桑葉復方制劑的預處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了桑葉復方制劑的預處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法。預處理方法的步驟：將桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻，再與甘氨酸混合均勻，過濾，即可；其中，所述的桑葉復方制劑的溶液中的溶劑為體積百分比80%的甲醇溶液和/或體積百分比80%-100%的乙醇溶液；所述的緩沖溶液為硼酸鹽緩沖液。所述的檢測方法包括如上所述的桑葉復方制劑的預處理方法。該預處理方法快速方便，分離度好，能精確得到目標物，且穩定性高，靈敏度高，誤差小，該檢測方法檢測結果精確方法，可以客觀的評價復方制劑的產品質量。
【專利說明】桑葉復方制劑的預處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及桑葉復方制劑的預處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法。
【背景技術】
[0002]1_脫氧野尻霉素，中文別名:(2R, 3R, 4R, 5S) _2_輕甲基喊唳_3，4，5_ 二醇、1-去氧野究霉素、多輕基生物堿或1-脫氧氮雜-D-葡萄糖；英文名稱:1-Deoxynojirimycin,簡稱 1-DNJ 或 DNJ ;分子式=C6H13NO4 ;分子量:163.17 ；CAS 號:19130-96-2。
[0003]1-脫氧野尻霉素為白色粉末,可以從桑科植物桑葉(Mulberry Leaf)的枝、葉和根中提取得到，是一種α -葡萄干酶抑制劑，對降低人體血糖值有顯著的作用。
[0004]現有技術中，關于1-脫氧野尻霉素的研究主要集中在1-脫氧野尻霉素的化學成分上。而對于1-脫氧野尻霉素的定性或定量的檢測方法的研究相對較少，因為制劑中1-脫氧野尻霉素的預處理過程較為復雜，使得檢測方法操作復雜并且誤差較大。
[0005]楊海霞用衍生化-分光光度計來測定桑葉單方制劑中1-脫氧野尻霉素的含量(桑葉中DNJ分離純化及含量測定的研究，中國藥科，2003:1)。該方法的預處理過程造成1-脫氧野尻霉素的損失，檢測結果不準確；得到的桑葉提取物及純化物均為有色溶液，對吸光度的測定影響較大，測定結果準確度低。
[0006]現有技術中，1-脫氧野尻霉素的預處理，也僅僅局限于單方制劑中1-脫氧野尻霉素的預處理的研究。對于復方制劑的研究則較少。復方制劑與單方制劑相比，成分及其含量更為復雜，各成分之間的相互作用使得復方制劑中1-脫氧野尻霉素的預處理更為復雜，直接影響了對復方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題在于，克服現有技術中尚沒有針對復方制劑中1-脫氧野尻霉素的預處理方法及其檢測方法的研究的缺陷，提供一種桑葉復方制劑的預處理方法及桑葉復方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法，該預處理方法快速方便，分離度好，能精確得到目標物，且穩定性高，靈敏度高，誤差小，該檢測方法檢測結果精確方法，可以客觀的評價復方制劑的產品質量。
[0008]本發明的發明人，為了精密檢測復方制劑中的1-脫氧野尻霉素，對于桑葉復方制劑的預處理方法進行了大量而深入的研究，在研究過程中，發明人發現:復方制劑與單方制劑相比，成分及其含量更為復雜，僅僅套用單方制劑中1-脫氧野尻霉素的預處理方法，并不能準確有效地提取且檢測復方制劑中的1-脫氧野尻霉素。例如，以鹽酸提取1-脫氧野尻霉素，衍生化后，HPLC分析，樣品分離度不好，峰形出現拖尾或肩峰，含量測定不準確，且測量結果不穩定。
[0009]在經過了長久的研究后，發明人發現:將復方制劑溶解于特定的溶劑中，以特定的衍生化試劑，在特定的緩沖液中進行衍生化反應，可生成具有紫外吸收的絡合物，再進行分離處理，得到的物質能夠通過高效液相色譜-紫外檢測得到，且檢測的準確度、精密度、重復性等效果優異。
[0010]本發明的目的之一在于，提供一種桑葉復方制劑的預處理方法，所述的預處理方法包括以下步驟:
[0011]將桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻，再與甘氨酸混合均勻，過濾，即可；其中，所述的桑葉復方制劑的溶液中的溶劑為體積百分比80%的甲醇溶液和/或體積百分比80%_100%的乙醇溶液；所述的緩沖溶液為硼酸鹽緩沖液。
[0012]以下，針對上述預處理方法的進一步優選的條件，做如下說明:
[0013]本領域技術人員均理解:復方制劑是指兩種或兩種以上的藥物混合制劑。本發明的預處理方法適用于本領域常規的桑葉復方制劑中1-脫氧野尻霉素的預處理。所述的桑葉復方制劑較佳地包括40%-50%的桑葉提取物、25%-35%的苦瓜提取物、12%_17%的黃芪提取物和5%-9%的麥冬提取物，所述百分比為質量百分比。所述的桑葉復方制劑更佳地為希爾牌復方桑葉膠囊。
[0014]本發明中，所述的桑葉復方制劑的溶液的制備方法較佳地為:將所述的桑葉復方制劑溶解于所述的溶劑中，搖勻和/或超聲處理。所述的超聲處理較佳地為在功率100W和頻率40kHz條件下處理20min。
[0015]所述的桑葉復方制劑的溶液中，所述的溶劑的添加量較佳地為每0.2-0.6g桑葉復方制劑添加25mL的溶劑，更佳地為每0.3g桑葉復方制劑添加25mL的溶劑。
[0016]所述的硼酸鹽緩沖液較佳地為硼酸-氯化鉀緩沖液。所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的濃度較佳地為0.2mol/L ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的pH值較佳地為pH8.5 ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的添加量較佳地為每克桑葉復方制劑加入1.67mL的硼酸-氯化鉀緩沖液。
[0017]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的添加量以芴甲氧羰酰氯計，較佳地為每1-3克待測樣品中較佳地添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯，更佳地為每1.5克桑葉復方制劑中較佳地添加IOmmol的荷甲氧羰酰氯。
[0018]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液中的芴甲氧羰酰氯的濃度為20mmol/L。
[0019]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的溶劑較佳地為乙腈。
[0020]所述的桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液的體積比較佳地為1:1:4。
[0021]所述的將桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻的方法和條件為本領域常規的試劑混合的方法和條件。所述的將桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻較佳地為搖勻后進行超聲處理。所述的超聲處理較佳地為在功率100W和頻率40kHz條件下處理20min。
[0022]所述的甘氨酸的添加量較佳地為每克桑葉復方制劑添加0.05-0.1mol的甘氨酸，更佳地為每克桑葉復方制劑添加0.08mol的甘氨酸。
[0023]所述的過濾較佳地為過0.45 μ m的有機系微孔濾膜。
[0024]本發明的目的之二在于，提供一種桑葉復方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法，所述的檢測方法包括以下步驟:(I)將桑葉復方制劑進行如上所述的桑葉復方制劑的預處理方法處理，得待測樣品溶液；(2)將所述的待測樣品溶液進行檢測，即可。[0025]步驟(2)中，所述的檢測較佳地為高效液相色譜-紫外檢測。
[0026]所述的高效液相色譜的檢測的色譜柱較佳地為C18色譜柱，更佳地為Agilent20RBAX SB-C18 ;所述的 Agilent20RBAX SB-C18 的規格較佳地為 4.6*150mm*5 μ m或 4.6*250mm*5 μ m。
[0027]所述的高效液相色譜的檢測的流動相較佳地包括:流動相A:乙腈；流動相B:
0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；所述的流動相A和流動相B的體積比較佳地為(28-32 ):(72-68)，更佳地為32:68 ;所述百分比為質量百分比。所述的醋酸的水溶液的濃度較佳地為0.2%，所述百分比為質量百分比。
[0028]所述的高效液相色譜的檢測的柱溫較佳地為30°C。
[0029]所述的高效液相色譜的檢測的流速較佳地為1.0mL/min。
[0030]所述的高效液相色譜的檢測的波長較佳地為265nm。
[0031]所述的高效液相色譜-紫外檢測的進樣量較佳地為10-20 μ L0
[0032]所述的檢測后較佳地按照本領域常規的標準曲線法計算得到桑葉復方制劑中1-脫氧野尻霉素的含量。所述的標準曲線法的操作步驟較佳地為:用標準樣品配制成標準樣品，在與待測樣品相同的色譜條件下，等體積進樣；測量各標準樣品溶液的各峰的峰面積，用峰面對樣品濃度繪制標準曲線。再根據測得的待測樣品的峰面積，計算待測樣品的濃度。
[0033]其中，所述的標準樣品的預處理方法與上述步驟(I)中的桑葉復方制劑的預處理方法相同。
[0034]在進行定量檢測時，待測樣品溶液按照本領域常規，先定容后再過濾。所述的定容較佳地為用醋酸定容。所述的醋酸的濃度較佳地為0.1%-0.2%，更佳地為0.1%，所述百分比為質量百分比。
[0035]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0036]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0037]本發明的積極進步效果在于:本發明的預處理方法快速方便，分離度好，能精確得到目標物，且穩定性高，靈敏度高，誤差小，該檢測方法檢測結果精確方法，可以客觀的評價復方制劑的產品質量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1為實施例1制得的標準曲線。
[0039]圖2為專屬性實驗結果圖；其中，A:陰性樣品(去除了桑葉成分的希爾牌復方桑葉膠囊)溶液的色譜圖；Β:待測樣品(希爾牌復方桑葉膠囊)溶液的色譜圖；C:1-脫氧野尻霉素標準樣品溶液的色譜圖。
【具體實施方式】
[0040]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。[0041]以下實施例中，使用的儀器、材料和試劑如下所示:
[0042]液相色譜儀:美國安捷倫公司生產，型號:1260，該液相色譜儀包括二元泵、自動進樣器、柱溫箱、檢測器、工作站；
[0043]KQ-250DB數控超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司；
[0044]pH調節計:上海儀電科學儀器有限公司，型號:PHS_3C ；
[0045]天平:METTLER200型電子天平、BP21ID電子分析天平(SartoriusC0.)。
[0046]標準樣品:1-脫氧野尻霉素，上海融禾醫藥科技有限公司；
[0047]待測樣品:希爾牌復方桑葉膠囊，湖南希爾天然藥業。
[0048]除乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。
[0049]實施例1
[0050]桑葉復方制劑的預處理方法，包括以下步驟:
[0051]取希爾牌復方桑葉膠囊0.2907g置于25mL的量瓶中，加入體積百分比100%乙醇2mL，超聲處理lOmin，乙醇定容至刻度，即為儲備液；取ImL儲備液置于25mL的量瓶中，力口Λ 0.2mol/L的硼酸-氯化鉀緩沖液(pH8.5) ImL,再加入20mmol/L的荷甲基羰酰氯的乙腈溶液4mL,搖勻,超聲處理(功率IOOw,頻率40kHz) 20min,再加入0.05mol/L的甘氨酸2mL,搖勻；用0.1%的醋酸溶液定容至刻度，搖勻，過0.45 μ m濾膜，即可。
[0052]實施例2
[0053]桑葉復方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法
[0054]( I)標準曲線的制備
[0055]取1-脫氧野尻霉素標準品置于25mL的量瓶中，加80 %的甲醇溶液溶解，配成
0.2mg/mL的1-脫氧野尻霉素的溶液,為儲備液；
[0056]將ImL儲備液置于25mL的量瓶中，加入0.2mol/L的硼酸-氯化鉀緩沖液(pH8.5)ImL,再加入20mmol/L的荷甲基羰酰氯的乙腈溶液4mL,搖勻，超聲處理(功率IOOw,頻率40kHz) 20min，再加入0.05mol/L的甘氨酸2mL，搖勻；用0.1%的醋酸溶液定容至刻度，搖勻，即得標準樣品溶液；
[0057]將標準樣品溶液按照體積4μ L、8y L、10y L、12y L、14y L、18y L、20y L分別進樣，進行高效液相色譜-紫外檢測；
[0058]所述的高效液相色譜-紫外檢測的檢測條件為:
[0059]色譜柱:20RBAXSB-C18 (Agilent)(規格 4.6*150mm*5 μ m)
[0060]流動相:流動相A:乙腈；流動相B:質量百分比0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；流動相A和流動相B的體積比為32:68 ；
[0061]柱溫:30°C;
[0062]流速:1.0mL/min ；
[0063]波長:265nm；
[0064]峰面積的測定結果如表I所示；
[0065]表1:1_脫氧野尻霉素標準曲線數據
[0066]
【權利要求】
1.桑葉復方制劑的預處理方法，其特征在于:所述的預處理方法包括以下步驟: 將桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻，再與甘氨酸混合均勻，過濾，即可；其中，所述的桑葉復方制劑的溶液中的溶劑為體積百分比80%的甲醇溶液和/或體積百分比80%-100%的乙醇溶液；所述的緩沖溶液為硼酸鹽緩沖液。
2.如權利要求1所述的預處理方法，其特征在于:所述的硼酸鹽緩沖液為硼酸-氯化鉀緩沖液；所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的濃度較佳地為0.2mol/L ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的PH值較佳地為pH8.5 ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的添加量較佳地為每克桑葉復方制劑加入1.67mL的硼酸-氯化鉀緩沖液； 所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的溶劑為乙腈。
3.如權利要求1所述的預處理方法，其特征在于:所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的添加量以芴甲氧羰酰氯計為每1-3克待測樣品中添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯，較佳地為每1.5克桑葉復方制劑中較佳地添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯；所述的芴甲氧羰酰氯的溶液中的芴甲氧羰酰氯的濃度較佳地為20mmol/L。
4.如權利要求1所述的預處理方法，其特征在于:所述的桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液的體積比為1:1:4。
5.如權利要求1所述的預處理方法，其特征在于:所述的桑葉復方制劑包括40%-50%的桑葉提取物、25%-35%的苦瓜提取物、12%-17%的黃芪提取物和5%_9%的麥冬提取物，所述百分比為質量百分比；所述的桑葉復方制劑較佳地為希爾牌復方桑葉膠囊； 所述的桑葉復方制劑的溶液的制備方法較佳地為:將所述的桑葉復方制劑溶解于所述的溶劑中，搖勻和/或超聲處`理；所述的超聲處理較佳地為在功率IOOW和頻率40kHz條件下處理20min ； 所述的桑葉復方制劑的溶液中，所述的溶劑的添加量較佳地為每0.2-0.6g桑葉復方制劑添加25mL的溶劑，更佳地為每0.3g桑葉復方制劑添加25mL的溶劑； 所述的將桑葉復方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻的方法為搖勻后進行超聲處理；所述的超聲處理較佳地為在功率IOOW和頻率40kHz條件下處理20mino
6.如權利要求1-5中任一項所述的預處理方法，其特征在于:所述的甘氨酸的添加量為每克桑葉復方制劑添加0.05-0.1mol的甘氨酸，較佳地為每克桑葉復方制劑添加0.08mol的甘氨酸； 所述的過濾較佳地為過0.45 μ m的有機系微孔濾膜。
7.一種桑葉復方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法，其特征在于:所述的檢測方法包括以下步驟:(1)將桑葉復方制劑進行如權利要求1-6中任一項所述的桑葉復方制劑的預處理方法處理，得待測樣品溶液；(2)將所述的待測樣品溶液進行檢測，即可。
8.如權利要求7所述的檢測方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的檢測為高效液相色譜_紫外檢測。
9.如權利要求7所述的檢測方法，其特征在于:所述的高效液相色譜的檢測的色譜柱為C18色譜柱，較佳地為Agilent20RBAX SB-C18 ;所述的Agilent20RBAX SB-C18的規格較佳地為 4.6*150mm*5 μ m 或 4.6*250mm*5 μ m ； 所述的高效液相色譜的檢測的流動相包括:流動相A:乙腈；流動相B:0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；所述的流動相A和流動相B的體積比較佳地為(28-32): (72-68)，更佳地為32:68 ;所述百分比為質量百分比；所述的醋酸的水溶液的濃度較佳地為0.2%，所述百分比為質量百分比； 所述的高效液相色譜的檢測的柱溫為30°C ;所述的高效液相色譜的檢測的流速為.1.0mL/min ;所述的高效液相色譜的檢測的波長為265nm ;所述的高效液相色譜-紫外檢測的進樣量為10-20 μ L。
10.如權利要求7所述的檢測方法，其特征在于:所述的檢測后按標準曲線法計算得到桑葉復方制劑中1-脫氧野尻霉素的含量；所述的標準曲線法中標準樣品的預處理方法與所述的步驟(1)中的桑葉復方制劑的預處理方法相同。
【文檔編號】G01N30/02GK103869026SQ201410108293
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】劉湘榮, 易躍能, 鄧義德, 朱亞文, 蔣靈嬌 申請人:湖南希爾天然藥業有限公司