一種過敏原陽性血清的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種過敏原陽性血清的制備方法，包括依次進行的如下步驟：步驟1、用自身免疫抗原對健康動物進行多次免疫，每次免疫之前，對健康動物進行取血測定OD值，當OD值穩定后，免疫結束，進行取血，獲得抗血清；步驟2、對步驟1所得的抗血清進行親和純化得到IgG抗體；步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質量比為1:1~2偶聯后，經分離純化獲得IgG-IgE連接物濃溶液，將IgG-IgE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5~1μg/ml，即得陽性血清。本發明方法可批量制備各種過敏原的陽性血清，解決了檢測試劑盒制備過程中的陽性質控問題，也可以作為校準品的生產原料，并且本制備方法簡單易行。
【專利說明】一種過敏原陽性血清的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于體外診斷【技術領域】，具體涉及一種過敏原陽性血清的制備方法。
【背景技術】
[0002]過敏是一種機體的變態反應，是人對正常物質(過敏原)的一種不正常的反應，當過敏原接觸到過敏體質的人群才會發生過敏，過敏原有花粉、粉塵、異體蛋白、化學物質、紫外線等幾百種。在過敏反應的發生過程中，過敏介質起著直接的作用，過敏原是過敏病癥發生的外因，而機體免疫能力低下，大量自由基對肥大細胞和嗜堿粒細胞的氧化破壞是過敏發生的內因。一般來講，當過敏原第一次進入機體時，與肥大細胞或者是嗜堿性粒細胞結合，產生白三烯，前列腺素等等的過敏因子，但并不會立即產生過敏，此特性有些將維持2?3天，有的數月。當機體第二次接受這種過敏原時，肥大細胞才會變形，產生過敏因子，也就產生了 一系列的過敏現象。
[0003]過敏可以是體液(抗體)或者是細胞免疫機制介導的。在大多數情況下，可產生過敏反應的抗體屬于IgE類，這些個體可以歸類于患有IgE-介導的過敏反應。然而，并非所有的特異反應性個體都會發生與IgE相關的過敏反應；在非-1gE-介導的過敏反應中，抗體也可以屬于IgG—類，例如:包含右旋糖苷的免疫復合物導致的過敏性休克和和現在罕見的血清病，它們以前被歸于三型過敏反應。在患有過敏性支氣管肺曲霉菌病(ABPA)病人中，IgE和IgG抗體都可以被檢出。接觸性過敏性皮炎是以淋巴細胞為介導的過敏性疾病的代表。IgE檢測仍是公認的過敏檢測的主流產品，由于點刺注冊問題和體外檢測技術的提高，體外檢測今后將是過敏檢測主流趨勢；但是目前IgE檢測學術進展遲緩，基本沒有新的發展，因此提高檢測質量和降低檢測成本是主要開發方向。
[0004]但是，由于過敏診斷試劑的發展緩慢以及前期人們的重視度有限，除了部分過敏原可以購買到商業血清，大部分過敏原的陽性血清還是很難查詢到的，臨床收集少量可行，大量或者高濃度的血清基本不能收集到。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種可批量生產的過敏原陽性血清的制備方法。
[0006]為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案:
[0007]一種過敏原陽性血清的制備方法，包括依次進行的如下步驟:
[0008]步驟1、用自身免疫抗原對健康動物進行多次免疫，每次所述免疫之前，對所述健康動物進行取血測定OD值，當OD值穩定后，免疫結束，進行取血，獲得抗血清；
[0009]步驟2、對步驟I所得的抗血清進行親和純化得到IgG抗體；
[0010]步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質量比為1:1?2偶聯后，經分離純化獲得IgG-1gE連接物濃溶液，將所述的IgG-1gE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5?
Iμ g/ml，即得所述的陽性血清。[0011]優選地,所述的健康動物為兔子。
[0012]優選地，步驟I中，每次免疫時所采用的所述的過敏原的質量為2?60mg。
[0013]優選地，步驟I中，先將所述的過敏原配置成濃度為4?8mg/ml的過敏原溶液，按所述的過敏原溶液與弗氏完全佐劑的體積比為I?1.5:1配置成乳液進行首次免疫；按所述的過敏原溶液與弗式不完全佐劑的體積比為I?1.5:1配置成乳液進行后續免疫。
[0014]優選地，所述的免疫次數為6?8次，每兩次免疫的間隔時間為12?36天。
[0015]優選地，步驟I中，取血時采用耳緣靜脈取血。
[0016]優選地，采用蛋白A sepharose CL-4B親和柱進行所述的親和純化。
[0017]優選地，步驟3中，所述的IgG抗體和所述的人IgE抗體分別通過所述的2-亞胺四氫噻吩偶聯劑和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯劑活化后，在2?8°C下進行偶聯。
[0018]優選地,步驟3中，采用Supperdex200凝膠純化柱進行所述的分離純化。
[0019]優選地，步驟3中，采用含質量比為0.4?6%的牛血清白蛋白、ρΗ7.5?8.5、
0.09?0.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將所述的IgG-1gE連接物濃溶液進行所述的稀釋。
[0020]由于以上技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點:
[0021]本發明方法可批量制備各種過敏原的陽性血清，解決了檢測試劑盒制備過程中的陽性質控問題，也可以作為校準品的生產原料，并且本制備方法簡單易行。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]附圖1為經蛋白A sepharose CL-4B親和柱純化的兔抗牛肉IgG蛋白條帶。【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于以下實施例。實施例中采用的實施條件可以根據具體使用的不同要求做進一步調整，未注明的實施條件為本行業中的常規條件。
[0024]實施例1
[0025](一)過敏原的免疫和兔抗血清效價測定
[0026]材料與儀器
[0027]1、過敏原:過敏原凍干粉，過敏原為牛肉；
[0028]2、佐劑:商品化的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑；
[0029]3、動物:選3只(每種過敏原免疫3只兔子)2月齡、體重1.5?2.0kg的健康新西蘭大白兔；
[0030]4、二抗:HRP標記的羊抗兔IgG ；
[0031]5、耗材:三通器、一次性注射器、移液器等。
[0032]免疫步驟
[0033]1、免疫過敏原準備:用BCA法確定凍干粉溶解后過敏原的濃度，取4mg過敏原用PBS稀釋至600ul，用三通器將過敏原與完全佐劑或不完全佐劑(過敏原V:佐劑V=6:5)乳化，直至將一滴乳液滴入水中呈現球形而不分散則過敏原準備好。首次免疫用弗氏完全佐劑，后續免疫均用弗氏不完全佐劑。
[0034]2、動物免疫:將購買的3只新西蘭大白兔在動物房養殖I周，使動物適應環境；將制備好的乳液，用Iml注射器進行頸部或背部皮下免疫注射，每只新西蘭大白兔注射3點，每點注射300ul ;免疫周期為14天。
[0035]3、抗血清的制備:每只動物免疫前先于一側耳緣靜脈抽取2mL血(作為空白對照)，之后每次免疫14天后，下次免疫前進行耳緣靜脈取血用于抗血清評價；取血后取下針頭，將注射器中的血緩緩轉移至離心管中，于4°C冰箱中過夜，取上清即為血清，析出淡黃色抗血清；將抗血清轉移至另一管中，血凝塊以1500xg離心10min。吸出上清液合并收集到的抗血清管中；抗血清分裝保存于一 70°C。
[0036]4、抗血清效價的測定:采用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA),用包被緩沖液將過敏原稀釋至10ug/ml,除陰性孔外每孔加IOOul即Iug ;陰性對照I和陰性對照2各包被Iug羊肉和花生過敏原，4°C包被過夜；空白對照1:免疫過敏原前取血；空白對照2: —抗孵育封閉液，其中不含一抗抗體；空白對照3 =HRP標記的羊抗兔IgG孵育封閉液；其余孔為按1:100、1:200倍比稀釋的抗血清，進行效價測定。每次效價測定時平行進行上次收集抗血清的效價測定，前后兩次免疫后抗血效價差異不大，則可以終止免疫殺兔取血，如果效價還有明顯提高則繼續免疫。
[0037]以牛肉免疫兔后抗血清評價結果表1:
[0038]表1
[0039]
【權利要求】
1.一種過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:包括依次進行的如下步驟: 步驟1、用自身免疫抗原對健康動物進行多次免疫,每次所述免疫之前,對所述健康動物進行取血測定OD值，當OD值穩定后，免疫結束，進行取血，獲得抗血清； 步驟2、對步驟I所得的抗血清進行親和純化得到IgG抗體； 步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質量比為1: f 2偶聯后，經分離純化獲得IgG-1gE連接物濃溶液，將所述的IgG-1gE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5^1 μ g/ml,即得所述的陽性血清。
2.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:所述的健康動物為兔子。
3.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟I中，每次免疫時所采用的所述的過敏原的質量為2飛Omg。
4.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟I中，先將所述的過敏原配置成濃度為r8mg/ml的過敏原溶液，按所述的過敏原溶液與弗氏完全佐劑的體積比為廣1.5:1配置成乳液進行首次免疫；按所述的過敏原溶液與弗式不完全佐劑的體積比為廣1.5:1配置成乳液進行后續免疫。
5.根據權利要求1或4所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:所述的免疫次數為6~8次，每兩次免疫的間隔時間為12~36天。
6.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟I中，取血時采用耳緣靜脈取血。
7.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:采用蛋白Asepharose CL-4B親和柱進行所述的親和純化。
8.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟3中，所述的IgG抗體和所述的人IgE抗體分別通過所述的2-亞胺四氫噻吩偶聯劑和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯劑活化后，在疒8°C下進行偶聯。
9.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟3中，采用Supperdex200凝膠純化柱進行所述的分離純化。
10.根據權利要求1所述的過敏原陽性血清的制備方法，其特征在于:步驟3中，采用含質量比為0.4~6%的牛血清白蛋白、pH7.5~8.5,0.09、.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將所述的IgG-1gE連接物濃溶液進行所述的稀釋。
【文檔編號】G01N33/531GK103926396SQ201410128592
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月1日 優先權日:2014年4月1日
【發明者】孫嬋, 丁俊榮, 宋孟杰, 李永紅, 李慶春, 左云國 申請人:蘇州浩歐博生物醫藥有限公司