以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測dna甲基轉(zhuǎn)移酶的方法及應(yīng)用的制作方法

以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測dna甲基轉(zhuǎn)移酶的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的一種以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，將S1含有甲基化位點(diǎn)GATC的發(fā)夾DNA序列自組裝在金電極的表面，組成電化學(xué)發(fā)光生物傳感器；將修飾電極用甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化，再用甲基化限制性內(nèi)切酶酶切，淋洗后，用S2帶氨基的互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交，再將氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物通過EDC-NHS的耦合連接到電極上進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，以此來實(shí)現(xiàn)對甲基轉(zhuǎn)移酶的測定。本發(fā)明采用氧化石墨烯提供相對大的比表面積用于負(fù)載鄰菲啰啉釕，且氧化石墨烯與鄰菲啰啉釕是非共價(jià)結(jié)合，能有效地負(fù)載和易于操作并且能保持氧化石墨的電子結(jié)構(gòu)，以此為發(fā)光材料使本發(fā)明的傳感器對甲基轉(zhuǎn)移酶有很高的靈敏度。
【專利說明】以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，具體涉及一種以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化在許多生物過程中有重要的作用，包括轉(zhuǎn)錄，基因組印記，細(xì)胞分化，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和胚胎形成。研究發(fā)現(xiàn)許多人類的疾病與異?；蚣谆嘘P(guān)。DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNA MTase)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程。DNA甲基化可以發(fā)生在GATC和CCA/TGG上，即腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位。這種異常的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性與癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，這種關(guān)系提供了一個(gè)在疾病的診斷和治療的潛在目標(biāo)。此外，DNA MTase是用于治療癌癥的藥理學(xué)家族的新成員。因此，一種靈敏、快速的檢測DNA甲基化及DNA MTase活性的方法無疑對癌癥的早期診斷提供了強(qiáng)有力的手段，為研究基因調(diào)控的基本機(jī)制提供了見解，同時(shí)為研發(fā)新的抗癌藥物提供了依據(jù)。用于DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性的測定的傳統(tǒng)的方法依賴放射性同位素標(biāo)記的基底，基于PCR的不同技術(shù)，毛細(xì)管電泳和高效液相色譜。這些方法時(shí)間密集，耗費(fèi)DNA，需要費(fèi)力的處理和特殊的同位素標(biāo)記。
[0003]電化學(xué)發(fā)光(電致化學(xué)發(fā)光)，簡稱ECL，是通過電極對含有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的體系施加一定的電壓或通過一定的電流，電極氧化還原產(chǎn)物之間或電極氧化還原產(chǎn)物與體系其它共存物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并生成某種不穩(wěn)定的中間態(tài)物質(zhì)，該物質(zhì)分解而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光技術(shù)是電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的檢測技術(shù)，該技術(shù)既集成了發(fā)光與電化學(xué)分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，又具有二者結(jié)合產(chǎn)生的可控性、選擇性、重現(xiàn)性好、靈敏度高、檢測限低及動(dòng)力學(xué)響應(yīng)范圍寬等新優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對測定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高、測定方法復(fù)雜等缺陷，本發(fā)明旨在提供一種以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法及應(yīng)用。
[0005] 申請人:擬設(shè)計(jì)含有甲基化特定位點(diǎn)的發(fā)夾DNA捕獲探針，利用限制性內(nèi)切酶對識別位點(diǎn)甲基化敏感的特性，以不同的甲基轉(zhuǎn)移酶為例，建立快速甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析方法。同時(shí)，用此方法考察不同抗癌藥物對于甲基化轉(zhuǎn)移酶活性的影響，建立了一種在分子水平進(jìn)行藥物篩選的新思路。本發(fā)明充分利用了核酸甲基化轉(zhuǎn)移酶、限制性內(nèi)切酶和核酸分子探針的性質(zhì)和功能，進(jìn)一步發(fā)展了核酸分子技術(shù)在DNA-蛋白質(zhì)(酶)相互作用研究中的應(yīng)用，為研究生命活動(dòng)過程提供了新的手段和方法。
[0006]鄰菲啰啉釕(Ru (Phen)32+)是常用的電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，由于其良好的性能即在中性水溶液中能夠穩(wěn)定存在并且具有高靈敏度，因此在電化學(xué)發(fā)光傳感器中得到了廣泛的研究。近年來，納米材料成為人們研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，因此各種納米材料被用來負(fù)載Ru (Phen)32+和釕聯(lián)吡啶(Ru(bpy)32+)。氧化石墨烯(GO)是單層的氧化石墨構(gòu)成的，因?yàn)榫哂懈叩谋砻骟w積比、在水中和有機(jī)溶劑中高的可分散性和它表面結(jié)合的廣泛的活性官能團(tuán)，使得基于氧化石墨烯的材料在生物傳感的研究和應(yīng)用有獨(dú)特的吸引力。最近石墨烯組裝Ru(bpy)32+復(fù)合物已經(jīng)被報(bào)道，例如，利用全氟磺酸將Ru(bpy)32+固定在石墨烯上用于TPA的電化學(xué)發(fā)光檢測顯示了很好的靈敏性和穩(wěn)定性。氧化石墨烯組裝硫堇放大信號電化學(xué)檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用也已經(jīng)有報(bào)道(Wen Li, Ping ffu, Hui Zhang, and Chenxin Ca1.AnalyticalChemistry, 2012，84，7583-7590)。與電化學(xué)發(fā)光試劑 Ru(bpy)32+相比，Ru(phen)32+具有更好的吸附性，氧化石墨烯帶有負(fù)電荷且其基面上還含有很多η共軛芳香基團(tuán)，因此易于通過靜電作用、堆積作用與Ru(Phen)32+強(qiáng)烈結(jié)合并具有出色的長期穩(wěn)定性(Scott Gilje,Song Han,Minsheng Wang, Kang L.Wang, and Richard B.Kaner, NanoLetters, 2007，7，3394-3398;Yali Yuan, Haijuan Li, Shuang Han, Lianzhe Hu, SaimaParveen, Haoran Cai, and Guobao Xu.Anal.Chim.Acta, 2012, 720, 38 - 42.)。因此，基于氧化石墨烯對鄰菲啰啉釕高負(fù)載能力、良好的生物相容性和穩(wěn)定性，我們設(shè)計(jì)一種基于氧化石墨烯負(fù)載電化學(xué)發(fā)光活性物質(zhì)對甲基酶活性的分析方法。
[0007]本發(fā)明提供一種以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括如下步驟:
[0008]I)將SI通過金巰鍵自組裝固定在金電極上；所述SI為含有甲基化位點(diǎn)GATC的發(fā)夾DNA ；
[0009]2)以待測甲基轉(zhuǎn)移酶(Dam MTase)對步驟I)固定在電極上的SI進(jìn)行甲基化；
[0010]3)用甲基化限制性內(nèi)切酶(Dpn I)酶切步驟2)甲基化后的SI ；
[0011]4)以S2與步驟3)酶切后保留在電極上的SI雜交；所述S2為帶氨基的互補(bǔ)DNA ；
[0012]5)把氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物(Ru (phen) 32+/G0)通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上；
[0013]6)對步驟5)的電極進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，由此測定待測的甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0014]其中，所述SI的序列如下:
[0015]5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGATCGCAAT-3，(如 SEQ IDN0.1所示)。
[0016]其中，所述S2的序列如下:
[0017]5’-NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0018]其中，步驟I)所述將SI通過金巰鍵固定在金電極上，具體步驟為:將金電極浸入到2 μ M SI的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時(shí)，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，再用ImM的6-巰基己醇(MCH)封閉，用PBS溶液淋洗金電極。
[0019]其中，步驟I)所述金電極為按如下方法預(yù)處理后的金電極:
[0020]在麂皮上分別用0.3和0.05 μ m的氧化鋁粉末拋光打磨至鏡面，再用水、無水乙醇分別超聲洗滌2min，以除去電極表面粘附的氧化鋁粉末，最后用Mill1-Q水淋洗干凈，然后將電極置于0.lmol/L H2SO4溶液中在-0.2?1.6V (vs.Ag / AgCl)電位范圍內(nèi)以100mV/s的掃速掃描至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖，隨后用Mill1-Q水淋洗電極，并用隊(duì)吹干保存?zhèn)溆?。[0021]其中，步驟I)所述金電極的直徑優(yōu)選為2mm。
[0022]其中，步驟2)所述進(jìn)行甲基化，所用反應(yīng)體系為500yLlXDam buffer (50mMpH7.5 的 Tris-HCl，IOmM NaCl，IOmM EDTA，5mM 巰基乙醇)和 160mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和待測甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0023]其中，步驟2)所述進(jìn)行甲基化，所用反應(yīng)條件為37°C保溫60min。
[0024]其中，步驟3)所述酶切，所用反應(yīng)體系為500 μ LlXNEB buffer4 (50mM KAc,20mMTris-Ac, IOmM Mg(Ac)2, ImM DTT，pH7.9)和 80U Dpn I。
[0025]其中，步驟3)所述酶切，所用反應(yīng)條件為37°C保溫2h。
[0026]其中，步驟4)所述雜交，所用反應(yīng)體系為5yL2.ΟμΜ S2帶氨基的互補(bǔ)DNA，IOmMTris-HCl buffer,pH7.4。
[0027]其中，步驟5)所述氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物，通過如下方法制備:把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg鄰菲啰啉釕的5 mL水溶液中，超聲15分鐘，室溫?cái)嚢柽^夜，超聲5分鐘，每分鐘8000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除多余的鄰菲啰啉釕，去離子水和無水乙醇洗滌，干燥，得到氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物。
[0028]其中，所述氧化石墨烯以Hmnmers法制備。Hmnmers法制備的具體步驟優(yōu)選為在冰水浴中，將59g石墨粉和2.59g硝酸鈉與115mL的濃硫酸混合均勻，攪拌中緩慢加入15gKMnO4，保持2V以下持續(xù)反應(yīng)I h，將其轉(zhuǎn)移至35°C水浴，反應(yīng)30min逐步加入250mL去離子水，溫度升至98°C繼續(xù)反應(yīng)15min后，可明顯觀察到混合物由棕褐色變成亮黃色，進(jìn)一步連續(xù)加水稀釋，并用質(zhì)量百分含量30%的H2O2，溶液處理，中和未反應(yīng)的高錳酸鉀，將上述溶液趁熱抽濾除去大部分的水和強(qiáng)酸等，再將濾餅放入透析袋中，在體積百分含量的5%HCI溶液中洗滌，以除去金屬離子，再在蒸餾水中反復(fù)洗滌直到成中性，抽濾并將濾餅放入烘箱中80°C充分干燥得到氧化石墨烯。
[0029]其中，步驟5)把氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上，具體為把氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物使用前在EDC-NHS混合溶液中(5mM EDC, IOmM NHS in Tris-HCl buffer，pH7.4)活化 30min，把步驟 4)雜交后的電極浸沒在500 μ Llmg/mL的氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物溶液中180min，S2上的氨基和氧化石墨烯活化的羧基反應(yīng)，使得氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物共價(jià)連接到步驟
4)雜交后的電極上。
[0030]其中，步驟6)所述進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，檢測液為含有0.02mol/LTPA的0.1mol/L PBS 溶液 2.0mL。
[0031]其中，步驟6)所述進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，在室溫下進(jìn)行，將電解池置于暗盒中，連接好三電極體系，在O?+1.25V的電位范圍內(nèi)，以100mV/S的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄其ECL信號并進(jìn)行定量分析。
[0032]本發(fā)明的另一目的是提供所述電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法的應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0034]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器具有如下的優(yōu)點(diǎn)和顯著地進(jìn)步:采用氧化石墨烯提供相對大的比表面積用于負(fù)載鄰菲啰啉釕，并且氧化石墨烯對鄰菲啰啉釕的負(fù)載采用的是非共價(jià)結(jié)合，相比于共價(jià)結(jié)合，非共價(jià)結(jié)合通過超分子反應(yīng)如η-H堆積能有效地負(fù)載和易于操作并且能保持氧化石墨的電子結(jié)構(gòu)。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)光強(qiáng)度可以看出，氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物可以作為發(fā)光材料，并且對于沒有甲基轉(zhuǎn)移酶或者剪切酶的情況下，發(fā)光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有甲基轉(zhuǎn)移酶和剪切酶的情況，這說明該傳感器對甲基轉(zhuǎn)移酶檢測有很高的選擇性。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)的基于氧化石墨烯電化學(xué)發(fā)光傳感器在構(gòu)建對一些工具酶的研究方法中體現(xiàn)出良好地發(fā)展前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法的流程圖。
[0036]圖2為不同修飾電極的電化學(xué)阻抗圖(EIS)圖。其中，a為裸金電極；b為SI修飾電極；c SMCH/S1修飾電極；dSMCH/Sl修飾電極先后經(jīng)Dam和Dpn I處理后的電極；e為Ru (phen) 32+/G0/S2/MCH/Sl 修飾電極。
[0037]圖3為不同修飾階段的電極經(jīng)不同處理后的電化學(xué)發(fā)光曲線圖。其中，a為Img/mL Ru (phen) 32+/G0 和 0.02M TPA ；b 為 SI 修飾電極經(jīng) Dam、DpnI 和 S2、Ru (phen) 32+/G0 ；c 為SI 修飾電極經(jīng) DpnI 和 S2、Ru (phen) 32+/G0 ；d 為 SI 修飾電極直接和 S2、Ru (phen) 32+/G0 ；e為 S3 修飾電極經(jīng) Dam、DpnI 和 S2、Ru (phen) ^2+/GO0
[0038]圖4為發(fā)夾DNA的甲基化時(shí)間優(yōu)化結(jié)果圖。
[0039]圖5為Ru (phen) 32+/G0濃度優(yōu)化結(jié)果圖。
[0040]圖6為Ru (phen) 32+/G0的耦合時(shí)間優(yōu)化結(jié)果圖。
[0041]圖7為實(shí)施例1中氧化石墨烯(GO)和Ru (phen) 32+/G0的表征圖。其中，A為GO的透射電鏡圖，B為Ru (phen) 32+/G0的透射電鏡圖，C為GO和Ru (phen) 32+/G0的拉曼光譜，D為Ru (phen) 32+/GO 的能譜圖。
[0042]圖8為實(shí)施例1中不同濃度甲基轉(zhuǎn)移酶的ECL信號測定結(jié)果圖。其中，A為不同濃度甲基轉(zhuǎn)移酶的ECL信號響應(yīng)，曲線a-j分別是濃度0，0.05，0.1, 0.2，0.5，1.0, 5.0, 10，20，40U/mL ;B為甲基轉(zhuǎn)移酶濃度與ECL信號的線性關(guān)系圖。
[0043]圖9為實(shí)施例2中不同慶大霉素濃度影響甲基轉(zhuǎn)移酶活性的測定結(jié)果圖。其中，A為不同慶大霉素濃度處理后ECL信號響應(yīng)，B為不同濃度慶大霉素與相對活性曲線圖，慶大霉素的濃度分別是 0，0.1, 0.3，0.5，0.8，1.0, 2.0 μ Μ。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0045]本發(fā)明涉及的一種以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，將SI含有甲基化位點(diǎn)GATC的發(fā)夾DNA序列自組裝在金電極的表面，組成電化學(xué)發(fā)光生物傳感器；將修飾電極用甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化，再用甲基化限制性內(nèi)切酶切割，淋洗后，用S2帶氨基的互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交，再將氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物通過EDC-NHS的耦合連接到電極上進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，以此來實(shí)現(xiàn)對甲基轉(zhuǎn)移酶的測定。
[0046]本發(fā)明是一種以電 化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，具體的實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，包括以下步驟:
[0047]I)將金電極(即裸金電極)侵入到2 μ M SI的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時(shí)，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，得到SI修飾電極，再用ImM的6-巰基己醇封閉，用PBS溶液淋洗，得到MCH/S1修飾電極。金電極需預(yù)先進(jìn)行如下處理:在麂皮上分別用0.3和0.05 μ m的氧化鋁粉末拋光打磨至鏡面，再用水、無水乙醇分別超聲洗滌2min，以除去電極表面粘附的氧化鋁粉末，最后用Mill1-Q水淋洗干凈，然后將電極置于0.lmol/L H2SO4溶液中在-0.2?1.6V (vs.Ag / AgCl)電位范圍內(nèi)以100mV/s的掃速掃描至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖，隨后用Mill1-Q水淋洗，并用N2吹干保存?zhèn)溆谩?br> [0048]2)對發(fā)夾DNA進(jìn)行甲基化，其中甲基化體系500 μ L包括50mM Tris-HCl pH7.5，IOmM NaCl, IOmM EDTA, 5mM 疏基乙醇(2-mercaptohexanol), 160mM SAM 和不同濃度的待測甲基轉(zhuǎn)移酶Dam MTase，37°C保溫60min。
[0049]3)將甲基化的修飾電極用限制性內(nèi)切酶Dpn I酶切，其中酶切體系500 μ L包括IXNEB buffer4(50mM KAc,20mM Tris-Ac, IOmM Mg(Ac)2, ImM DTT, ρΗ7.9)和 80U Dpn I,37°C保溫2h。得到的電極為MCH/S1修飾電極先后經(jīng)Dam和Dpn I處理后的電極。
[0050]4)將酶切過的修飾電極浸沒在5 μ L包含2.0 μ M S2DNA探針(inlOmM Tris-HClbuffer, pH7.4)，使保留在電極上的DNA末端與S2DNA雜交。
[0051]5)利用Hmnmers法制備出氧化石墨烯,再進(jìn)一步合成氧化石墨烯負(fù)載鄰菲口羅啉釕復(fù)合物(Ru (phen) 32+/GO )；
[0052]Ru (phen) 32+/G0 使用前在 EDC-NHS 混合溶液中(5禮 EDC，IOmM NHS in Tris-HClbuffer, pH7.4))活化 30min ;把雜交后的電極浸沒在 500 μ Llmg/mL 的 Ru (phen) 32+/G0 溶液中 180min，得到 Ru (phen) 32+/G0/S2/MCH/Sl 修飾電極。
[0053]6)將修飾好的電極進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測量，測量體系2.0mL0.10MPBS(pH7.4)包含
0.02M 三丙胺(TPA)。
[0054]針對上述不同修飾階段的電極繪制電化學(xué)阻抗圖，見圖2。
[0055]為實(shí)驗(yàn)上述不同修飾階段的電極經(jīng)不同處理后的電化學(xué)發(fā)光行為，設(shè)置了 5個(gè)處理:a 金電極經(jīng) 0.1OM PBS (pH7.4)包含 lmg/mL Ru (phen) 32+/G0 和 0.02M TPA 處理；b MCH/SI修飾的電極先后經(jīng)100U/mL Dam, 50U/mL Dpn I處理，S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復(fù)合物耦合；c MCH/S1修飾的電極直接經(jīng)50U/mL Dpn I處理，S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復(fù)合物耦合；d MCH/S1修飾的電極與S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復(fù)合物耦合；e MCH/S3修飾的電極分別經(jīng)100U/mL Dam, 50U/mL Dpn I處理，S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復(fù)合物耦合。ECL測量在
0.10M PBS (pH7.4)包含 0.02M TPA 中進(jìn)行；掃描速度:0.lV/s，掃描范圍:0-+1.25V。
[0056]其中，SI為含有甲基化位點(diǎn)GATC的發(fā)夾DNA序列:5’-HS-(CH2)6_TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGA TCGCAAT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0057]S2 為帶氨基的互補(bǔ) DNA 序列:5’-NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA_3’(如 SEQ ID N0.2所示)
[0058]S3為不含有甲基化位點(diǎn)GATC的對照發(fā)夾DNA序列:5’-HS_ (CH2) 6_TACTGATTGCGACTGAGAATGCTTTTGCATTCTCGA CTG CAAT-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)
[0059]具體結(jié)果見如圖3，采用SI含有甲基化位點(diǎn)GATC的對照發(fā)夾DNA的處理b電化學(xué)發(fā)光行為明顯，而采用S3不含有甲基化位點(diǎn)GATC的對照發(fā)夾DNA的處理e檢測到非常弱電化學(xué)發(fā)光行為。且氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物作為發(fā)光材料在沒有甲基轉(zhuǎn)酶或者剪切酶的情況下發(fā)光強(qiáng)度遠(yuǎn)低于有甲基轉(zhuǎn)移酶和剪切酶的情況，因此本發(fā)明的傳感器對甲基轉(zhuǎn)移酶檢測有很聞的選擇性。
[0060]發(fā)明人還對本發(fā)明中的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，具體如下:
[0061](I)發(fā)夾DNA的甲基化時(shí)間。對甲基化處理設(shè)置0-120分鐘的不同的時(shí)間長度(20U/mL Dam, lmg/mL Ru (phen) 32+/G0, Ru (phen) 32+/G0和 S2 探針稱合 300min,其他參照上述步驟1)-6)進(jìn)行)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在甲基化時(shí)間60min時(shí)能達(dá)到發(fā)光強(qiáng)度的99%，在120min時(shí)達(dá)到最大，為了節(jié)省整個(gè)測試過程的時(shí)間，我們選擇甲基化時(shí)間為60min。
[0062](2) Ru (phen) 32+/G0 濃度。對 Ru (phen) 32+/G0 濃度設(shè)置 0-3.0mg/mL 的不同的濃度梯度(20U/mL Dam甲基化60min, Ru (phen) 32+/G0和S2探針稱合300min,其他參照上述步驟O-6)進(jìn)行)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，Ru (phen) 32+/G0濃度在O到0.5mg/mL時(shí)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加的很快，在lmg/mL是達(dá)到最大值,因此，我們選擇Ru (phen) 32+/G0濃度為lmg/mL。
[0063](3) Ru (phen) 32+/GO的I禹合時(shí)間。對Ru (phen) 32+/GO f禹合時(shí)間設(shè)置不同的長度(20U/mL Dam甲基化60min, lmg/mL Ru (phen) 32+/G0,其他參照上述步驟I) -6)進(jìn)行),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，耦合時(shí)間在10到IOOmin時(shí)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加的很快，在180min是達(dá)到最大信號值，因此，我們選擇耦合時(shí)間為180min。
[0064]實(shí)施例1電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測甲基轉(zhuǎn)移酶濃度
[0065]1.實(shí)驗(yàn)部分
[0066]1.1儀器和試劑
[0067]MP1- E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司)；CHI660D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司);TGL - 16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);KH3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Mill1-Q型超純水儀(美國Millipore公司)；實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng):修飾有發(fā)夾DNA的金電極工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)為參比電極，鉬絲電極為對電極。
[0068]石墨粉(99.998%)，三-(2_羧乙基)磷酸鹽酸鹽(TCEP，98%)，N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，乙基{3- (二甲氨基)丙基}碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，三丙胺(TPA)，6-巰基己醇(MCH)，鄰菲啰啉釕(Ru(phen)32+)，以上試劑都購自西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)有限公司，使用時(shí)無需二次純化。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，E.coli甲基轉(zhuǎn)移酶Dam，E.coli限制性內(nèi)切酶Dpn I購買于北京紐英倫生物技術(shù)有限公司。寡聚核苷酸鏈購自上海生物工程有限公司，堿基序列如下:
[0069]SI (含有甲基化位點(diǎn)GATC的發(fā)夾DNA):
[0070]5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTC GATCGCAAT-3，(如 SEQ IDN0.1所示)
[0071]S2 (帶氨基的互補(bǔ)DNA):
[0072]5’-NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0073]S3 (不含有甲基化位點(diǎn)GATC的對照發(fā)夾DNA):
[0074]5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGACTGAGAATGCTTTTGCATTCTC GACTG CAAT-3，(如 SEQ IDN0.3所示)
[0075]1.2實(shí)驗(yàn)步驟
[0076]1.2.1氧化石墨烯以及Ru (phen) 32+/G0復(fù)合物的合成
[0077]冰水浴中，將59g石墨粉和2.59g硝酸鈉與115mL的濃硫酸混合均勻，攪拌中緩慢加入15g KMnO4，保持2°C以下持續(xù)反應(yīng)I h，將其轉(zhuǎn)移至35°C水浴，反應(yīng)30min逐步加入250mL去離子水，溫度升至98 °C繼續(xù)反應(yīng)15min后，可明顯觀察到混合物由棕褐色變成亮黃色，進(jìn)一步連續(xù)加水稀釋，并用質(zhì)量百分含量30%的H2O2，溶液處理，中和未反應(yīng)的高錳酸鉀，將上述溶液趁熱抽濾除去大部分的水和強(qiáng)酸等，再將濾餅放入透析袋中，在體積百分含量的5%HCI溶液中洗滌，以除去金屬離子，再在蒸餾水中反復(fù)洗滌直到成中性，抽濾并將濾餅放入烘箱中80°C充分干燥得到氧化石墨烯。
[0078]把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg的鄰菲P羅啉釕的5mL的水溶液中，對混合溶液超聲15分鐘后，在室溫下攪拌過夜。之后對混合溶液超聲5分鐘，用每分鐘8000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除多余的鄰菲啰啉釕，接著用去離子水和無水乙醇進(jìn)行洗滌，最后在真空干燥箱中干燥，得到 Ru(phen)32+/G0。
[0079]制得的氧化石墨烯(GO)和Ru (phen) 32+/G0復(fù)合物的表征圖見圖7。
[0080]圖7A為GO的透射電鏡圖(TEM)，B為Ru (phen) 32+/G0的透射電鏡圖(TEM)，圖中合成的氧化石墨烯及其復(fù)合物層數(shù)很少，呈半透明并且有一些褶皺。圖7C為GO和Ru(Phen)32VGO的拉曼光譜，從圖中可以看出樣品的D和G峰，ID/IG的比率經(jīng)常可以用作展示石墨的碳樣品上的化學(xué)修飾水平。GO和Ru(phen)327G0的ID/Ie比率分別是0.78和
0.81，這個(gè)增加的比率反映了無序程度的增加，因?yàn)檠趸┥系墓w原子導(dǎo)致的。此夕卜，圖7D為Ru(phen)327G0的能譜圖，由圖中可以看出這個(gè)復(fù)合物由三種元素構(gòu)成，說明Ru (phen) 32+/GO復(fù)合物的合成成功。
[0081]1.2.2電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的構(gòu)建
[0082]1.金電極的處理。金電極(Φ=2πιπι)在麂皮上分別用0.3和0.05 μ m的氧化鋁粉末仔細(xì)拋光打磨至鏡面，再用水、無水乙醇分別超聲洗滌2min，以除去電極表面粘附的氧化鋁粉末，最后用Mill1-Q水淋洗干凈。然后將電極置于0.lmol/L H2SO4溶液中在-0.2?
1.6V(vs.Ag/AgCl)電位范圍內(nèi)以100mV/s的掃速掃描至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖，隨后用Mill1-Q水淋洗，并用N2吹干保存?zhèn)溆谩?br> [0083]2.電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備。將處理過的金電極侵入到2 μ MSl的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時(shí)，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，再用ImM的6-巰基己醇封閉，用PBS溶液淋洗金電極。從而制得電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。
[0084]1.2.3電化學(xué)發(fā)光檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶
[0085]對發(fā)夾DNA進(jìn)行甲基化，其中甲基化體系500 μ L包括50mM Tris-HCl pH7.5, IOmMNaCl, IOmM EDTA, 5mM2-mercaptohexanol, 160mM SAM 和不同濃度的 Dam MTase,37°C保溫60min ;將甲基化的修飾電極用限制性內(nèi)切酶Dpn I酶切，其中酶切體系500 μ L包括I XNEBbuffer4 (50mM KAc,20mM Tris-Ac, 10 mM Mg (Ac) 2, ImM DTT，ρΗ7.9)和 80U Dpn I，37°C保溫2h ;將酶切過的修飾電極浸沒在5 μ L包含2.0 μ M S2DNA探針(inlOmM Tris-HCl buffer,pH7.4)，使保留在電極上的DNA末端與S2DNA雜交。把雜交后的電極浸沒在500 μ Llmg/mL的Ru(phen)327G0溶液中ISOmin ;將修飾好的電極進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測量，測量體系
2.0mL0.10M PBS (pH7.4)包含0.02M TPA，將電解池置于暗盒中，連接好三電極，在0-+1.25的電位范圍內(nèi)，以0.lV/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描記錄其ECL信號并進(jìn)行定量分析，結(jié)果見圖8。[0086]1.3結(jié)果與討論
[0087]本發(fā)明在優(yōu)選的最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，研究了不同濃度的甲基轉(zhuǎn)移酶與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系，得到了甲基轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及線性方程。
[0088]在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)甲基轉(zhuǎn)移酶的濃度在0.05U/mL至40U/mL范圍內(nèi)，隨著甲基轉(zhuǎn)移酶Dam濃度的增加，電化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)，其線性方程為1=912.32+545.78IgC (C 的單位 U/mL), r = 0.9976。
[0089]與已報(bào)道的用于檢測MTase活性的方法比較，結(jié)果見表1:本發(fā)明的方法線性范圍更寬，檢出限更低(0.02U/mL，S/N=3)。0.5U/mL的甲基轉(zhuǎn)移酶的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是
4.65%(n=5)。表明此方法有較好的靈敏度和重現(xiàn)性。
[0090]表1不同檢測甲基轉(zhuǎn)移酶方法的檢出限
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種以電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將SI通過金巰鍵自組裝固定在金電極上；所述SI為含有甲基化位點(diǎn)GATC的發(fā)夾DNA序列； 2)以待測甲基轉(zhuǎn)移酶對步驟I)固定在電極上的SI進(jìn)行甲基化； 3)用甲基化限制性內(nèi)切酶酶切步驟2)甲基化后的SI； 4)以S2與步驟3)酶切后保留在電極上的SI雜交；所述S2為帶氨基的互補(bǔ)DNA； 5)把氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上； 6)對步驟5)的電極進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，由此測定待測的甲基轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述SI的序列如下:
5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGATCGCAAT-3，(如 SEQ ID N0.1所示)； 所述S2的序列如下:
5’ -NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述將SI通過金巰鍵自組裝固定在金電極上，具體步驟為:將金電極浸入到2 μ M SI的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時(shí)，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，再用ImM的6-巰基己醇封閉，用PBS溶液淋洗金電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述進(jìn)行甲基化，所用反應(yīng)體系為500 μ LlXDam buffer (50mM pH7.5 的 Tris-HCl，IOmM NaCl, IOmM EDTA，5mM 巰基乙醇)和160mMS-腺苷甲硫氨酸和待測甲基轉(zhuǎn)移酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述進(jìn)行甲基化，所用反應(yīng)條件為37°C 保溫 60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述酶切，所用反應(yīng)體系為500 μ LlXNEB buffer4(50mM KAc,20mM Tris-Ac, IOmM Mg(Ac)2, ImM DTT，ρΗ7.9)和 80U Dpn I。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述雜交，所用反應(yīng)體系為5 μ L2.0 μ M S2 帶氨基的互補(bǔ) DNA，IOmM Tris-HCl buffer, pH7.4。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)所述氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物，通過如下方法制備:把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg鄰菲P羅啉釕的5mL水溶液中，超聲15分鐘，室溫?cái)嚢柽^夜，超聲5分鐘，每分鐘8000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除多余的鄰菲啰啉釕，去離子水和無水乙醇洗滌，干燥，得到氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)把氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上，具體為把氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物使用前在EDC-NHS混合溶液中(5mM EDC，IOmM NHS in Tris-HCl buffer,pH7.4)活化30min，把步驟4)雜交后的電極浸沒在500 μ Llmg/mL的氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物溶液中180min，S2上的氨基和氧化石墨烯活化的羧基反應(yīng)，使得氧化石墨烯負(fù)載鄰菲啰啉釕復(fù)合物共價(jià)連接到步驟4)雜交后的電極上。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/69GK103901020SQ201410128514
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】李延, 閆曌 申請人:西北大學(xué)