的作用，會使得甲酸分解產生CO2和4，這個過程中脫掉的氫和TTC反應生產紅色的沉淀TTF (三苯甲臜)，因此，檢測試管中培養液會變黃并伴有紅色沉淀生成，反應結束后，離心取上清液，用分光光度計在特定納米處進行測量，采集數據后，根據不同濃度大腸菌群含量造成的培養液顏色變化程度建立標準曲線，此后未知大腸菌群含量的待檢樣品根據標準曲線推算大腸菌群含量。本發明方法適用于水質監測、生物、衛生、食品等中大腸菌群的快速檢測、分析。
[0038]本發明中所使用的乳糖發酵檢測培養液的配制如下:
[0039]50-90 μ L2% (質量濃度)的溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD_甘露醇、0.75gNaCl、0.02g 十二醇硫酸鈉、0.0lg 脫氧膽酸鈉、IOOmL 蒸餾水，ρΗ6.8-7.2，115。。，15min滅囷后待用；
[0040]本發明中所使用的TTC溶液的配制如下:
[0041]TTC加入無菌水制成0.5-3% (質量濃度)溶液，避光保存、待用。
[0042]實施例1
[0043]一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，步驟如下:
[0044]( I)溶液配制:
[0045]乳糖發酵檢測培養液:50μ L2%(質量濃度)溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸鈉、0.0lg脫氧膽酸鈉、IOOmL蒸懼水，pH6.8,115°C，15min滅菌后待用；
[0046]TTC溶液:TTC加入無菌水制成3% (質量濃度)溶液，避光保存、待用。
[0047](2)檢測過程:
[0048]①樣品勻液的制備:
[0049]無菌操作取待檢樣品25g或25mL，裝入含225mL無菌生理鹽水的三角瓶中(內置若干玻璃珠),8000r/min?10000r/min均質Imin?2min,制成體積比1:10的樣品勻液(若液體待檢樣品檢出限較低10cfu/mL)時，也可直接用原液進行檢測)；
[0050]②過濾:
[0051]用中速定量濾紙過濾樣品勻液，反復沖洗一次，取5mL濾液用膜過濾器濃縮出ImL菌液，取濃縮的待檢液加入含有9mL乳糖發酵檢測培養液的檢測試管中，同時，用移液器移取30 μ LTTC溶液到乳糖檢測試管中，置于37°C培養，培養360min ；
[0052]③待檢樣品的檢測:
[0053]用已知大腸菌群含量的樣品制作標準曲線。檢測樣品時，按步驟①-②的方法進行處理和培養待檢樣品，培養液有變色和沉淀現象，按前述步驟取檢測管中的培養液，經離心處理發酵液,7000r/min離心,離心5min,取上清液在360nm—500nm處測定吸光值,記錄數據，與標準曲線進行比對，根據對比結果確定未知樣品中所含大腸菌群數，最終得出未知樣品中所含大腸菌群數值。
[0054]實施例2
[0055]一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，步驟如下:
[0056]( I)溶液配制:
[0057]乳糖發酵檢測培養液:90μ L2%(質量濃度)溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸鈉、0.0lg脫氧膽酸鈉、IOOmL蒸餾水，pH7.2，115°C，15min滅菌后待用；
[0058]TTC溶液:TTC加入無菌水制成1.5% (質量濃度)溶液，避光保存、待用。
[0059](2)檢測過程:
[0060]①樣品勻液的制備:
[0061]無菌操作取待檢樣品25g或25mL，裝入含225mL無菌生理鹽水的三角瓶中(內置若干玻璃珠),8000r/min?10000r/min均質Imin?2min,制成體積比1:10的樣品勻液(若液體待檢樣品檢出限較低< lOcfu/mL時，也可直接用原液進行檢測)；
[0062]②過濾:
[0063]用中速定量濾紙過濾樣品勻液，反復沖洗一次，取9mL濾液用膜過濾器濃縮出ImL菌液，取濃縮的待檢液加入含有9mL乳糖發酵檢測培養液的檢測試管中，同時，用移液器移取80 μ LTTC溶液到乳糖檢測試管中，置于37°C培養，培養300min ；
[0064]③待檢樣品的檢測:
[0065]用已知大腸菌群含量的樣品制作標準曲線。檢測樣品時，按步驟①-②的方法進行處理和培養待檢樣品，培養液有變色和沉淀現象，按前述步驟取檢測管中的培養液，經離心處理發酵液,7000r/min離心，離心5min,,取上清液在360nm—500nm處測定吸光值,記錄數據，與標準曲線進行比對，根據對比結果確定未知樣品中所含大腸菌群數，最終得出未知樣品中所含大腸菌群數值。
[0066]實施例3
[0067]一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，步驟如下:
[0068]( I)溶液配制:
[0069]乳糖發酵檢測培養液:60μ L2%(質量濃度)溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、
0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸鈉、0.0lg脫氧膽酸鈉、IOOmL蒸懼水，pH6.9,115°C，15min滅菌后待用；
[0070]TTC溶液:TTC加入無菌水制成2% (質量濃度)溶液，避光保存、待用。
[0071](3)檢測過程:
[0072]①樣品勻液的制備:[0073]無菌操作取待檢樣品25g或25mL，裝入含225mL無菌生理鹽水的三角瓶中(內置若干玻璃珠),8000r/min?10000r/min均質Imin?2min,制成體積比1:10的樣品勻液(若液體待檢樣品檢出限較低< lOcfu/mL時，也可直接用原液進行檢測)；
[0074]②過濾:
[0075]用中速定量濾紙過濾樣品勻液，反復沖洗一次，取IOmL濾液用膜過濾器濃縮出ImL菌液，取濃縮的待檢液加入含有9mL乳糖發酵檢測培養液的檢測試管中，同時，用移液器移取50 μ LTTC溶液到乳糖檢測試管中，置于37°C培養，培養300min ；
[0076]③待檢樣品的檢測:
[0077]用已知大腸菌群含量的樣品制作標準曲線。檢測樣品時，按步驟①-②的方法進行處理和培養待檢樣品，培養液有變色和沉淀現象，按前述步驟取檢測管中的培養液，經離心處理發酵液,7000r/min離心,離心5min,取上清液在360nm—500nm處測定吸光值,記錄數據，與標準曲線進行比對，根據對比結果確定未知樣品中所含大腸菌群數，最終得出未知樣品中所含大腸菌群數值。
[0078]本發明中標準曲線的制作方法步驟如下:
[0079]標準曲線的繪制:
[0080]用已知大腸菌群含量的樣品加入乳糖發酵檢測培養液的檢測試管中，培養60-400min后，檢測培養基中有顏色變化并伴有紅色沉底物質生產，取檢測管中的培養液，經離心處理發酵液，5000-7000r/min離心,離心2min-5min,取上清液置于石英比色皿中用分光光度計進行檢測，測量360nm — 500nm特殊納米處的吸光值(即OD值)，建立不同含量大腸菌群混合培養液顏色和大腸菌群含量之間的對應線性關系，繪制標準曲線。
[0081]本發明的三個實施例的檢測結果取平均值后繪制的標準曲線，結果如圖1所示，從圖中可以看出:
[0082]標準分光光度值的回歸方程為:
[0083]IgY= 14.89X-1.33
[0084]R2=0.991
[0085]公式中:Y:未知樣品中大腸菌群的預計含量
[0086]X: 360nm一 500nm 處的 OD 值
[0087]R:相關系數。
[0088]本發明分光光度法快速檢測大腸菌群的方法的相關檢測結果:
[0089]使用本發明檢測方法對無公害雞蛋中的大腸菌群、非發酵性豆制品中的大腸菌群和餅干中的大腸菌群進行檢測，檢測結果見表1、表2、表3。
[0090]表I無公害雞蛋中大腸菌群檢測結果
[0091]
【權利要求】
1.一種分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，其特征在于:步驟如下: ⑴溶液配制: 乳糖發酵檢測培養液:50-90 μ L2% (質量濃度)溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸鈉、0.01g脫氧膽酸鈉、IOOmL蒸懼水，pH6.8-7.2，115°C，15min 滅菌后待用； TTC溶液:TTC加入無菌水制成0.5-3% (質量濃度)溶液，避光保存、待用； ⑵檢測過程: ①樣品勻液的制備: 無菌操作取待檢樣品，8000r/min~10000r/min均質Imin~2min,制成體積比為1:10的樣品勻液，或質量:體積(g:L)為1:10的樣品勻液； 或者，如果液體待檢樣品檢出限< lOcfu/mL時，直接用原液進行檢測； ②過濾: 用中速定量濾紙過濾樣品勻液，得濾液；按濾液:濃縮的待檢液的體積比為5-10:1的比例用膜過濾器過濾濾液，得濃縮的待檢液；取濃縮的待檢液按體積比為1:5-10的比例加入含有乳糖發酵檢測培養液中，同時，按濃縮的待檢液=TTC溶液的體積比mL: μ L為1:30-80的比例取TTC溶液到乳糖發酵檢測培養液中，置于37°C培養； ③標準曲線的繪制: 培養60-400min后，檢測培養基中有顏色變化并伴有紅色沉底物質生產，取檢測管中的培養液，經離心處理發酵液，5000-7000r/min離心，離心2min_5min，取上清液置于石英比色皿中用分光光度計進行檢測，測量360nm — 500nm特殊納米處的吸光值，建立不同含量大腸菌群混合培養液顏色和大腸菌群含量之間的對應線性關系，繪制標準曲線； ④待檢樣品的檢測: 檢測樣品時，按步驟①-③的方法進行處理和培養待檢樣品，培養液有變色和沉淀現象，按前述步驟將培養液離心后，取上清液在360nm — 500nm處測定吸光值，記錄數據，與③中標準曲線進行比對，根據對比結果確定未知樣品中所含大腸菌群數，最終得出待檢樣品中所含大腸菌群數值。
2.根據權利要求1所述的分光光度法快速檢測大腸菌群的方法，其特征在于:所述步驟⑵③中標準曲線的的回歸方程為:
IgY= 14.89X-1.33
R2=0.991 公式中:Y:未知樣品中大腸菌群的預計含量 X:360nm—500nm 處的 OD 值 R:相關系數。
3.如權利要求1或2所述的分光光度法快速檢測大腸菌群的方法在水質監測、生物、食品、衛生方面的大腸菌群的快速檢測方面中的應用。
【文檔編號】G01N21/78GK103940812SQ201410131441
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2014年4月2日
【發明者】黃琳, 張朝正, 郭剛, 程雅文, 劉曉博, 劉爽, 王煉 申請人:天津科技大學