一種酶標免疫試劑盒及其在血清檢測中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種酶標免疫試劑盒，包括抗體預包被反應板、酶標抗體和發光底物液，所述酶標抗體以大豆過氧化物酶SBP為標記酶；所述發光底物液包括H2O2、魯米諾和增強劑；所述增強劑為MORPH（4-馬琳吡啶）和SPTZ（3-（10′-吩噻嗪基）丙基-1-磺酸鹽）。本發明酶標免疫試劑盒引入SBP作為標記酶，一方面此酶的熱穩定性比HRP高，具有底物作用范圍廣，耐熱性能高，酸堿穩定性好，pH適用范圍寬等優點。另一方面，當使用增強劑MORPH和SPTZ增強化學發光時，化學發光信號增強近百倍，檢測靈敏度能夠獲得大大提高。
【專利說明】一種酶標免疫試劑盒及其在血清檢測中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫試劑盒領域，具體涉及一種酶標免疫試劑盒及其在血清檢測中的應用。
【背景技術】
[0002]ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本，因此，也適合于血清流行病學調查。不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用范圍日益擴大。
[0003]在ELISA方法中，過氧化物酶的活性通常是通過過氧化物酶催化過氧化氫(H2O2)氧化底物(如四甲基聯苯胺TMB)獲得的有色產物，用比色法測定有色產物。后來發現基于在H2O2和增強劑的存在下，辣根過氧化物酶(HRP)能夠催化氧化魯米諾，發生“增強化學發光反應”，各種化學發光方法測定酶活的免疫酶試劑盒應運而生。之所以這些增強化學發光反應免疫酶試劑盒得到廣泛應用，是因為此法較比色檢測免疫法靈敏度要高，且在沒有增強劑存在的條件下，HRP催化產生的化學發光信號較低。目前，在HRP催化發光體系中，使用的最為廣泛的增強劑是對碘苯酚(PIP)。但是，反應動力學研究表明，HRP催化的H2O2氧化魯米諾反應檢測到的化學發光強度不穩定。剛開始，在很短時間內，發光強度迅速增強并達到最大值，然后很快降低。這種衰減是由底物氧化反應自由基產物與HRP的連接使得HRP的失活所致。因此，HRP催化致使的魯米諾氧化反應產生的化學發光信號不穩定。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種酶標免疫試劑盒，采用大豆過氧化物酶(SBP)為標記酶，MORPH和SPTZ為增強劑，解決了現有技術中HRP催化致使魯米諾氧化反應產生的化學發光信號不穩定的問題。本發明還提供了該酶標免疫試劑盒在血清檢測中的應用。
[0005]為解決上述問題，本發明采用以下技術方案:
[0006]一種酶標免疫試劑盒，包括抗體預包被反應板、酶標抗體和發光底物液,所述酶標抗體以大豆過氧化物酶為標記酶；所述發光底物液包括H2O2、魯米諾和增強劑；所述增強劑為MORPH (4-馬琳吡啶)和SPTZ (3- (10'-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸鹽)。
[0007]所述抗體預包被反應板經過如下步驟制備得到:
[0008]步驟一、孔板的修飾
[0009]選用全黑的96孔酶標板，修飾抗體緩沖液選用pH9.6的碳酸鹽，將100 μ L濃度為5 μ g/mL Abl抗體加入所述96孔酶標板中包被，4°C過夜孵育；PBST充分洗滌三次，PBS再洗滌三次，輕輕拍干，4°C保存；
[0010]步驟二、封閉非特異性活性位點[0011]用200 μ L2%BSA加入到步驟一制備得到的固定有Abl抗體的96孔酶標板內，室溫封閉2h，PBS洗滌三次，輕輕拍干，4°C保存，其中，所述2%BSA為PBS配制；
[0012]其中，步驟一和步驟二涉及的PBS為IOmM pH7.4,PBST為PBS配制的0.l%Tween。
[0013]所述酶標抗體采用改良過碘酸鈉法制備得到:
[0014]步驟一、取Img大豆過氧化物酶溶于100 μ L PBS中，加入新配制的12.8mg/HiLNaIO4溶液50 μ L，混勻，置室溫15min ；
[0015]步驟二、取出步驟一得到的溶液，后加入9μ L/mL乙二醇PBS溶液50μ L，室溫放置30min ；
[0016]步驟三、向步驟二得到的溶液中加入含2mg純化Ab2抗體，混勻，并裝入透析袋，于50mM pH9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析18h,使大豆過氧化物酶和Ab2抗體結合；
[0017]步驟四、向步驟三得到的溶液中加入5mg/ml NaBH4溶液20 μ L，混勻，置4°C還原2h ；
[0018]步驟五、緩慢加入和步驟四得到的溶液等體積的飽和硫酸銨溶液，輕搖鹽析0.5h，132000g離心15min，去上清，沉淀以少許PBS溶解，裝入透析袋，于大量PBS中4°C透析過夜；
[0019]步驟六、次日取出離心，以除去不溶物，上層清夜即得大豆過氧化物酶_Ab2抗體結合物，以PBS加至500yL;
[0020]步驟七、效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶，低溫保存；
[0021]其中，步驟一至七涉及的PBS為IOmM pH7.4。
[0022]所述發光底物液經過如下步驟制備得到:1.2mM SPTZ、0.6mM MORPH、
0.4mMLuminol 和 0.4mM H2O2 于 50mM pH8.5 的 Tris-HCl 緩沖液。
[0023]上述制備的酶標免疫試劑盒在血清檢測中的應用。
[0024]本發明的原理:研究表明，在沒有增強劑存在下，H2O2氧化魯米諾反應就能夠有效被SBP催化。SBP的另一個特征是:魯米諾氧化產物能夠產生一個持續時間長的化學發光信號。而且，SBP穩定性要比HRP要高，酶的底物作用范圍廣，耐熱性能高，酸堿穩定性好，pH適用范圍寬等優點，這些也是儲存酶免疫試劑的重要參數。當加入增強劑SPTZ和MMORPH時，化學發光強度可繼續增強近百倍，檢測信號得到進一步放大，檢測靈敏度大大提高。
[0025]本發明的有益效果:
[0026]1、本發明酶標免疫試劑盒引入SBP作為標記酶，一方面此酶的熱穩定性比HRP高，具有底物作用范圍廣，耐熱性能高，酸堿穩定性好，PH適用范圍寬等優點。另一方面，當使用增強劑MORPH和SPTZ增強化學發光時，化學發光強度由原有的3.5X IO5提高到1.5X107,化學發光信號可增強近兩個數量級，檢測靈敏度能夠獲得大大提高。
[0027]2、使用本發明酶標免疫試劑盒不僅實現高通量，一份血樣多指標的快速檢測，而且與現有技術相同的操作步驟和檢測儀器，直接可以使用，無需專業操作人員再培訓及儀器、軟件的再開發。因此其產業化研究具有廣泛的應用前景和重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1是本發明酶標免疫試劑盒的實施過程示意圖。
【具體實施方式】[0029]下面結合附圖和實施例對本發明做更進一步的解釋。
[0030]一種酶標免疫試劑盒，包括抗體預包被反應板、酶標抗體和發光底物液,所述酶標抗體以大豆過氧化物酶為標記酶；所述發光底物液包括H2O2、魯米諾和增強劑；所述增強劑為MORPH和SPTZ，以下實施例MORPH和SPTZ購自于Sigma Aldrich。
[0031]實施例1
[0032]本發明酶標免疫試劑盒實施過程如圖1所示。
[0033]本實施例涉及的PBS 為 IOmM pH7.4，PBST 為 IOmM pH7.4PBS 配制的 0.l%Tween。使用的SBP購自美國Bio-Research Products公司。
[0034]第一步，酶標抗體的制備
[0035]采用改良過碘酸鈉法:1、取Img SBP溶于IOOyLPBS中，加入新配制的12.8mg/HiLNaIO4溶液50 μ L，混勻，置室溫15min ;2、取出后加入9 μ L/mL乙二醇PBS溶液50 μ L，室溫放置30min ;3、加入含2mg純化HCG人絨毛促性腺激素抗體(β -HCG),混勻，并裝入透析袋，于50mM pH9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析18h，使SBP和Ab2抗體結合；4、加入5mg/ml NaBH4溶液20 μ L，混勻，置4°C還原2h ;5、在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，輕搖鹽析0.5h，132000g離心15min，去上清，沉淀以少許PBS溶解，裝入透析袋，于大量PBS中4°C透析過夜；6、次日取出離心，以除去不溶物，上層清夜即得SBP-Ab2抗體結合物，以PBS加至500μ L ;7、效價測定合格后，加入等量優質甘油，分裝小瓶，低溫保存。
[0036]第二步，孔板的修飾
[0037]孔板選用全黑、高結合力的96孔酶標板，修飾抗體緩沖液選用為ρΗ9.6的碳酸鹽。將100 μ L濃度為5 μ g/mL a -HCG抗體加入孔板中包被，4°C過夜孵育。PBST充分洗滌三次，PBS再洗滌三次，輕輕拍干，4°C保存。
[0038]第三步，封閉非特異性活性位點
[0039]用200μ L2%BSA(PBS配制)加入上述固定有Abl抗體的孔板內，室溫封閉2h。PBS洗滌三次，輕輕拍干，4°C保存。
[0040]第四步，血清的檢測
[0041]待測血清的檢測:將100 μ L待測血清加入上述封閉好的孔板內，室溫孵育lh，PBST洗滌三次，PBS再洗滌三次，輕輕拍干。
[0042]第五步，酶標抗體的捕獲
[0043]酶標抗體的捕獲:加入100 μ L—定稀釋度(2000 X )的上述制備的酶標抗體于上述孔板內，室溫孵育lh，PBST洗滌三次，PBS再洗滌三次，輕輕拍干。
[0044]第六步，發光底物液加入，發光信號檢測
[0045]首先，優化魯米諾、H2O2, MORPH、SPTZ的濃度以及發光底物液所用緩沖液的pH值，使得發光強度最大。各孔中同時加入優化后的發光底物液:1.2mM SPTZ,0.6mMM0RPH、0.4mMLuminol和0.4mM H2O2于50mM ρΗ8.5的Tris-HCl緩沖液，利用CCD成像立即采集各孔的化學發光信號。因每一孔對應的是血清檢驗中的各個指標，因而，同時可以檢測出同一血清中各指標含量。
[0046]以上所述僅為本發明的較佳實施方式，本發明的保護范圍并不以上述實施方式為限，但凡本領域普通技術人員根據本發明所揭示內容所作的等效修飾或變化，皆應納入權利要求書中記載的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種酶標免疫試劑盒，包括抗體預包被反應板、酶標抗體和發光底物液,其特征在于，所述酶標抗體以大豆過氧化物酶為標記酶；所述發光底物液包括H2O2、魯米諾和增強劑；所述增強劑為MORPH和SPTZ。
2.根據權利要求1所述的酶標免疫試劑盒，其特征在于，所述抗體預包被反應板經過如下步驟制備得到: 步驟一、孔板的修飾 選用全黑的96孔酶標板，修飾抗體緩沖液選用pH9.6的碳酸鹽，將100 μ L濃度為5 μ g/mL Abl抗體加入所述96孔酶標板中包被，4°C過夜孵育；PBST充分洗滌三次，PBS再洗滌三次，輕輕拍干，4°C保存； 步驟二、封閉非特異性活性位點 用200 μ L2%BSA加入到步驟一制備得到的固定有Abl抗體的96孔酶標板內，室溫封閉2h，PBS洗滌三次，輕輕拍干，4°C保存，其中，所述2%BSA為PBS配制； 其中，步驟一和步驟二涉及的PBS為IOmM pH7.4，PBST為PBS配制的0.l%Tween。
3.根據權利要求1所述的酶標免疫試劑盒，其特征在于，所述酶標抗體采用改良過碘酸鈉法制備得到: 步驟一、取Img大豆過氧化物酶溶于100 μ L PBS中，加入新配制的12.811^/111]^^104溶液50 μ L，混勻，置室溫15min ； 步驟二、取出步驟一得到的溶液，后加入9 μ L/mL乙二醇PBS溶液50 μ L，室溫放置30min ； 步驟三、向步驟二得到的溶液中加入含2mg純化Ab2抗體,混勻，并裝入透析袋,于50mMpH9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析18h，使大豆過氧化物酶和Ab2抗體結合； 步驟四、向步驟三得到的溶液中加入5mg/ml NaBH4溶液20 μ L，混勻，置4°C還原2h ； 步驟五、緩慢加入和步驟四得到的溶液等體積的飽和硫酸銨溶液，輕搖鹽析0.5h，132000g離心15min，去上清，沉淀以少許PBS溶解，裝入透析袋，于大量PBS中4°C透析過夜； 步驟六、次日取出離心，以除去不溶物，上層清夜即得大豆過氧化物酶-Ab2抗體結合物，以PBS加至500yL; 步驟七、效價測定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶，低溫保存； 其中，步驟一至七涉及的PBS為IOmM pH7.4。
4.根據權利要求1所述的酶標免疫試劑盒，其特征在于，所述發光底物液經過如下步驟制備得到SPTZ,0.6mM MORPH,0.4mM Luminol 和 0.4mM H2O2 于 5OmM ρΗ8.5 的Tris-HCl緩沖液。
5.權利要求1-4任一權利要求制備的酶標免疫試劑盒在血清檢測中的應用。
【文檔編號】G01N33/543GK103901192SQ201410108594
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】薛艷春, 蘇娟, 車彥軍, 王建江, 毛世琴, 朱偉, 田亦平, 蔣鐫, 翟麗芬, 陶嵐, 劉松琴, 沈麗, 吳慧萍 申請人:靖江市人民醫院, 東南大學