一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法，以魯米諾和聯吡啶釕為發光探針，在檢測時，以ITO電極作為發光檢測的工作電極、銀-氯化銀電極作為參比電極以及鉑電極作為對電極，由0.6V掃描至0.0V，檢測來自魯米諾的發光信號；向檢測體系中加入過硫酸根和過量的魯米諾，由0.0V掃描至-1.0V，檢測來自聯吡啶釕的發光信號。本發明還提出一種簡單、有效、可同時檢測兩種細胞表面癌癥標志物的檢測方法。通過雙標記和電位分辨的方法可以實現對細胞表面兩種抗原的一步分析檢測，且排除了不同電位下信號的相互干擾，成功實現了細胞表面癌胚抗原和甲胎蛋白抗原的同時檢測。
【專利說明】一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體地說涉及一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002]電致化學發光(ECL)是另外一種應用于免疫分析的方法，其利用電致化學發光探針代替熒光團。電致化學發光方法不需要光源的激發，因此具有背景低和設備簡單的優點。最常用的電致化學發光探針為魯米諾和聯吡啶釕。一般情況下，在施加正電位時，魯米諾陰離子會經歷單電子氧化過程，變為二氮雜醌，進一步被氧化為激發態的3-氨基鄰苯二甲酸，從而回到基態發光。對于聯吡啶釕探針來說，S2O82-離子作為共反應劑，首先會在負電位下被還原成為SO4._，該物質可與聯吡啶釕反應從而發光。雖然聯吡啶釕/過硫酸根離子體系和魯米諾/雙氧水體系會在不同的電壓范圍下發光，兩種電致化學發光物質和其相應的共反應劑同時存在于一個體系當中造成了復雜的電化學發光現象，進而分辨來自魯米諾和聯吡啶釕復合物的發光變得十分困難。
[0003]癌癥的早期診斷對其最終的控制和預防有著至關重要的作用。在癌癥發展的過程中，一種有效的早期癌癥診斷手段是對癌癥標志物的檢測。由于已知的癌癥標志物的特異性較低，因此對多標志物的同時檢測可以大大提高癌癥檢測的準確性。過去的幾年中研究者致力于發展基于熒光免疫方法對多個癌癥標志物的同時檢測。經典的做法是在細胞表面標記上具有不同激發光/發射光性質的熒光團。在激光的照射下，不同熒光團的發射光被分光鏡和濾光片區分開來，之后由光電倍增管(PMT)或者電荷耦合裝置(CCD)檢測出來。雖然熒光免疫分析法因熒光團覆蓋光譜的廣泛性，熒光標記的簡便性和實時監測性而具有一定的優越性，但是激光器的部件、濾光片或者光學分束器的引入會使得實驗設備復雜，提高了檢測成本。將電致化學發光反應應用于細胞免疫分析當中時，抗體修飾的聯吡啶釕和魯米諾可以識別細胞表面的抗原。由于不同的電致化學發光探針可在不同的電位下發光，因此發展電位分辨的電致化學發光免疫試劑盒進行細胞表面抗原的同時分析是可行的。電壓掃描過程中，不同電致化學發光探針會在不同時間點發光，因此不需要光學分束器或濾光片進行信號的分辨。由于不需要光源、光學分束器和濾光片的引入就很大程度上簡化了光學設置并且降低了實驗成本。
【發明內容】
[0004]發明目的:為解決現有技術中存在的技術問題，本發明提出一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法及其應用，以解決兩種電致化學發光物質同時存在于一個體系中時分辨兩者的發光出現困難的問題，同時將該方法應用于同時檢測細胞表面兩種抗原。
[0005]技術內容:為實現上述技術目的，本發明提出一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法，以魯米諾和聯吡啶釕為發光探針，在檢測時包括如下步驟:
[0006](I)電極準備:在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極；
[0007](2)正電位下檢測魯米諾的發光信號:以-0.01~-lV/s的掃速由0.6V掃描至
0.0V，檢測來自魯米諾的發光信號，優選的掃速為-0.2V/s ；
[0008](3)負電位下檢測聯吡啶釕的發光信號:向檢測體系中加入過硫酸根和過量的魯米諾，以-0.01~-?ν/s的掃速由0.0V掃描至-1.0V，檢測來自聯吡啶釕的發光信號，選的掃速為-0.2V/S ；
[0009]其中，所述魯米諾的檢測范圍為20 μ M~200 μ M，所述聯吡啶釕的檢測范圍為20 μ M~200 μ M ;加入的過硫酸根與聯吡啶釕的摩爾比為20:1~30:1，加入的過量的魯米諾的量為15~20mM。
[0010]本發明還提出了上述方法在同時檢測細胞表面兩種抗原上的應用。
[0011]具體地,所述應用包括如下步驟:
[0012](I)電極準備:在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極；
[0013](2)將細胞表面待測的抗原A和抗原B分別用聯吡啶釕和魯米諾標記； [0014](3)對細胞表面的聯吡啶釕和魯米諾進行檢測，其中，以-0.01~-lV/s的掃速由
0.6V掃描至0.0V,檢測來自魯米諾的發光信號，優選的掃速為-0.2V/s ；向檢測體系中加入過硫酸根和過量的魯米諾溶液，以-0.01~-?ν/s的掃速由0.0V掃描至-1.0V,檢測來自聯吡啶釕的發光信號，優選的掃速為-0.2V/S。
[0015]其中，在上述步驟(1)中，標記聯吡啶釕和魯米諾的步驟如下:
[0016](a)細胞培養:將細胞在步驟(1)所述的ITO電極的表面培養，并用2.5wt%的戊二醛進行固定；
[0017](b)制備鏈霉親和素修飾的聯吡啶釕復合物:將鏈霉親和素與聯吡啶釕在3~5°C下反應2~3小時得到結合產物SA-Ru (鏈霉親和素-聯吡啶釕)，結合產物用超濾管進行超濾純化處理，然后在4°C下于pH7.4的PBS緩沖液中保存；
[0018](C)制備抗體B修飾的魯米諾復合物:將3-巰基丙酸加入到金納米顆粒溶液中在35~38°C下反應10~12小時，在轉速為HOOOrpm條件下離心25~40分鐘收集金納米粒子軛合物，向金納米粒子軛合物中加入EDC (1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)的混合溶液，在36~38°C下反應0.8~1.5小時，得到活化的金納米粒子溶液；將活化的金納米粒子溶液與抗體B溶液混合，在36~38°C下反應11~13小時得到金納米粒子-抗體B復合物；將N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾加入到金納米粒子-抗體B復合物中，在黑暗條件下反應11~13小時得到抗體B修飾的魯米諾復合物；
[0019](d)標記鏈霉親和素修飾的聯吡啶釕復合物:將固定有細胞的ITO電極與生物素化的抗體A溶液于37°C條件下反應25~40分鐘，用pH7.4的PBS緩沖液清洗，加入步驟
(b)中得到的SA-Ru溶液反應2~4分鐘從而在抗原A上標記上鏈霉親和素修飾的聯吡啶釕復合物；
[0020](e)標記抗體B修飾的魯米諾復合物:將經過(d)步驟處理的ITO電極的O型圈表面加入0.02% (w/v)的吐溫20溶液，然后與步驟(C)制備的抗體B修飾的魯米諾復合物在37°C下反應2小時，從而在抗原B上標記上抗體B修飾的魯米諾復合物。
[0021]優選地，上述ITO電極所粘貼的O型圈的直徑為2cm。
[0022]其中,所述的細胞為MCF-7細胞,所述的抗原A為癌胚抗原,抗原B為甲胎蛋白。
[0023]所述的PBS緩沖液為ρΗ7.4的PBS緩沖液。
[0024]優選地，所述的金納米顆粒的粒徑為11?13nm。
[0025]有益效果:與現有技術相比，本發明提出了一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法，基于該方法，提出了一種簡單、有效、可同時檢測兩種細胞表面癌癥標志物的檢測方法。通過雙標記和電位分辨的方法可以實現對細胞表面兩種抗原的一步分析檢測，且排除了不同電位下信號的相互干擾，成功實現了細胞表面癌胚抗原和甲胎蛋白抗原的同時檢測。進一步地，改變與魯米諾或聯吡啶釕復合物相連的抗體可以實現其他不同種類需檢測抗原的分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為負電位下聯吡啶釕、魯米諾以及兩者的混合物的發光曲線；
[0027]圖2為負電位下高濃度魯米諾的發光自猝滅現象；
[0028]圖3為正電位下聯吡啶釕和魯米諾的化學發光；
[0029]圖4為雙氧水對過硫酸根體系下的聯吡啶釕和魯米諾的化學發光的影響；
[0030]圖5為抗體修飾的魯米諾和抗體修飾的聯吡啶釕與粒子的結合；
[0031]圖6為負電位下魯米諾復合物修飾的粒子對聯吡啶釕復合物修飾的粒子的化學發光信號的影響；
[0032]圖7為正電位下聯吡啶釕復合物修飾的粒子和魯米諾復合物修飾的粒子的化學發光;
[0033]圖8為正電位下聯吡啶釕復合物修飾粒子對魯米諾復合物修飾的粒子的化學放光信號的影響；
[0034]圖9為抗原與發光探針的發光強度的線性關系示意圖；
[0035]圖10為抗體修飾的魯米諾和聯吡啶釕與細胞表面抗原連接的示意圖；
[0036]圖11為MCF7細胞在電位由0.6V掃描至-1.0V的發光信號-電位圖；
[0037]圖12為MCF7細胞表面標記電致化學發光信號分子之前和之后的發光信號；
[0038]圖13為PC3細胞表面標記魯米諾復合物和聯吡啶釕復合物后的發光信號。
具體實施例
[0039]試劑及來源:金納米粒子(平均直徑13納米)從北京德科島金科技有限公司購得；癌胚抗原抗體和癌胚抗原分別來自鄭州博賽生物科技有限公司和北京博奧森生物科技有限公司；甲胎蛋白(AFP)抗原抗體購自成都雙流正龍生化實驗室；生物素化的癌胚抗原(CEA)抗體自北京科躍中楷生物科技有限公司；MCF-7細胞和PC-3細胞來自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；外表包裹羧基的二氧化硅粒子(平均直徑20微米)來自德國Micromod顆粒技術有限公司；其他試劑除特殊指明外均來自Sigma-Aldrich公司。實驗過程使用電阻率為18.2MQ/cm的超純水。緩沖溶液經過滅菌處理。
[0040]實施例1溶液中魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光。
[0041](I)負電位下溶液中聯吡啶釕和魯米諾的交叉反應。
[0042]檢測條件:在體系中存在3mM過硫酸根粒子時，在負電位的條件下，分別檢測100 μ M聯吡啶釕、100 μ M聯吡啶釕粒子和100 μ M魯米諾的混合溶液以及100 μ M魯米諾的發光曲線。其中，整個檢測體系在ΡΗ7.4的PBS緩沖液中，在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極，電壓掃速為-0.2V/s (以下各實施例中的電壓掃速均采用-0.2V/s)。
[0043]結果如圖1所示，其中a為單獨檢測聯吡啶釕溶液的發光曲線，b為聯吡啶釕和魯米諾共存時的發光曲線，c為單獨的魯米諾的發光曲線，可以看到在負電位下，當魯米諾和聯吡啶釕同時存在時，體系中引入過硫酸根離子得到的發光信號比單一聯吡啶釕與過硫酸根粒子共存是的發光信號大。這種增加的發光信號是由于魯米諾和過硫酸根粒子兩者在負電位下的交叉反應產生的。將工作電極材料置換為金電極并沒有改變這個現象，因此表明這種魯米諾和過硫酸根離子的反應與電極材料無關。在負電位下，魯米諾和聯吡啶釕均會在過硫酸根離子存在的情況下發光的現象使得區分出負電位下來自聯吡啶釕的發光信號變的困難。
[0044](2)負電位下高濃度魯米諾的發光自猝滅現象。
[0045]檢測條件:在pH7.4PBS緩沖液中，在體系中有100 μ M聯吡啶釕和3mM過硫酸根離子時，隨著魯米諾濃度變化為0.lmM、lmM、5mM、10mM、15mM、20mM時，在-1.0V的電位下檢測發光信號，在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極進行檢測。
[0046]結果如圖2所示。從圖2中可以看出，在負電位下過硫酸根離子存在時，不斷增加魯米諾溶液的濃度可以看到發光信號不斷減弱。當魯米諾濃度高于15mM時,來自魯米諾的發光變成一個較小且穩定的常數，并不再受魯米諾量增加的影響。當魯米諾增加至20mM時，此時再引入聯吡啶釕，會發現發光信號開始增加，證明了這種高濃度魯米諾存在的條件下，來自聯吡啶釕的發光是可以被從總的發光信號中分離出來的。這種分離出來的光信號即為在負電位下來自聯吡啶釕的發光信號。
[0047](3)正電位下聯吡啶釕和魯米諾的化學發光。
[0048]檢測條件:在pH7.4PBS緩沖液中，分別檢測200 μ M魯米諾和200 μ M聯吡啶釕在正電位下的發光。在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極，掃速為-0.2V/S進行檢測。結果如圖3所示，從圖中可以看出，魯米諾和聯吡啶釕發光的起始電壓分別為0.4V和0.6V,即在O?0.6V的電壓范圍內聯吡啶釕沒有化學發光。
[0049](4)雙氧水對過硫酸根體系下的聯吡啶釕和魯米諾的化學發光的影響。
[0050]檢測條件:在pH7.4PBS緩沖液中，在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極進行檢測，分別檢測下述情況下的化學發光:
[0051](a):100 μ M魯米諾，100 μ M聯卩比唳釕,3mM過硫酸根離子和ImM雙氧水；
[0052](b):100 μ M魯米諾,3mM過硫酸根離子和ImM雙氧水；[0053](c):100 μ M魯米諾,3mM過硫酸根離子。
[0054]電壓掃描范圍為O?(-l.0)V，掃速為-0.2V/s。結果如圖4所示。雙氧水是一種常用的增強魯米諾電致化學發光的共反應劑。圖4顯示出在魯米諾、聯吡啶釕、雙氧水和過硫酸根離子同時存在時會產生化學放光，這種化學發光現象與電位無關，且會使得聯吡啶釕和過硫酸根離子在負電位下的發光信號猝滅。推測最可能的反應機理為過硫酸根是一個很強的氧化劑，會使得雙氧水產生氧自由基，使得魯米諾發生化學發光。這種化學發光現象消耗了過硫酸根離子，從而抑制了負電位下過硫酸根向硫酸根自由基轉換的過程，進一步阻礙了對聯吡啶釕基團的電致化學發光現象。由于魯米諾自身也存在電致化學發光現象，因此雙氧水從體系中排除，從而保證聯吡啶釕/過硫酸根離子體系的電化學發光體系正常進行。當正電位由0.6V掃描至0V，在該電位范圍內的發光就僅僅來自魯米諾，而與聯吡啶釕無關。
[0055]因此，在魯米諾-聯吡啶釕-過硫酸根離子體系中，在正電位信號檢測結束后，可以通過向體系中引入高濃度的魯米諾和過硫酸鉀使得負電位下的魯米諾的發光信號成為一個常數且與魯米諾的含量無關，從而使得在正電位和負電位下的發光分別為魯米諾和聯吡啶釕，且沒有相互干擾。因此，通過電壓掃描，實現兩種抗原分析的電位分辨的電致化學發光分析是可行的。
[0056]實施例2粒子表面魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光。
[0057]為了模擬用魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光來同時檢測細胞表面兩種抗原，我們在直徑為20微米左右的二氧化硅表面修飾了抗原，該尺寸和細胞尺寸相似。在分析實驗中，粒子沉降在電極表面，模擬了細胞的粘附行為。具體地，包括如下步驟:
[0058](I)抗體修飾的魯米諾復合物的制備:制備過程如圖5 (I)所示。將濃度為10_3M的3-巰基丙酸(3-MPA)首先加入到平均直徑為13納米的金納米顆粒(Au NPs)溶液中。混合溶液于37°C條件下反應12小時，之后于轉速為HOOOrpm條件下離心30分鐘收集金納米粒子軛合物(Au NPs-MPA)ο為了活化金納米粒子軛合物表面的羧酸基團，于金納米粒子軛合物中加入濃度為ImM的EDC和NHS混合溶液，并在37°C條件下反應I小時。此后，將
12.88 μ g/mL的甲胎蛋白(AFP)抗原抗體溶液與活化的金納米粒子溶液混合，于37°C條件下反應12小時。最后將0.25mM的N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾(異魯米諾)加入溶液中，在黑暗條件下繼續反應12小時使得魯米諾被連接到金納米粒子上。最終的表面連接了 AFP抗原抗體和魯米諾的金納米粒子產物懸浮于pH為7.4，濃度為IOmM磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，4°C下保存。
[0059](2)鏈霉親和素修飾的聯吡啶釕復合物的制備:將0.1mg濃度為lmg/mL的鏈霉親和素(SA)溶液與Img聯吡啶釕復合物(Ru)于4°C下反應2小時。兩者的結合產物SA-Ru由截留分子量為IOK的超濾管(Millipore，USA)進行超濾純化處理。SA-Ru由pH為7.4的PBS溶液稀釋至20μ g/mL，4°C下保存。
[0060](3)抗原修飾的二氧化硅粒子的制備:如圖5 (2)所示，二氧化硅粒子(SPs)與
0.2M的NHS和0.8M的EDC混合溶液于37 °C條件下反應I小時來活化二氧化硅粒子表面的羧酸基團。此后粒子與12.88 μ g/mL的抗體溶液于37°C條件下反應24小時使得抗體與粒子表面相連。余下的活化羧酸基團由與PBS溶液質量體積比為0.1%的牛血清蛋白溶液在37°C條件下反應I小時進行封閉。離心清洗過后，粒子中加入2 μ g/mL的抗原溶液，兩者在37°C條件下反應2小時，最終得到抗原修飾的二氧化硅粒子。
[0061](4)魯米諾、聯批唳釕復合物與抗原修飾的粒子的連接:表面修飾了 AFP抗原抗體和魯米諾的金納米粒子與表面修飾抗原的二氧化娃粒子的連接按如下步驟進行:二氧化娃粒子首先懸浮于與PBS溶液質量體積比為0.02%的吐溫20溶液中，之后與修飾了 AFP抗原抗體和魯米諾的金納米粒子在37°C條件下反應2小時。SA-Ru復合物與抗原修飾的二氧化硅粒子的連接按如下步驟進行:二氧化硅粒子先與3 μ g/mL的生物素化的抗體溶液于37°C條件下反應30分鐘。離心清洗三遍之后，產物與20 μ g/mL的SA-Ru溶液反應2分鐘從而得到聯吡啶釕修飾的二氧化硅粒子。
[0062](5)發光檢測:在ITO電極表面粘上直徑為2cm的O型圈作為溶液室作為發光檢測的工作電極，銀-氯化銀和鉬電極被分別用作參比電極和對電極。第一步，由0.6V變化至0.0V的正電位以-0.2V/s的掃速(以下各個實施例中的電極條件和掃速均相同)加載在ITO電極上,檢測來自魯米諾復合物的發光信號。第二步，3mM的過硫酸鉀和15mM的魯米諾溶液引入到體系中，電壓持續以相同的掃速由0.0V掃描至-1.0V,從而檢測來自聯吡啶釕的發光信號。在同樣的電壓范圍內，粒子或者細胞表面在連接了魯米諾和聯吡啶釕之前測定了體系的背景信號。為了避免由于不同ITO試驗帶來的測量誤差，對于魯米諾發光的分析，在0.6V條件下得到的來自魯米諾基團的信號被其在OV時得到的背景信號歸一化，同樣的對于聯吡啶釕的發光分析，在-1.0V時得到的來自聯吡啶釕的信號也被其在OV下的背景信號歸一化。
[0063]在負電位的條件下，當掃描電壓由0.0V變化至-1.0V時，連接了聯吡啶釕復合物的二氧化硅粒子會在過硫酸根離子存在的條件下發光。在溶液實驗中已證明魯米諾會在過硫酸根存在時負電位下給出發光信號。魯米諾和聯吡啶釕復合物均會在負電位下發光，因此就使得在0.0至-1.0這個電壓范圍內得到與聯吡啶釕相連的抗原的信息變得不可行。加入溶劑I (主體成分為15mM魯米諾和3mM K2S2O8)后，來自魯米諾復合物光信號會變成一個常量。此時來自魯米諾為常量的發光強度不再與修飾了魯米諾復合物的粒子有關。
[0064]圖6顯示了聯吡啶釕復合物修飾的粒子在體系存在溶劑I的條件下，負電位掃描時體系含有和不含有魯米諾復合物修飾的粒子時候的發光情況。曲線a表明了在同樣的溶液中含有未修飾的二氧化硅粒子時測得的背景信號。曲線b表明在體系中引入聯吡啶釕復合物修飾的粒子后發光信號增加，繼續加入魯米諾復合物修飾的粒子，發光信號沒有顯示出增加的效果，證明在這種條件下測試來自聯吡啶釕復合物的信號的可行的。曲線c和曲線d的差值表現出加入聯吡啶釕修飾粒子的發光信號。繼續加入更多的的聯吡啶釕修飾的粒子可以觀察到信號的持續上升，顯示出在我們體系中負電位下測得的發光信號的強度與二氧化硅粒子表面的抗原數量有相關性。
[0065]在正電位的條件下，聯吡啶釕復合物修飾的粒子在電壓為O到0.6V的范圍內不會發光，如圖7所示。由于來自魯米諾復合物修飾的粒子的發光可以在電壓高于0.45V時即可觀察到，因此低于0.6V的電位可僅僅激發來自魯米諾復合物的發光。即電壓掃描范圍為
O到0.6V時得到的發光信號提供了與魯米諾相連的抗原的相關信息。
[0066]圖8中的曲線b和c分別代表魯米諾復合物修飾的粒子在聯吡啶釕復合物修飾粒子不存在和存在的條件下得到的發光信號。曲線a代表沒有魯米諾復合物修飾的粒子的發光信號。在聯吡啶釕復合物修飾的粒子引入到體系中時，沒有觀察到發光信號的增加，這個結果表明在正電位下測得的信號是準確的，是僅僅來自魯米諾復合物修飾粒子的。持續的加入魯米諾復合物修飾的離子會觀察到發光信號的增強，如圖8中曲線d和e所示，這個結果表明我們的實驗體系中正電位下測得的發光信號強度與二氧化硅離子表面的抗原數量有相關性。
[0067]總的來說，來自魯米諾和聯吡啶釕復合物的發光可以在電壓掃描范圍為0.6到-1.0V的范圍內進行檢測。僅僅使用一個光電倍增管，這種由電位控制的電致化學發光信號的檢測可以實現兩種抗原的聯合檢測。
[0068]進一步的，我們使用這種方法對兩種抗原進行定量的檢測。連接了 AFP抗體(抗體A)的魯米諾和連接了 CEA抗體(抗體B)的聯吡啶釕分別識別粒子表面的AFP (抗原A)和CEA抗原(抗原B)，調節粒子數目即可通過檢測發光強度可對粒子數目(即相應抗原)進行定量。
[0069]因此需要估算每個二氧化硅粒子表面的抗原數量，設計實驗如下:抗原A和抗原B修飾的二氧化娃粒子分別與相應的抗體修飾的金納米粒子反應。由于每個金納米粒子上修飾了一個相應的抗體，那么通過測定反應前和反應后金納米粒子溶液的熒光即可以得到與二氧化硅粒子表面抗原結合的抗體數，進而可以估算參加反應的二氧化硅粒子表面的抗原A或抗原B的個數。由于實驗中二氧化硅粒子的數目是可以控制的，最終計算出每個粒子表面的抗原A和抗原B的數目為1.60 X 10_19摩爾和0.30 X 10_19摩爾。
[0070]定量檢測中，通過控制氧化銦錫電極表面的二氧化硅粒子個數，按照如前文方法進行檢測，得到了與其數目成線性關系的發光信號。由于其表面的抗原數目已經確定，進而就得到了抗原A或B與魯米諾或聯吡啶釕發光強度的線性關系。如圖9所示。圖9A中為抗原A與魯米諾發光信號的線性關系。圖9B中為抗原B與聯吡啶釕發光信號的線性關系。對于抗原A，檢測的范圍為0.2?1.0ngo對于抗原B，檢測的范圍為3.4?16.7ng。
[0071]實施例3細胞表面兩種抗原的聯合檢測。
[0072]細胞培養MCF-7細胞和PC-3細胞分別在加了 10% (v/v )胎牛血清和1% (v/V)抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM高糖培養基和F-12K培養基中培養。細胞培養于含有5% (v/v)的CO2，溫度為37°C且氣氛濕潤的細胞培養箱中。其中，抗生素為青霉素和鏈霉素的混合物，其中青霉素濃度為100U/ml，鏈霉素濃度為lOOyg/ml。即培養基總體積是500ml，其中胎牛血清為50ml，青霉素和鏈霉素購入的為10000U/ml和IOOOOyg/ml的混合溶液(購買自Thermo Scientific的青霉素-鏈霉素100X溶液(HyClone?Penicillin-StreptomycinlOOX Solution),力口 5ml A 500ml 中，相當于稀釋 100 倍從而達到青霉素100U/ml，鏈霉素100μ g/ml的濃度。
[0073]如圖10所示，在細胞表面連接魯米諾和聯吡啶釕時同如上過程。在連接之前，細胞用2.5%的戊二醛固定在我們的實驗中，大約180，000個MCF7細胞被培養在氧化銦錫電極的表面。細胞首先由2.5%的戍二醒進行固定,從而保證細胞表面抗原抗體的免疫反應，并且使得高濃度溶液魯米諾引入對細胞活動產生的影響最小化。其中，MCF7細胞表面具有高表達的CEA和AFP抗原，先通過免疫反應將抗體修飾的魯米諾和聯吡啶釕復合物均連接在細胞表面。在細胞表面連接魯米諾和聯吡啶釕時同如實施例2。在連接之前，細胞用2.5%的戊二醛固定。圖11是電位由0.6V掃描至-1.0V的發光信號-電位圖。在電位掃描至OV時向體系中引入3mM的過硫酸根離子和15mM的魯米諾溶液。對比背景發光信號的曲線,可在正電位和負電位下均觀察到發光信號的上升，該現象說明使用我們的實驗體系可完成細胞表面的兩種抗原的聯合檢測。如圖12陰影柱狀圖所示，細胞表面標記電致化學發光信號分子之前和之后的發光信號的比值求得平均值分別為2.59和0.92，對應地反映出CEA和AFP抗原數量的相關信息。進行了三組平行的細胞實驗，求得來自魯米諾和聯吡啶釕復合物的信號與背景比值的標準差分別為3.5%和14.1%。
[0074]為了證明在細胞實驗中來自正電位和負電位催下的發光信號不會有相互干擾，在MCF7細胞表面分別進行了魯米諾和聯吡啶釕復合物的單獨標記。相應的，發光信號分別僅僅在正電位和負電位下檢測。如圖12白色柱狀圖所示，標記之后和之前的發光信號的比值分別為2.68和1.05。與魯米諾和聯吡啶釕復合物雙標記時測得的信號比值相近，證明我們的體系對雙抗原的同時檢測是準確可行的。PC3細胞表面沒有CEA和AFP抗原的表達，在實驗中被用作空白對照。如圖13所示，在掃描電壓為0.6到-1.0V的條件下，標記前后沒有觀察到電致化學發光信號的變化。該結果證實了我們實驗體系的可行性。
[0075]綜上所述，本發明提出一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法，利用該檢測方法，可以發展一種基于電致發光的細胞表面雙標志物同時檢測的試劑盒，從而實現了對細胞表面兩種抗原的同時分析。當抗體修飾的魯米諾和聯吡啶釕與細胞表面相應抗原相連后，過硫酸根離子需在引入體系中來激發負電位下聯吡啶釕的發光；正電位下僅僅由魯米諾復合物發光從而提供與魯米諾相連的抗原的信息。負電位下，由于魯米諾復合物在過硫酸根離子存在時同樣會發光，干擾聯吡啶釕發光的檢測，因此在正電位信號檢測結束后，將15mM魯米諾和3mM K2S2O8引入體系當中使得魯米諾的發光產生自淬滅現象。此時負電位下來自魯米諾的發光成為一個常數且與魯米諾復合物的含量無關。此時聯吡啶釕復合物的發光信號可由從負電位下總的發光信號中除去來自高濃度魯米諾的常數部分而得到。從而可以制備實現對兩種細胞表面癌癥標志物快速、靈敏的檢測的試劑盒，同時具有操作簡便，設備簡單，成本低廉等優點。
【權利要求】
1.一種基于魯米諾和聯吡啶釕的電位分辨電致化學發光檢測方法，其特征在于，以魯米諾和聯吡啶釕為發光探針，在檢測時包括如下步驟: (1)電極準備:在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極； (2)正電位下檢測魯米諾的發光信號:以-0.01~-?ν/s的掃速由0.6V掃描至0.0V,檢測來自魯米諾的發光信號； (3)負電位下檢測聯吡啶釕的發光信號:向檢測體系中加入過硫酸根和過量的魯米諾，以-0.01~-lV/s的掃速由0.0V掃描至-1.0V，檢測來自聯吡啶釕的發光信號； 其中，所述魯米諾的檢測范圍為20 μ M~200 μ Μ，所述聯吡啶釕的檢測范圍為20 μ M~200 μ M ;加入的過硫酸根與聯吡啶釕的摩爾比為20:1~30:1，加入的過量的魯米諾的量為15 ~20mM。
2.權利要求1所述的方法在同時檢測細胞表面兩種抗原上的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，包括如下步驟: (1)電極準備:在ITO電極表面粘上O型圈作為溶液室，以ITO電極作為發光檢測的工作電極，以銀-氯化銀電極作為參比電極，以鉬電極作為對電極； (2)將細胞表面待測的抗原A和抗原B分別用聯吡啶釕和魯米諾標記； (3)對細胞表面的聯吡啶釕和魯米諾進行檢測，其中，以-0.01~-lV/s的掃速由0.6V掃描至0.0V，檢測來自魯米諾的發光信號；向檢測體系中加入過硫酸根和過量的魯米諾溶液，以-0.01~-lV/s的掃速由0.0V掃描至-1.0V，檢測來自聯吡啶釕的發光信號。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟(2)中，標記聯吡啶釕和魯米諾的步驟如下: (a)細胞培養:將細胞在步驟(1)所述的ITO電極的表面培養，并用2.5wt%的戊二醛進行固定； (b)制備鏈霉親和素修飾的聯吡啶釕復合物:將鏈霉親和素與聯吡啶釕在3~5°C下反應2~3小時得到結合產物SA-Ru，結合產物用超濾管進行超濾純化處理，然后在4°C下于PH7.4的PBS緩沖液中保存； (c)制備抗體B修飾的魯米諾復合物:將3-巰基丙酸加入到金納米顆粒溶液中在35~38°C下反應10~12小時，在轉速為HOOOrpm條件下離心25~40分鐘收集金納米粒子軛合物，向金納米粒子軛合物中加入EDC和NHS的混合溶液，在36~38°C下反應0.8~1.5小時，得到活化的金納米粒子溶液；將活化的金納米粒子溶液與抗體B溶液混合，在36~38°C下反應11~13小時得到金納米粒子-抗體B復合物；將N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾加入到金納米粒子-抗體B復合物中，在黑暗條件下反應11~13小時得到抗體B修飾的魯米諾復合物； Cd)標記鏈霉親和素修飾的聯吡啶釕復合物:將(a)中固定有細胞的ITO電極與生物素化的抗體A溶液于37°C條件下反應25~40分鐘，用pH7.4的PBS緩沖液清洗，加入步驟(b)中得到的SA-Ru溶液反應2~4分鐘從而在抗原A上標記上鏈霉親和素修飾的聯吡啶釕復合物； (e)標記抗體B修飾的魯米諾復合物:將經過(d)步驟處理的ITO電極的O型圈表面加入0.02% (w/v)的吐溫20溶液，然后與步驟(c)制備的抗體B修飾的魯米諾復合物在37°C下反應2小時,從而在抗原B上標記上抗體B修飾的魯米諾復合物。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述O型圈的直徑為2cm。
6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的細胞為MCF-7細胞，所述的抗原A為癌胚抗原，抗原B為甲胎蛋白。
7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的PBS緩沖液為pH7.4的PBS緩沖液。
8.根據權利要求4所述的應用，`其特征在于，所述的金納米顆粒的粒徑為11~13nm。
【文檔編號】G01N33/574GK103884707SQ201410104233
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月19日 優先權日:2014年3月19日
【發明者】方丹君, 江德臣, 姜暉, 韓芳霏 申請人:南京醫科大學