一種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚a的方法

一種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚a的方法
【專利摘要】本發明公開了一種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，該方法中雙酚A在H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮等為氧化劑的條件下，被辣根過氧化物酶催化發生聚合反應，形成雙酚A聚合物，鐵金合金納米顆粒溶膠表面的鐵離子與雙酚A聚合物中的酚羥基發生配位作用而使鐵金合金納米顆粒發生聚集，聚集后鐵金合金納米顆粒的表面狀態改變，表面狀態的變化使得其等離子共振吸收發生改變，表現為520nm處吸收變小，720nm處吸收迅速變大，以已知濃度的雙酚A溶液為標準品，鐵金合金納米顆粒溶膠為檢測物，建立雙酚A的標準曲線,通過雙酚A的標準曲線可以準確測量實際雙酚A樣品的濃度。該方法成本低廉，且具有檢測通量高、準確和速度快的優點。
【專利說明】—種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，屬于食品和日常用品安全檢測【技術領域】。
技術背景
[0002]雙酚A(Bisphenol A，縮寫為BPA)，一種有機化合物，具有兩個酚官能團。在工業上雙酚A被用來合成聚碳酸酯(PC)和環氧樹脂等材料，60年代以來就被用于制造塑料(奶)瓶、幼兒用的吸口杯、食品和飲料(奶粉)罐內側涂層。后來，人們發現BPA能導致內分泌失調，威脅著胎兒和兒童的健康。癌癥和新陳代謝紊亂導致的肥胖也被認為與此有關。2012年9月24日，美國華盛頓州立大學等機構刊登其研究，公布其在獼猴進行的實驗結果，證實雙酚A會影響獼猴雌性后代的生殖系統，導致卵子染色體異常(Hunt，Patricia A.et.al.PNAS.2012，109(43) 17525-17530)。雖然目前各國已先后禁止了雙酚A在嬰兒奶瓶中的應用，但是在日常成人飲水杯，熱敏紙，食品包裝材料等領域仍有著廣泛的應用。由于雙酚A的大量使用，環境中雙酚A也普遍存在，如自然水體，雨水等都能檢出不同濃度的雙酚A。
[0003]目前國內僅出臺了聚合物材料中雙酚A檢出的國家標準，國標采用高效液相色譜來實現雙酚A的檢出，檢出靈敏可靠，然而檢出前處理步驟麻煩，依賴大型儀器，檢測通量不高。對于雙酚A這樣普遍存在的環境污染物而言，快速高通量篩查技術可與高效液相色譜技術形成互補，實現大規模檢測和樣品篩查。快速檢測技術是檢測領域的一塊很有競爭力的方向，快速檢測技術具有檢測方法簡單易行，檢測時間短，不需要大型儀器，甚至無需依賴儀器。盡管快速檢測由于靈敏度和特異性方面的限制，不能作為判定樣品安全性的最終依據；但作為發現問題的第一步，它具有不可替代的作用。事實上，一些突發食源性事件的現場調查也往往以快速檢測作為篩查的第一步。目前雙酚A快速檢測技術還處于初步發展階段，比較常用的有抗體標記納米金試紙條法，利用納米金標記抗體識別雙酚A，抗體雙酚A復合物被捕獲后形成紅色條帶實現檢測。該方法只能提供有或無的結果，而且檢測使用抗體成本較高，無法真正用于大規模篩查。因此，開發一種具有定量能力、成本低廉、快速且檢測通量高的雙酚A檢測方法十分必要。

【發明內容】

[0004]本發明提供了一種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，該方法能對雙酚A進行定量和半定量分析，成本低廉，且具有檢測通量高、準確和速度快的優點。
[0005]實現本發明目的所采取的技術方案為:
[0006]一種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，將檸檬酸鈉溶液加入含有金源、鐵源的溶液中，在加熱的條件下進行反應，制得鐵金合金納米顆粒溶膠，以已知濃度的雙酚A溶液為標準品，鐵金合金納米顆粒溶膠為檢測物，在H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮中的一種，與辣根過氧化物酶共同存在的條件下，鐵金合金納米顆粒發生聚集，檢測含不同已知濃度的雙酚A溶液的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標，以2為底雙酚A濃度的對數為橫坐標，根據檢測的數據繪圖，擬合后得到雙酚A的標準曲線，根據標準曲線得到標準曲線的函數關系式y=kx+b，以實際雙酚A樣品為被檢測物，鐵金合金納米顆粒溶膠為檢測物，在H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮中的一種，與辣根過氧化物酶共同存在的條件下，鐵金合金納米顆粒發生聚集，檢測含實際雙酚A樣品的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入函數關系式的y值中，計算出x值，再根據x值計算出實際雙酚A樣品的濃度。
[0007]所述的鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，包括如下步驟:
[0008]I)鐵金合金納米顆粒溶膠的制備:
[0009]①按摩爾比鐵源:鐵源和金源=0.001: I?0.6: 1，在帶有攪拌器和回流管的反應容器中加入含有金源和鐵源的溶液，溶液中金源的濃度為0.4?2mM，鐵源的濃度為I μ M?0.6mM，持續加熱反應容器中的溶液，同時攪拌溶液，溶液沸騰后，當回流管中的回流量穩定時，按摩爾比檸檬酸鈉:鐵源和金源=2:1?5:1，將檸檬酸鈉溶液倒入反應容器中至檸檬酸鈉溶液的終濃度為2?5mM ;
[0010]②繼續回流至反應容器中的溶液呈穩定的紅色時，停止加熱，讓反應容器中的溶液冷卻至室溫，過濾，得到鐵金合金納米顆粒溶膠；
[0011]2)建立雙酚A的標準工作曲線:
[0012]①在酶標儀微孔板的6個以上的孔中分別加入體積相同、不同已知濃度的標準雙酚A溶液，再分別加入過量的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，催化量的辣根過氧化物酶溶液和過量的鐵金合金納米顆粒溶膠，作為6個以上的實驗組，其中6個以上的實驗組中加入的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，辣根過氧化物酶溶液和鐵金合金納米顆粒溶膠完全相同，在另一個微孔板的一個中，先加入與各實驗組中的雙酚A溶液等體積的水，再加入與各實驗組相同的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，辣根過氧化物酶溶液和鐵金合金納米顆粒溶膠，作為陰性對照組，10?42°C孵育至各實驗組與陰性對照組相比有色差后，檢測各實驗組中含已知濃度的雙酚A的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度；
[0013]②以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標，以2為底雙酚A濃度的對數為橫坐標，根據各實驗組檢測的數據進行繪圖，擬合后得到雙酚A的標準曲線，根據標準曲線得到標準曲線的函數關系式y=kx+b ；
[0014]3)實際雙酚A樣品濃度的測定:
[0015]①在酶標儀微孔板的一個中先加入與步驟2)中各實驗組等體積的實際雙酚A樣品，再加入與步驟2)中各實驗組相同的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，辣根過氧化物酶溶液和鐵金合金納米顆粒溶膠，10?42°C孵育至出現色差后，檢測含實際雙酚A樣品的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標準曲線的函數關系式的y值中，計算出X值，再根據X值計算出實際雙酚A樣品的濃度。
[0016]步驟I)中的反應容器在使用前依次用自來水，反滲透水洗漆，MilliQ水浸泡過夜，王水洗滌，再用MilliQ水浸泡洗滌干凈，并用烘箱烘干。
[0017]所述金源為HAuCl4、NaAuCl4.2H20 或 KAuCl4.2H20，鐵源為 FeCl3 或 FeCl2。[0018]按摩爾比鐵源:鐵源和金源=0.1: I時制備的鐵金合金納米顆粒溶膠檢測雙酚A時的響應最好。
[0019]所述辣根過氧化物酶溶液的濃度為0.1?20 μ M。
[0020]所述H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液的質量體積濃度為
0.003%_1%。
[0021]在上述技術方案中，辣根過氧化物酶是催化劑，用來催化雙酚A聚合，只需要使用催化量的即能達到目的，H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮是氧化劑，用來氧化雙酚A聚合，H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮等氧化劑一定要確保過量，確保加入的標準雙酚A能完全被氧化聚合，鐵金合金納米顆粒溶膠是檢測物，與雙酚A聚合物發生配位作用，為了使加入的標準雙酚A被完全檢測出來，鐵金合金納米顆粒溶膠的量與雙酚A聚合物的量相比應確保是過量的。在實際操作過程中，繪制雙酚A的標準曲線時，由于雙酚A的量是已知的，H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮等氧化劑可以根據雙酚A的量來確定的，鐵金合金納米顆粒溶膠的量與雙酹A聚合物的量相比應確保是過量的，同時還應確保鐵金合金納米顆粒溶膠對雙酚A的響應靈敏度在數量級上保持穩定并且在520nm和720nm處光密度之比值的變化幅度不超過10%。
[0022]由上述技術方案可知，該方法中雙酚A在H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮等為氧化劑的條件下，被辣根過氧化物酶催化發生聚合反應，形成雙酚A聚合物，鐵金合金納米顆粒溶膠表面的鐵離子與雙酚A聚合物中的酚羥基發生配位作用而使鐵金合金納米顆粒發生聚集，聚集后鐵金合金納米顆粒的表面狀態改變，表面狀態的變化使得其等離子共振吸收發生改變，表現為520nm處吸收變小，720nm處吸收迅速變大，以已知濃度的雙酚A溶液為標準品，鐵金合金納米顆粒溶膠為檢測物，建立雙酚A的標準曲線，通過雙酚A的標準曲線可以準確測量實際雙酚A樣品的濃度，即對雙酚A樣品進行定量分析，不僅僅是簡單的定性分析和半定量分析。
[0023]本發明與現有技術相比，其優點和有益效果在于:
[0024]I)該方法用鐵金合金納米顆粒溶膠作為檢測物，而合成鐵金合金納米顆粒溶膠的方法簡單，條件易控制，特別是合成過程中所使用的試劑和儀器均為常用試劑和普通儀器，價格低廉，因而用鐵金合金納米顆粒溶膠作為檢測物使該方法檢測的成本低。
[0025]2)該方法通過建立標準曲線對雙酚A進行定量分析，標準曲線的線性范圍為
0.5?16mg/L，當雙酚A的濃度在此線性范圍內時，采用該方法進行檢測，檢測結果十分準確、可靠，當不在此范圍內，稍有偏差，可進行半定量分析，而且操作簡單，快速，靈敏度高，檢出限低。
[0026]3)該方法所使用的試劑均為普通試劑，所使用的檢測儀器為酶標儀，酶標儀為常用儀器，因此，該方法的檢測成本低。
[0027]4)該方法可同時進行大量的雙酚A樣品分析，檢測通量高。
[0028]5)該方法還可進行定性分析，當進行定性檢測時，鐵金合金納米顆粒顏色變化可用肉眼直接比色判讀。
[0029]6)該方法制備的鐵金合金納米顆粒溶膠性質穩定，可長期放置，長期存放后對檢測效果幾乎沒有影響，因此，使用該方法檢測雙酚A時不用現場制備鐵金合金納米顆粒溶膠，可使用庫存的鐵金合金納米顆粒溶膠，方便快捷，節省時間。【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為按摩爾比鐵源:鐵源和金源=0.1~0.6:1時合成的鐵金合金納米顆粒溶膠檢測雙酚A的響應效果圖。
[0031]圖2為按摩爾比鐵源:鐵源和金源=0.001~0.1:1時合成的鐵金合金納米顆粒溶膠檢測雙酚A的響應效果圖。
[0032]圖3為實施例1中按摩爾比鐵源:鐵源和金源=0.1:1時制備的鐵金合金納米顆粒溶膠檢測雙酚A的標準曲線。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發明做進一步的具體說明。
[0034]實施例1
[0035]I)鐵金合金納米顆粒溶膠的制備:
[0036]①將所有涉及本實驗的實驗儀器依次用自來水，反滲透水洗滌，MilliQ水浸泡過夜，王水洗滌，再用MilliQ水浸泡洗滌干凈，并用烘箱烘干。在帶有攪拌器和回流管的三口圓底燒瓶中加入500mL濃度為0.4mM HAuCl4溶液和濃度為0.6mM FeCl3溶液，此處的FeCl3溶液可用FeCl2溶液代替，HAuCl4溶液可以用NaAuCl4.2H20或KAuCl4.2H20溶液代替。三口圓底燒瓶的中間口接入攪拌器，一斜口接回流管，另一斜口塞磨口玻璃塞。持續加熱三口燒瓶中的溶液，同時開啟攪拌器攪拌溶液，溶液沸騰后，當回流管中的回流量趨于穩定時，將事先配制好的50mL濃度為38.8mM檸檬酸鈉溶液倒入三口圓底燒瓶中至檸檬酸鈉的終濃度為 3.53mM。
[0037]②繼續 回流至三口圓底燒瓶中的溶液呈穩定的紅色時，停止加熱，讓三口圓底燒瓶中的溶液自然冷卻2小時至室溫，用0.22 μ m無菌濾器過濾冷卻的鐵金合金納米顆粒溶液，得到鐵金合金納米顆粒溶膠。
[0038]2)檢測雙酚A時鐵金合金納米顆粒溶膠中鐵源的最適比例的優化:
[0039]①調整HAuCl4 溶液為 0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、0.99mM、0.999mM 和 ImM，FeCl3 溶液的濃度分另Ij 0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM、0.lmM、0.01mM、0.0OlmM 和 OmM,其它不
變，按照步驟I)的方法制備9組鐵金合金納米顆粒溶膠。在酶標儀微孔板的9個孔中分別加入40 μ L100mg/L的BPA溶液，5 μ L3 μ M的辣根過氧化物酶溶液，5 μ L質量體積濃度為
0.3%的H2O2溶液，再分別加入200 μ L上述制備的9組鐵金合金納米顆粒溶膠，37°C孵育至有明顯色差后，檢測9組含雙酚A溶液的鐵金合金納米顆粒溶膠在波長為520nm和720nm處的光密度；
[0040]②不同FeCl3與FeCl3和HAuCl4兩者的摩爾比制備的鐵金合金納米顆粒溶膠對雙酚A的響應不同，檢測的結果如圖1、圖2所示，由圖1和圖2可以看出，當？6(:13與？6(:13和HAuCl4兩者的摩爾比為FeCl3:(FeCl3+HAuCl4)=0.1時，制備的鐵金合金納米顆粒溶膠對雙酚A的響應最好。
[0041]3)建立雙酚A的標準曲線:
[0042]①按FeCl3溶液的濃度為0.1mM^HAuCl4溶液的濃度為0.9mM,其他不變，以步驟I)的方法制備鐵金納米顆粒溶膠；[0043]②在酶標儀微孔板的6個孔中分別加入40μ L3.125mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L和lOOmg/L的標準雙酚A溶液，再分別加入5 μ L3 μ M的辣根過氧化物酶溶液，5 μ L質量體積濃度為0.3%的H2O2溶液和200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為6個實驗組，在另一個微孔板的一個中加入40 μ L水，5 μ L3 μ M的辣根過氧化物酶溶液，5 μ L質量體積濃度為0.3%的H2O2溶液和200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為陰性對照組，37°C孵育至各實驗組與陰性對照相比有明顯色差后，檢測各實驗組中含已知濃度的雙酚A溶液的鐵金合金納米顆粒溶膠在波長在520nm和720nm處的光密度；
[0044]③以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標，以2為底雙酚A濃度的對數為橫坐標，根據各實驗組測得的數據繪圖，擬合后得到雙酚A的標準曲線，如圖3所示，根據標準曲線得到標準曲線的函數關系為:y=0.0622x+0.0053，R2=0.9806，其中，y為鐵金合金納米顆粒溶膠在波長在520nm和720nm處的光密度，x為2為底雙酚A濃度的對數，k=0.0622為標準曲線的斜率，b=0.0053為標準曲線與y軸的截距，雙酚A濃度的線性范圍為0.5?16mg/L，線性良好，可用于雙酚A的定量分析，結果準確、可靠。
[0045]4)實際樣品的測試
[0046]①在酶標儀微孔板的一個中先加入40μ L實際雙酚A樣品，再加入5μ L3yM的辣根過氧化物酶溶液，5 μ L質量體積濃度為0.3%的H2O2溶液和200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，37°C孵育至出現色差后，檢測含實際雙酚A樣品的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標準曲線的函數關系式y值中，計算出X值，再根據X值計算出實際雙酚A樣品的濃度。
[0047]實施例2
[0048]I)鐵金合金納米顆粒溶膠的制備:
[0049]①將所有涉及本實驗的實驗儀器依次用自來水，反滲透水洗滌，MilliQ水浸泡過夜，王水洗滌，再用MilliQ水浸泡洗滌干凈，并用烘箱烘干。在帶有攪拌器和回流管的三口圓底燒瓶中加入500mL濃度為0.9mM HAuCl4溶液和濃度為0.1mM FeCl3溶液。三口圓底燒瓶的中間口接入攪拌器，一斜口接回流管，另一斜口塞磨口玻璃塞。持續加熱三口燒瓶中的溶液，同時開啟攪拌器攪拌溶液，溶液沸騰后，當回流管中的回流量趨于穩定時，將事先配制好的50mL濃度為38.8mM檸檬酸鈉溶液倒入三口圓底燒瓶中至檸檬酸鈉的終濃度為3.53mM0
[0050]②繼續回流至三口圓底燒瓶中的溶液呈穩定的紅色時，停止加熱，讓三口圓底燒瓶中的溶液自然冷卻4小時至室溫，用0.22 μ m無菌濾器過濾冷卻的鐵金合金納米顆粒溶液，得到鐵金合金納米顆粒溶膠。
[0051]2)不同濃度的辣根過氧化物酶溶液對雙酚A的響應:
[0052]在酶標儀微孔板的6個孔中先分別加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L質量體積濃度為0.3%的H2O2溶液，然后分別加入5 μ L0.1 μ Μ、0.5 μ Μ、I μ Μ、5 μ Μ、10 μ M和20 μ M的辣根過氧化物酶溶液，再分別加入200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為6個實驗組，在另一個微孔板的一個中加入5 μ L水代替辣根過氧化物酶溶液，再加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L質量體積濃度為0.3%的H2O2溶液和200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為空白對照組，10°C孵育各實驗組與空白對照組相比有明顯色差后，檢測各實驗組中鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，辣根過氧化物酶加入的量少則孵育時間長，反之則時間短。
[0053]檢測的結果顯示，不同濃度的辣根過氧化物酶溶液對雙酚A均有響應，且720nm與520nm處光密度的比值遠大于空白對照組。
[0054]實施例3
[0055]I)鐵金合金納米顆粒溶膠的制備:
[0056]①將所有涉及本實驗的實驗儀器依次自來水，反滲透水洗滌，MilliQ水浸泡過夜，王水洗滌，再用MilliQ水浸泡洗滌干凈，并用烘箱烘干。在帶有攪拌器和回流管的三口圓底燒瓶中加入500mL濃度為0.9mM HAuCl4溶液和濃度為0.1mM FeCl3溶液。三口圓底燒瓶的中間口接入攪拌器，一斜口接回流管，另一斜口塞磨口玻璃塞。持續加熱三口燒瓶中的溶液，同時開啟攪拌器攪拌溶液，溶液沸騰后，當回流管中的回流量趨于穩定時，將事先配制好的50mL濃度為38.8mM檸檬酸鈉溶液倒入三口圓底燒瓶中至檸檬酸鈉的終濃度為
3.53mM0
[0057]②繼續回流至三口圓底燒瓶中的溶液呈穩定的紅色時，停止加熱，讓三口圓底燒瓶中的溶液自然冷卻4小時至室溫，用0.22 μ m無菌濾器過濾冷卻的鐵金合金納米顆粒溶液，得到鐵金合金納米顆粒溶膠。
[0058]2 )不同濃度的H2O2溶液對雙酚A的響應:
[0059]在酶標儀微孔板的7個孔中先分別加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L濃度為3 μ M的辣根過氧化物酶溶液，然后分別加入5 μ L質量體積濃度為0.003%,0.005%,0.01%、
0.05%,0.1%、0.3%、1%的H2O2溶液，再分別加入200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為7個實驗組，在另一個微孔板的一個中，加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L濃度為3 μ M的辣根過氧化物酶溶液，5 μ L水和200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為空白對照組，37°C孵育至實驗組與陰性對照組相比有明顯色差后，檢測各實驗組中鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，H2O2加入的量少則孵育時間長，反之時間短。
[0060]檢測的結果顯示，不同濃度的H2O2溶液對雙酚A均有響應，且在720nm與520nm處光密度的比值遠大于空白對照組。
[0061]實施例4
[0062]I)鐵金合金納米顆粒溶膠的制備:
[0063]①將所有涉及本實驗的實驗儀器依次用自來水，反滲透水洗滌，MilliQ水浸泡過夜，王水洗滌，再用MilliQ水浸泡洗滌干凈，并用烘箱烘干。在帶有攪拌器和回流管的三口圓底燒瓶中加入500mL濃度為0.9mM HAuCl4溶液和濃度為0.1mM FeCl3溶液。三口圓底燒瓶的中間口接入攪拌器，一斜口接回流管，另一斜口塞磨口玻璃塞。持續加熱三口燒瓶中的溶液，同時開啟攪拌器攪拌溶液，溶液沸騰后，當回流管中的回流量趨于穩定時，將事先配制好的50mL濃度為38.8mM檸檬酸鈉溶液倒入三口圓底燒瓶中至檸檬酸鈉的終濃度為3.53mM ；
[0064]②繼續回流至三口圓底燒瓶中的溶液呈穩定的紅色時，停止加熱，讓三口圓底燒瓶中的溶液自然冷卻4小時至室溫，用0.22 μ m無菌濾器過濾冷卻的鐵金合金納米顆粒溶液，得到鐵金合金納米顆粒溶膠。
[0065]2)不同的強氧化劑對雙酚A的響應:
[0066]在酶標儀微孔板的4個孔中先分別加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L3 μ M的辣根過氧化物酶溶液，然后分別加入5 μ L質量體積濃度為0.3%的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉和三過氧化三丙酮溶液，再分別加入200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為四個實驗組，在另一個微孔板的一個中加入5 μ L水代替H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，再加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L3 μ M的辣根過氧化物酶溶液和200 μ L鐵金合金納米顆粒溶膠，作為空白對照組，37°C孵育實驗組與空白對照組相比有明顯色差后，檢測各實驗組中鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度。
[0067]檢測的結果顯示，不同的氧化劑對雙酚A均有響應，且在720nm與520nm處光密度的比值遠大于空白對照組。
[0068]實施例5
[0069]I)鐵金合金納米顆粒溶膠的制備:
[0070]①將所有涉及本實驗的實驗儀器依次用自來水，反滲透水洗滌，MilliQ水浸泡過夜，王水洗滌，再用MilliQ水浸泡洗滌干凈，并用烘箱烘干。在帶有攪拌器和回流管的三口圓底燒瓶中加入500mL濃度為0.9mM HAuCl4溶液和濃度為0.1mM FeCl3溶液。三口圓底燒瓶的中間口接入攪拌器，一斜口接回流管，另一斜口塞磨口玻璃塞。持續加熱三口燒瓶中的溶液，同時開啟攪拌器攪拌溶液，溶液沸騰后，當回流管中的回流量趨于穩定時，將事先配制好的50mL濃度為22mM檸檬酸鈉溶液倒入三口圓底燒瓶中至檸檬酸鈉的終濃度為2mM。
[0071]繼續回流至三口圓底燒瓶中的溶液呈穩定的紅色時，停止加熱，讓三口圓底燒瓶中的溶液自然冷卻4小時至室溫，用0.22 μ m無菌濾器過濾冷卻的鐵金合金納米顆粒溶液，得到鐵金合金納米顆粒溶膠。
[0072]②將步驟①中的檸檬酸鈉的終濃度調整為3mM，4mM和5mM，其他不變，按照步驟①的方法制備三組鐵金合金納米顆粒溶膠。
[0073]2)按檸檬酸鈉與鐵源和金源兩者的不同摩爾比制備的鐵金合金納米顆粒溶膠對雙酚A的響應:
[0074]在酶標儀微孔板的4個孔中先分別加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L3 μ M的辣根過氧化物酶溶液，5 μ L質量體積濃度為0.3%的H2O2溶液，再分別加入200 μ L上述制備的四組鐵金合金納米顆粒溶膠，作為4個實驗組，在另一個微孔板的一個中先加入40 μ L100mg/L的雙酚A溶液，5 μ L3 μ M的辣根過氧化物酶溶液和5 μ L質量體積濃度為
0.3%的H2O2溶液，再加入200 μ L水代替鐵金合金納米顆粒溶膠，作為空白對照組，37°C孵育至實驗組與空白對照組相比有明顯色差后，檢測各實驗組中鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度。
[0075]檢測的結果顯示，按檸檬酸鈉與鐵源和金源兩者的不同摩爾比制備的鐵金合金納米顆粒溶膠對雙酚A均有響應，且720nm與520nm處光密度的比值遠大于空白對照組。
【權利要求】
1.一種鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，其特征在于:將檸檬酸鈉溶液加入含有金源、鐵源的溶液中，在加熱的條件下進行反應，制得鐵金合金納米顆粒溶膠，以已知濃度的雙酚A溶液為標準品，鐵金合金納米顆粒溶膠為檢測物，在H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮中的一種，與辣根過氧化物酶共同存在的條件下，鐵金合金納米顆粒發生聚集，檢測含不同已知濃度的雙酚A溶液的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標，以2為底雙酚A濃度的對數為橫坐標，根據檢測的數據繪圖，擬合后得到雙酚A的標準曲線，根據標準曲線得到標準曲線的函數關系式y=kx+b，以實際雙酚A樣品為被檢測物，鐵金合金納米顆粒溶膠為檢測物，在H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮中的一種，與辣根過氧化物酶共同存在的條件下，鐵金合金納米顆粒發生聚集，檢測含實際雙酹A樣品的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入函數關系式的y值中，計算出x值，再根據X值計算出實際雙酚A樣品的濃度。
2.根據權利要求1所述的鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)鐵金合金納米顆粒溶膠的制備: ①按摩爾比鐵源:鐵源和金源=0.001: I~0.6: 1，在帶有攪拌器和回流管的反應容器中加入含有金源和鐵源的溶液，溶液中金源的濃度為0.4~2mM，鐵源的濃度為I μ M~`0.6mM，持續加熱反應容器中的溶液，同時攪拌溶液，溶液沸騰后，當回流管中的回流量穩定時，按摩爾比檸檬酸鈉:鐵源和金源=2:1~5:1，將檸檬酸鈉溶液倒入反應容器中至檸檬酸鈉溶液的終濃度為2~5mM ; ②繼續回流至反應容器中的溶液呈穩定的紅色時，停止加熱，讓反應容器中的溶液冷卻至室溫，過濾，得到鐵金合金納米顆粒溶膠； 2)建立雙酚A的標準工作曲線: ①在酶標儀微孔板的6個以上`的孔中`分別加入體積相同、不同已知濃度的標準雙酚A溶液，再分別加入過量的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，催化量的辣根過氧化物酶溶液和過量的鐵金合金納米顆粒溶膠，作為6個以上的實驗組，其中6個以上的實驗組中加入的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，辣根過氧化物酶溶液和鐵金合金納米顆粒溶膠完全相同，在另一微孔板的一個孔中，先加入與各實驗組中的雙酚A溶液等體積的水，再加入與各實驗組相同的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，辣根過氧化物酶溶液和鐵金合金納米顆粒溶膠，作為陰性對照組，10~42°C孵育至各實驗組與陰性對照組相比有色差后，檢測各實驗組中含已知濃度的雙酚A的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度； ②以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標，以2為底雙酚A濃度的對數為橫坐標，根據各實驗組檢測的數據進行繪圖，擬合后得到雙酚A的標準曲線，根據標準曲線得到標準曲線的函數關系式y=kx+b ； 3)實際雙酚A樣品濃度的測定: ①在酶標儀微孔板的一個孔中先加入與步驟2)中各實驗組中雙酚A溶液等體積的實際雙酚A樣品，再加入與步驟2)中各實驗組相同的H2O2、過碳酸鈉、過硼酸鈉或三過氧化三丙酮溶液，辣根過氧化物酶溶液和鐵金合金納米顆粒溶膠，10~42°C孵育至出現色差后，檢測含實際雙酚A樣品的鐵金合金納米顆粒溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標準曲線的函數關系式的y值中，計算出x值，再根據x值計算出實際雙酚A樣品的濃度。
3.根據權利要求2所述鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，其特征在于:步驟I)中的反應容器在使用前依次用自來水，反滲透水洗滌，MilliQ水浸泡過夜，王水洗滌，再用MilliQ水浸泡洗滌干凈，并用烘箱烘干。
4.根據權利要求2所述鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，其特征在于:所述金源為 HAuC14、NaAuCl4.2H20 或 KAuCl4.2H20,鐵源為 FeCl3 或 FeCl2。
5.根據權利要求2所述鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，其特征在于:按摩爾比鐵源:鐵源和金源=0.1:1時制備的鐵金合金納米顆粒溶膠檢測雙酚A時的響應最好。
6.根據權利要求2所述鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，其特征在于:所述辣根過氧化物酶溶液的濃度為0.1~20 μ M。
7.根據權利要求2所述鐵金合金納米顆粒檢測雙酚A的方法，其特征在于:所述Η202、過碳酸鈉、過硼酸鈉 或三過氧化三丙酮溶液的質量體積濃度為0.003%-1%。
【文檔編號】G01N21/31GK103852431SQ201410111194
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2014年3月24日
【發明者】梁曉聲, 熊海容, 王海英, 郭小華 申請人:中南民族大學