癌癥危險分層生物標志物、其應用以及癌癥危險分層裝置制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種癌癥危險分層生物標志物、其應用以及癌癥危險分層裝置。該癌癥危險分層裝置包括：作為癌癥危險分層生物標志物的PAK1；免疫組化檢測試劑盒，用于免疫染色所述PAK1從而檢測所述PAK1的蛋白表達；危險分層模塊，基于所述PAK1的蛋白表達將所述PAK1的病理樣本劃分為PAK1高表達組和PAK1低表達組。實施本發明的癌癥危險分層生物標志物、其應用以及癌癥危險分層裝置，采用PAK1可以單獨的將癌癥患者分層，準確預測患者癌癥轉移風險，用于預測腫瘤病人預后，進而對病人危險程度分層，以指導設計癌癥病人術后的個體化治療方案。
【專利說明】癌癥危險分層生物標志物、其應用以及癌癥危險分層裝置
【技術領域】
[0001]本發明涉及癌癥危險分層領域，更具體地說，涉及一種癌癥危險分層生物標志物、其應用以及癌癥危險分層裝置。
【背景技術】
[0002]胃食管結合部為食管與胃的移行帶。胃食管結合部由遠端食管、賁門及近端胃管。胃食管結合部腺癌(Adenocarcinoma of esophago-gastric junction, GEJA)發病率正在上升，而且預后不良。Siewert和Stein提出了 GEJA的形態/解剖分型(I型:遠端食管腺癌；11型:真正的胃食管結合部癌；和III型:胃癌浸潤食管遠端)以指導該癌癥的治療策略。美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC) TNM分期常用于指導臨床醫生對許多腫瘤(包括GEJA)的預后分析和治療計劃。淋巴結轉移是--Μ分期的關鍵核心，與GEJA患者的不良預后緊密相關。對于GEJA，手術切除原發腫瘤是主要的治療手段。目前建議至少應該切除15枚淋巴結，并進行評估，以實現準確的分期。準確的LN評估也是總生存期的顯著預測因子。除了提高生存率方面的考慮，LN清掃不全(〈15個切除淋巴結)很常見，從而導致分期準確性不全。更廣泛的淋巴結清掃術實施后，更多的淋巴結會被切除，以準確評估淋巴結轉移狀態。然而，擴大淋巴結清掃后，與術中及術后并發癥相關的發病率和死亡率均高。在經過完整大體切除的患者中，GEJA的AJCC準確分期被難以達到足夠的淋巴結清掃(> 15淋巴結)所限制。即使極權威的癌癥中心和訓練有素的醫生，也有約30%的病例淋巴結清掃不全。為減少手術并發癥和發病率，GEJA足夠的淋巴結清掃術往往不能實施，因此，淋巴結清掃不全造成了預后判斷不準確和治療方案的不適當。比如，由于判斷不準確導致過度治療或者治療不充分。因此，我們需要一種更準確預測淋巴結清掃不全的患者GEJA轉移風險的癌癥危險分層生物標志物，以指導GEJA術后個體化治療和管理。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題在于，針對現有技術的癌癥總生存期預測方法在淋巴結清掃不足的時候，無法準確預測淋巴結清掃不全的患者癌癥轉移風險的缺陷，提供一種癌癥危險分層生物標志物、其應用以及癌癥危險分層裝置，其能夠準確預測淋巴結清掃不全的患者的癌癥轉移風險以引導癌癥進一步的術后管理。
[0004]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:構造一種癌癥危險分層裝置，包括:
[0005]作為癌癥危險分層生物標志物的PAKl ；
[0006]免疫組化檢測試劑盒，用于免疫染色所述PAKl從而檢測所述PAKl的蛋白表達；
[0007]危險分層模塊，基于所述PAKl的蛋白表達將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
[0008] 在本發明所述的癌癥危險分層裝置中，所述危險分層模塊包括:[0009]半定量組織學積分計算單元，用于評估免疫染色的所述PAKl的半定量組織學積分；
[0010]節點計算單元，采用受試者工作特征曲線的曲線下面積區域計算所述PAKl的半定量組織學積分的分層節點積分；
[0011]分層單元，基于所述分層節點積分和所述PAKl將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
[0012]在本發明所述的癌癥危險分層裝置中，所述免疫組化檢測試劑盒包括:兔抗人PAKl多克隆抗體和用于進行染色的蘇木精。
[0013]在本發明所述的癌癥危險分層裝置中，所述PAKl的病理樣本經過組織切片后進行脫蠟、水化、內源性過氧化物酶阻斷和抗原修復，隨后在孵育兔抗人PAKl多克隆抗體過夜，二抗孵育，DAB顯色并采用蘇木精進行染色。
[0014]在本發明所述的癌癥危險分層裝置中，所述半定量組織學積分計算包括獲取染色強度和陽性細胞比例分數，所述半定量組織學積分為所述染色強度和陽性細胞比例份數的乘積。
[0015]在本發明所述的癌癥危險分層裝置中，所述PAKl來自淋巴結清掃不全的癌癥患者。
[0016]在本發明所述的癌癥危險分層裝置中，所述癌癥包括胃食管結合部腺癌。
[0017]本發明解決其技術問題所采用的另一技術方案涉及PAKl在制備用于對癌癥危險進行分層的癌癥危險分層生物標志物中的應用，其中所述癌癥危險分層生物標志物基于所述PAKl的蛋白表達將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
[0018]本發明解決其技術問題所采用的再一技術方案涉及一種癌癥危險分層生物標志物，所述癌癥危險分層生物標志物為PAKl，所述癌癥危險分層生物標志物基于所述PAKl的蛋白表達將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
[0019]在本發明所述的所述癌癥危險分層生物標志物中，所述癌癥包括胃食管結合部腺癌。
[0020]實施本發明的癌癥危險分層生物標志物、其應用以及癌癥危險分層裝置，采用PAKl可以單獨的將癌癥患者分層，準確預測患者癌癥轉移風險，因而更加有利地以引導癌癥進一步的術后管理。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中:
[0022]圖1示出了本發明的癌癥危險分層裝置的第一實施例的原理框圖；
[0023]圖2Α示出了免疫組化學檢測PAKl在GEJA原發腫瘤組織、配對淋巴結以及癌旁黏膜正常組織中的蛋白表達；其中分別所示為PAKl在GEJA腫瘤、配對淋巴結、癌旁黏膜正常組織的弱、中、強表達，其中正常黏膜以及陰性淋巴結中有較弱的背景PAKl表達；其中PLNs:轉移淋巴結，比例尺=50 μ m ；
[0024]圖2B示出了 PAKlH-score在轉移性GEJA增高；箱型圖示:正常黏膜(NES)，原發腫瘤(PTS)和陽性淋巴結(PLNs)的PAK Η-score ；
[0025]圖2C示出了淋巴結轉移的GEJA原發性腫瘤組織中PAKlH-score高于淋巴結未轉移者。誤差線為標準差(SD) ;**P = 0.001, ***Ρ〈0.001 ；
[0026]圖2D示出了原發腫瘤組織與淋巴結轉移癌組織的PAKlH-score成正相關；其中Ρ〈0.001，相關系數 r = 0.475 ；
[0027]圖3A運用ROC曲線(受試者工作特征曲線)分析各臨床參數(含PAK1)評價總生存率的準確性；其中對角虛線表示AUC (曲線下面積)為0.5的基準測試閾值；
[0028]圖3B運用單因素Kaplan-Meier分析原發癌PAKl表達與淋巴結清掃不全患者總生存率(OS)的關系；組I =PAKl低表達患者；組2:PAK1高表達，淋巴結未轉移患者；組3:PAKl高表且淋巴結轉移患者；
[0029]圖3C示出了運用單因素Kaplan-Meier分析原發癌PAKl表達與淋巴結清掃不全患者無復發生存率(RFS)關系。組1:PAK1低表達患者412:PAK1高表達，淋巴結未轉移患者；組3 =PAKl高表且淋巴結轉移患者；
[0030]圖3D示出了運用Fine-Gray競爭風險模型分析不同PAKl表達的腫瘤特異性死亡率(cancer-related death)以及腫瘤非特異性死亡率(non-cancer-related death)；
[0031]圖4示出了原發癌PAKl表達是GEJA患者臨床管理中的潛在決策點；
[0032]圖5示出了本發明的癌癥危險分層裝置的第二實施例的原理框圖。
【具體實施方式】
[0033]PAKl是一種激酶，能調節下游信號事件，包括細胞骨架重組，細胞運動，和上皮-間質轉化。令人鼓舞的證據表明，許多腫瘤對PAKl抑制劑有反應。我們的研究發現P21活化蛋白激酶I (PAKl)作為預后的生物標志物，在GEJA中其過度表達與預后不良相關。為了確定一個生物標志物運用到臨床上以補充和改善GEJA的了匪分期在淋巴結清掃不全所致的不準確性；我們檢測了原發癌PAKl表達是否可以預測淋巴結轉移。并且，我們分析了配對的原發GEJA和LN的病理樣本，研究在原發癌中PAKl表達是否能預測淋巴結中PAKl水平，且PAKl是否是GEJA淋巴結轉移和腫瘤相關的臨床結局的獨立預測因素。基于以上研究，我們開發出了一種癌癥危險分層裝置，其可以采用PAKl可以單獨的將癌癥患者分層，準確預測患者癌癥轉移風險，因而更加有利地以引導癌癥進一步的術后管理。
[0034]圖1示出了本發明的癌癥危險分層裝置的原理框圖。如圖1所示，本發明的癌癥危險分層裝置包括:作為癌癥危險分層生物標志物的PAK1300、免疫組化檢測試劑盒100和危險分層模塊200。在本實施例中，免疫組化檢測試劑盒100用于免疫染色所述PAKl從而檢測所述PAKl的蛋白表達。所述危險分層模塊200基于所述PAKl的蛋白表達將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
[0035]下面對本發明的原理做進一步的說明如下。在本實施例中，是針對淋巴結清掃不全的GEJA患者進行說明的，但是本領域技術人員知悉，除了 GEJA患者以外，對于其他的淋巴結清掃不全的癌癥患者都適用本發明的裝置和方法。實際上，基于本發明的研究表明，基本上本發明的裝置、方法和癌癥危險分層生物標志物PAKl適用于任何和PAKl相關的癌癥患者(樣本)的劃分。
[0036]為研究PAKl蛋白表達在淋巴結清掃不全的GEJA患者中對其生存預測的價值，免疫組化檢測試劑盒100運用免疫組化(IHC)用來衡量淋巴結清掃不全的GEJA患者的組織切片中的PAKl的蛋白水平。采用10%福爾馬林緩沖液固定石蠟包埋手術標本，組織切片4微米/張。根據標準步驟進行脫蠟、水化、內源性過氧化物酶阻斷和抗原修復，孵育兔抗人PAKl多克隆抗體(1:00 ；Cell Signaling, Beverly, MA，USA) 4°C過夜，通過標準光學顯微鏡評估PAKl胞漿染色，蘇木精進行細胞核染色。陰性對照可采用免疫前的免疫球蛋白G替代PAKl抗體孵育。
[0037]在本發明的一個優選實施例中，免疫組化檢測過程如下:
[0038]1、脫蠟和水化
[0039]將組織切片放于60°C烤箱中烘烤20分鐘左右(10分鐘后看一次)，室溫冷卻Ih
[0040]I)組織片置于二甲苯A、B、C中各浸泡30分鐘(可適當延長時間，但勿過夜)
[0041]2)無水乙醇A、B中各浸泡5分鐘(無水乙醇B可過夜)
[0042]3)3% H2O2 (純甲醇稀釋:20ml30%H202+180ml甲醇配成200ml溶液)，室溫浸泡20分鐘(去除細胞中的內源性過氧化物酶)
[0043]4)無水乙醇C中浸泡5分鐘
[0044]5) 90%乙醇中浸泡3分鐘
[0045]6) 80%乙醇中浸泡3分鐘
[0046]7) 70%乙醇中浸泡3分鐘
[0047]8)蒸餾水中浸泡3分鐘
[0048]2、抗原修復(微波熱修復)
[0049]檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ6.0):
[0050]貯存液:0.1M檸檬酸溶液(A):21.0lg檸檬酸IL蒸餾水
[0051]0.1M檸檬酸三鈉溶液(B):29.41g檸檬酸三鈉IL蒸餾水
[0052]工作液:1.8ml A 液 +8.2ml B 液 +90ml 蒸餾水一100ML
[0053]5.4ml A 液 +24.6ml B 液 +270ml 蒸餾水—300ML
[0054]9ml A 液 +41ml B 液 +450ml 蒸懼水一5OOML
[0055]將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，別蓋緊，置微波爐內加熱使其溫度保持在92°C?98 °C之間并持續12分鐘左右(98°C最佳)。
[0056]500ml抗原修復液微波修復的具體步驟:高火2分鐘+低火5分鐘(觀察是否溫度穩定)+低火12分鐘，取出容器，冷卻至室溫(約Ih)。
[0057]ddH202 分鐘 X 2，TBST5 分鐘 X 3
[0058]3、封閉
[0059]滴加5%正常血清(同二抗來源)+5% BSA(TBST稀釋)封閉液，室溫lh，封閉后無需TBST沖洗即可直接一抗孵育
[0060]封閉液配方:750ulTBST+200ul5% BSA+50ul 正常血清(羊血清)=Iml
[0061]4、一抗孵育
[0062]加1% BSA(TBST稀釋)一抗，4°C過夜(貼上封口膜)
[0063]次日，TBST5分鐘 X 3
[0064]5、二抗孵育
[0065]加I % BSA (TBST 稀釋)二抗，室溫 Ih (45 分鐘后配 ABC 液)TBST5 分鐘 X 3，ddH205分鐘
[0066]6、ABC[0067]配方:1ml PBS+10ul A液+IOul B液，混勻，室溫避光30分鐘再滴加到玻片上，室溫孵育避光孵育Ih TBST5分鐘X 3，ddH20洗5分鐘
[0068]7、DAB顯色,避光(染二抗)(過氧化物酶的DAB培養試劑盒(SK-4100)
[0069]配方:
[0070]800ul = 760ul ddH20+10ul 緩沖液(混勻)+20ul DAB (混勻)+ IOul H2O2 (混勻)(約16張片子)
[0071]600ul = 570ul ddH20+7.5ul 緩沖液(混勻)+15ul DAB (混勻)+7.5ul H2O2 (混勻)(約12張片子)
[0072]400ul = 380ul ddH20+5ul 緩沖液(混勻)+ IOul DAB (混勻)+5ul H2O2 (混勻)(約8張片子)
[0073]200ul = 190ul ddH20+2.5ul 緩沖液(混勻)+5ul DAB (混勻)+2.5ul H2O2 (混勻)(約4張片子)
[0074]顯色后水龍頭下細水流沖掉顯色液，ddH20洗5分鐘
[0075]8、蘇木素復染:10分鐘(適當調整時間)
[0076]9、自來水沖洗5分鐘
[0077]10、1%鹽酸酒精分化3秒。
[0078]11、自來水沖洗5分鐘
[0079]12、飽和氯化鋰20秒(使核染更透亮)
[0080]13、自來水沖洗30分鐘
[0081]14、脫水:70%酒精一80%—90%— 100% A- 100% B(無水乙醇 5 分鐘，其余 3分鐘)
[0082]15、透明:二甲苯A—二甲苯B，各5分鐘
[0083]16、封片
[0084]本領域技術人員知悉，除上述方法、步驟、試劑和抗體之外，本領域技術人員可以采用本領域中任何已知的方法、步驟、試劑和抗體實施上述PAKl的蛋白水平的免疫組化檢測。在此本發明不受到任何具體免疫組化檢測方法的限制。
[0085]評估PAKl免疫染色。每張切片評估十個隨機顯微鏡400 X視野。采用半定量組織學得分(H-score)對PAKl染色進行評估，包括染色強度和陽性細胞數。陽性染色細胞的平均百分比評分如下:0% (O 分)；1%-25% (I 分)；26%-50% (2)分；51%-75% (3 分)；and76% -100% (4分)。染色強度分為:無染色(O分)，弱染色(I分)，中度染色(2分)和強染色(3分)。樣本H-score =陽性細胞比例分數X染色強度。本領域技術人員知悉，為了降低誤差，可以采用多個病理學家單盲情況下獲得的評估結果的平均值作為實際評價結果。
[0086]隨后，所述危險分層模塊200采用受試者工作特征(ROC)曲線通過H-score來預測GEJA患者的臨床病例特征和臨床結果的潛能。根據擁有最佳的靈敏度和特異性的PAKlH-score將研究樣本劃分PAKl高表達組和低表達組，以便進一步的統計學分析，例如采用二分法分類協變量進行統計學分析。
[0087]為了證明PAKl在原發癌組織和配對淋巴結轉移癌組織中表達的相關性，我們進行一下實驗討論。 申請人:分析了大量淋巴結清掃不全的胃食管交界腺癌病人，取得他們同一次手術中的原發癌和配對淋巴結病理標本。患者年齡由35歲到80歲不等(中位年齡60歲)，術后當天開始隨訪，中位隨訪期為33.5個月(從I到76個月不等)。隨訪過程中，66例(60.0% )死于腫瘤復發或轉移。運用IHC檢測患者病理標本中的PAKl蛋白表達。癌旁正常黏膜組織、原發癌、淋巴結組織中不同程度的PAKl蛋白如圖2A所示。陰性對照使用免疫球蛋白G(未發現非特異性染色)。此外，淋巴結陰性患者原發癌的PAKlH-score比淋巴結陽性(轉移)患者低(依次為 6.865±3.376,9.370±2.530，Ρ〈.001，Student’s T 檢驗，圖2B)。淋巴結轉移癌組織中的PAKlH-score顯著高于其原發癌組織(P =.001 ；one-way方差分析，Tukeys 檢驗)(分別為 10.07 ± 2.485 (SD) ；8.527 ± 3.067)，這兩者的 H-score 也顯著高于癌旁正常黏膜組織(4.500±1.445)(兩者P〈.001)(圖2C)。陰性淋巴結中沒有癌細胞存在，故陰性淋巴結的PAKlH-score評分以正常淋巴結組織中PAKl的背景表達為主。淋巴結組織中的PAKlH-score與原發癌呈正相關(P〈.001 ；r = 0.475 ；Spearman秩相關，圖2D)。因此，這些數據表明，PAKl表達的增強與腫瘤淋巴結轉移相關。
[0088]上述結果說明淋巴轉移癌組織中的PAKlH-score與原發癌相關，而且原發癌樣本的PAKl - score在臨床上更容易得到，因此說明原發癌PAKl表達可用于胃食管結合部腺癌淋巴結清掃不全患者的預后分層。
[0089]為驗證該假設，我們通過檢測PAKl是否可以預測淋巴結清掃不全的胃食管結合部腺癌患者的OS和RFS，進而作為--Μ分期相關預測的補充。
[0090]為了實施上述檢測，我們采用了圖5示出了本發明的癌癥危險分層裝置的第二實施例的原理框圖。如圖5所示，本發明的癌癥危險分層裝置作為癌癥危險分層生物標志物的PAK1300、免疫組化檢測試劑盒100和危險分層模塊200。其中作為癌癥危險分層生物標志物的PAK1300、免疫組化檢測試劑盒100可與上述實施例相同，而危險分層模塊200包括半定量組織學積分計算單元210、節點計算單元220和分層單元230。其中半定量組織學積分計算單元210用于評估免疫染色的所述PAKl的半定量組織學積分。所述節點計算單元220采用受試者工作特征曲線的曲線下面積區域計算所述PAKl的半定量組織學積分的分層節點積分。所述分層單元230基于所述分層節點積分和所述PAKl將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
[0091]下面對其工作原理詳細說明如下。首先，我們使用ROC曲線來確定診斷性能和合適的分界點(CUt-OfT值)，從而將 連續型臨床病理參數變量轉換為二分類協變量以便于進行統計分析。對預測總生存率(OS)的準確性方面，根據AUC (曲線下面積)，我們發現原發癌PAKlH-score與淋巴結(LN)PAKlH-score、組織學分級、淋巴結轉移情況、腫瘤大小、浸潤深度、?M分期以及淋巴結切除數目等進行對比，擁有最高的預測準確性(圖3A)。其AUC達 0.766。
[0092]根據AUC我們選取兼顧靈敏度與特異度最佳的原發癌PAKlH-score評分臨界值為7，然后我們對患者進行歸類，71.8% (79/110)的患者歸為PAKl高表達組((H-score≥7)，而剩下的患者歸為PAKl低表達組(H-SCOre〈7)。原發癌PAKl過表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、praM分期晚期以及術后復發相關(分別為P = 0.004，Ρ〈0.001，P = 0.001和P =
0.006)。因此，原發癌PAKl高表達與淋巴結清掃不全的胃食管結合部腺癌的淋巴結轉移及TW分期晚期顯著相關。
[0093]淋巴結清掃不全的胃食管結合部腺癌(GEJA)患者中，單因素Kaplan-Meier分析總生存率(OS)的結果表明:原發癌PAKl低表達組(圖3B，組I)的總生存率明顯優于PAKl高表達但無淋巴結轉移組(圖3B，組2 ;中位生存期=38.2個月)以及PAKl高表達并有淋巴結轉移組(圖3B，組3 ;中位生存期=29.4個月)。而組2和組3生存率沒有顯著差異(Long Rank檢驗,P = 0.126)。同樣的,這些患者單因素Kaplan-Meier分析無復發生存率(RFS)的結果表明:PAK1低表達組(圖3C，組I)的無復發生存率明顯優于(P〈0.001) PAKl高表達但無淋巴結轉移組(圖3C，組2 ;中位無復發生存期=34.8個月)以及PAKl高表達并有淋巴結轉移組(圖3C，組3 ;中位生存期=26.2個月)。組2和3復發生存率也沒有顯著差異(Long Rank檢驗，P = 0.157)。因此，淋巴結清掃不全的胃食管結合部腺癌患者中原發癌PAKl高表達與預后相關，而淋巴結是否轉移與預后無明顯相關。
[0094]如表I所不納入臨床傳統預后相關的協變量(含原發癌PAKl聞表達)，運用多因素Cox比例風險模型預測總生存率(OS)的分析結果顯示:組織學分級3級(對比分級I級、2 級)，死亡風險增高(HR= 1.976 ；95% Cl = 1.113 - 3.510) (P = 0.020);查爾森合并癥指數(CCI) > 7 死亡風險增高(HR = 21.73 ；95% Cl = 2.9 - 163.388) (P =.003), M且原發癌PAKl高表達者與PAKl低表達者對比也存在此情況，即PAKl高表達者死亡風險增高(HR = 5.322 ；95% Cl = 2.052 - 13.802) (Ρ〈0.001)。同樣地，運用多因素 Cox 風險模型來預測無復發生存率(RFS)也顯示類似結果:組織學分級3級復發風險增高(HR = 1.982 ；95% Cl = 1.124 - 3.496) (P = 0.018);查爾森合并癥指數(CCI) > 7復發風險增高(HR=13.045 ；95% Cl = 3.044 - 55.901) (Ρ〈0.001);原發癌PAKl高表達者其復發風險也增高(HR = 3.759 ；95% Cl = 1.708 - 8.272) (Ρ〈0.001)。
[0095]表1.LN切除不全的110病人的總存活率和復發自由生成率的多變量COX比例模
型預測
[0096]
【權利要求】
1.一種癌癥危險分層裝置，其特征在于，包括: 作為癌癥危險分層生物標志物的PAKl ； 免疫組化檢測試劑盒，用于免疫染色所述PAKl從而檢測所述PAKl的蛋白表達； 危險分層模塊，基于所述PAKl的蛋白表達將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
2.根據權利要求1所述的癌癥危險分層裝置，其特征在于，所述危險分層模塊包括: 半定量組織學積分計算單元，用于評估免疫染色的所述PAKl的半定量組織學積分； 節點計算單元，采用受試者工作特征曲線的曲線下面積區域計算所述PAKl的半定量組織學積分的分層節點積分； 分層單元，基于所述分層節點積分和所述PAKl將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
3.根據權利要求2所述的癌癥危險分層裝置，其特征在于，所述免疫組化檢測試劑盒包括:兔抗人PAKl多克隆抗體，二抗，顯色用的DAB和用于進行染色的蘇木精。
4.根據權利要求3所述的癌癥危險分層裝置，其特征在于，所述PAKl的病理樣本經過組織切片后進行脫蠟、水化、內源性過氧化物酶阻斷和抗原修復，隨后在孵育兔抗人PAKl多克隆抗體過夜，二抗孵育一小時，DAB顯色，并采用蘇木精進行染色。
5.根據權利要求2所述的癌癥危險分層裝置，其特征在于，所述半定量組織學積分計算包括獲取染色強度和陽性細胞比例分數，所述半定量組織學積分為所述染色強度和陽性細胞比例份數的乘積。
6.根據權利要求1-5中任一權利要求所述的癌癥危險分層裝置，其特征在于，所述PAKl來自淋巴結清掃不全的癌癥患者。
7.根據權利要求6所述的癌癥危險分層裝置，其特征在于，所述癌癥包括胃食管結合部腺癌。
8.PAKl在制備用于對癌癥危險進行分層的癌癥危險分層生物標志物中的應用，其特征在于，所述癌癥危險分層生物標志物基于所述PAKl的蛋白表達將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
9.一種癌癥危險分層生物標志物，其特征在于，所述癌癥危險分層生物標志物為PAK1，所述癌癥危險分層生物標志物基于所述PAKl的蛋白表達將所述PAKl的病理樣本劃分為PAKl高表達組和PAKl低表達組。
10.根據權利要求9所述癌癥危險分層生物標志物，其特征在于，所述癌癥包括胃食管結合部腺癌。
【文檔編號】G01N33/574GK103913570SQ201410111348
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2014年3月24日
【發明者】張灝 申請人:張灝