一種豬hev總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條包括：吸水玻璃纖維層、硝酸纖維素膜層、吸水濾紙層和白色塑料墊板；該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟：制備HEV包被抗原、HEV標記抗原、HEV標記抗原-膠體金；組裝膠體金快速診斷試紙條。本發明可以用于豬戊型肝炎病毒總抗體檢測，診斷操作簡單，檢測時間短，攜帶方便；為戊型肝炎病毒流行病學大規模調查提供相應的研究基礎和技術保障；采用雙抗原夾心法原理，包被抗原與血清中抗體產生特異性結合，結合抗原抗體復合物與標記抗原再次產生抗原抗體反應，兩個抗原結合不同的抗原結合位點，特異性好，靈敏度高。
【專利說明】一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于戊型肝炎病毒的檢測【技術領域】，尤其涉及一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法。
【背景技術】
[0002]戍型肝炎(Hepatitis E)是一種由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virs, HEV)引起的經消化道傳播的人畜共患傳染病。該病在青少年中容易發展為暴發性肝炎，可以導致孕婦流產，病死率高達21%。HEV分布廣泛，危害嚴重。
[0003]世界各國相繼都有豬源HEV相關的報道，與人類HEV序列比對結果發現兩者具有極高的同源性，隨后又發現提取的病毒RNA可以感染黑猩猩和恒河猴。隨后，相繼的實驗結果表明豬戊型肝炎是一種人畜共患病，豬作為戊型肝炎病毒的主要自然宿主，HEV平均感染率最高可達83.4%，許多攜帶戊肝病毒的豬群并不表現發病狀態(Meng X J et al.，1997)。豬是人類重要的肉食來源，同時作為人類器官移植的主要供體，有效控制戊型肝炎就必須切斷人-豬傳播途徑。這就凸現了豬戊型肝炎病毒的檢測診斷的意義。HEV具有遺傳的不穩定性和變異的特性，不同毒株之間的抗原表位也不盡相同。
[0004]由于嗜肝病毒本身的生物學特性，目前還沒有成熟的體外細胞培養系統可以大量增殖病毒粒子，加上病毒本身對外界環境抵抗力弱，至今還沒有開發出令人滿意的戊型肝炎診斷試劑盒和疫苗。
[0005]HEV為RNA病毒，對HEV RNA的檢測主要為采用PCR方法進行，但是由于各地所用引物不盡相同，檢測結果不盡人意；而且由于病毒RNA在血液中存在時間較短，病毒含量低，RNA易于降解等因素，使得檢測HEV RNA存在一定的困難。因此，目前對HEV的診斷主要通過檢測血清中抗HEV IgG和抗HEV IgM來進行診斷。
[0006]目前，免疫學檢測方法特異性高，敏感性強，簡便快速等優點，成為HEV血清學檢測最常用的方法，現在隨著生物學技術的不斷發展，可以采用基因工程方法表達相關蛋白來建立一系列血清學檢測方法。本發明采用雙抗原夾心法建立的豬戊型肝炎病毒總抗體膠體金檢測試紙條，旨在快速準確高效的對豬血清中戊型肝炎病毒總抗體進行檢測，從而建立一種靈敏度好、特異性高的免疫學檢測方法，用于檢測和評估豬群的HEV抗體水平，對于豬群戊型肝炎病毒的臨床診斷和預防控制具有重要意義。
[0007]目前市場上戊型肝炎病毒的檢測主要采用血清學ELISA檢測法，此產品主要應用于人血清抗體的檢測，還沒有相關產品用于豬HEV抗體的檢測，豬作為戊型肝炎病毒的主要自然宿主，由于缺乏相關可行的檢測產品，暫時也沒有豬群HEV抗體水平的檢測報告。豬源HEV與人類HEV序列具有極高的同源性，且其病毒RNA還可以感染黑猩猩和恒河猴等其它動物，為了彌補這一技術空白，開發了豬源HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條。克服了現有試劑盒只能特異性檢測人戊型肝炎病毒的不足，該產品為第一個專門用于檢測動物戊型肝炎總抗體的免疫產品系列。
【發明內容】
[0008]本發明實施例的目的在于提供一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法，旨在解決現有戊型肝炎病毒的試劑盒只能特異性檢測人戊型肝炎病毒，而不能檢測豬源的戊型肝炎病毒的問題。
[0009]本發明實施例是這樣實現的，一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0010]第一步，HEV包被抗原的制備:
[0011]首先PCR擴增豬源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的兩個片段，上下游引物分別帶有BamH I和Not I酶切位點；FS為S片段上游引物，帶有BamH I酶切位點，RS為片段下游引物，帶有Not I酶切位點；FP12為P12片段上游引物，帶有BamH I酶切位點，RP12為片段下游引物，帶有Not I酶切位點；
[0012]PCR片段擴增后回收，采用BamH I和Not I雙酶切，連接到pMD18_T載體，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，挑取轉化子，小提質粒，用BamH I和Not I酶切鑒定，鑒定陽性克隆分別命名為T-S和T-P12 ;
[0013]將pET32a ( + )與鑒定的克隆質粒分別以BamH I /Not I進行消化，進行瓊脂糖電泳，膠回收目的片段后進行連接，構建可在大腸桿菌中表達的重組質粒，命名PET-S和PET-P12，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，挑取轉化子，小提質粒，用BamH I和Not I限制性內切酶進行酶切鑒定；
[0014]陽性重組質粒pET-S和pET-P12轉化Rossetta (DE3)感受態細胞，挑選單克隆菌落于氨芐西林鈉LB培養液中培養10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養基37°C振蕩培養至0D600=0.8，加入的終濃度為0.5mmol/L的IPTG，25°C誘導5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，分析確定表達產物在大腸桿菌的存在形式，結果發現重組蛋白以包涵體的形式存在。
[0015]目的蛋白進行SDS-PAGE，命名為S蛋白，純化的S蛋白為包被抗原；
[0016]第二步，HEV標記抗原的制備:
[0017]將陽性克隆pET-P12于Amp+LB培養液中培養10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養基37°C振蕩培養至0D600=0.8，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，25°C誘導5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，確定表達產物以包涵體的形式存在于沉淀，通過蛋白的純化得到的蛋白命名為P12蛋白，為標記蛋白；
[0018]第三步，膠體金的制備，具體包括以下步驟:
[0019]首先將HauC14先配制成0.01%水溶液，取IOOml于磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入lmll%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌，繼續加熱煮沸15min，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續而轉成黑色，隨后逐漸穩定成紅色，全過程2?3min,冷卻至室溫后用蒸懼水恢復至原體積；
[0020]第四步，HEV抗原-膠體金標記物的制備，具體包括以下步驟:
[0021]首先采用紫外分光光度計在0D595測定標記抗原P12的蛋白濃度；[0022]取IOml膠體金，邊攪拌邊緩慢加入100 μ I的0.lMCBpHIO調節pH至7.6，繼續攪拌至完全混勻；標記抗原P12按10 μ g/ml進行標記,繼續攪拌至完全混勻，靜置20min ;力口入0.5ml封閉液，室溫下封閉15分鐘，封閉液為0.5%BSA, 20mMPB, 150Mm NaCl，0.1%穩定劑Τ，0.01%Proclin300, ；12000r/min離心20分鐘，吸出上清，收集沉淀；沉淀中加入1/2體積的金標洗液，超聲混勻；12000r/min離心20min,棄上清，收集沉淀，金標洗液為20mMPB，150mM NaCl, 1%BSA，0.01%NaN3 ;超聲混勻三次，最后收集的沉淀采用pH7.4的膠體金懸浮液，超聲混勻后于4°C保存，膠體金懸浮液為20mM PB, 150mM NaCl，1%BSA，2%Twee_20，
0.2%Sucrose，0.01%Proclin300 ；
[0023]第五步，試紙條的組裝:
[0024]膠體金懸浮液將金標抗原標記物6倍稀釋，均勻的鋪于普通無紡布，加入入量以加入液體開始向外流出為止，于55度烘箱干燥2小時后4°C存放；
[0025]金標懸浮液將S抗原稀釋至1.2mg/ml,將對照抗體稀釋至0.6mg/ml后用噴膜機噴涂在NC膜上形成檢測線和控制線，置37°C烘箱烘烤20?30min。
[0026]進一步,在第一步中，蛋白純化采用Invitrogene clonetech蛋白純化柱,具體步驟如下:
[0027]步驟一，準備IL表達菌體細胞，取5ml菌液12000r/min離心2min，棄去上清，加入lmmol/LPH7.4的PBS充分懸浮，4°C 6000r/min離心15min,保留沉淀,如此反復離心3次；
[0028]步驟二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反復凍融循環3?5次，以實現最大的裂解；
[0029]步驟三，加入100 μ I 的 I XFastBreakTM cell Lysis Reagent 溶液于沉淀中，充分懸浮；
[0030]步驟四，加入I μ I的DNase I ,室溫下200r/min搖震30min ；
[0031]步驟五，加入30 μ I的N1-Particles或加入0.03g的NaCl固體；
[0032]步驟六,采用移液器反復吸吹混合10次后，室溫靜置孵育30min ；
[0033]步驟七，將EP管放入碳磁力架上30s，鎳柱被吸附到靠近磁力架的一邊，用移液器將剩余的液體吸出來；
[0034]步驟八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反復吸吹混合10次，室溫靜置孵育IOmin,之后放入磁力架30s，將剩余的液體吸出來，采用同樣的液體反復洗兩遍，最后一次的液體務必吸干凈，不要有殘留；
[0035]步驟九,加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌體蛋白的液體并分別標號，同時將純化的蛋白和各自的鎳柱進行蛋白電泳分析結果。
[0036]本發明實施例的另一目的在于提供一種硝酸纖維素膜、檢測線、質控線、樣本墊、吸水墊、金標墊、PVC板；
[0037]檢測線和質控線設置在硝酸纖維素膜的左右兩側，吸水墊和金標墊設置在硝酸纖維素膜上方的兩側，樣本墊設置在金標墊上，PVC板設置在硝酸纖維素膜的下方。
[0038]進一步,該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的使用方法:
[0039]首先在樣本墊上的反應孔處加入10 μ I的全血、血清或血漿，讓樣品完全吸收融入圓孔里的樣品墊內，在方孔上方Icm處垂直地拿著緩沖瓶，在試劑盒底部的方孔內加入2滴緩沖液，加緩沖液15分鐘內讀結果，在測試區域內出現粉紅色線的痕跡就表明陽性結果，超過15分鐘后讀取的結果將認為是無效的，必須要重做。
[0040]進一步，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條檢測300份豬血清，靈敏度為98.1%，特異性為98.5%，準確率為96.6%。
[0041]本發明提供的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條及其制備方法，采用雙抗原夾心法來檢測豬血清中的HEV總抗體，利用連接于固相載體上的抗原和酶標抗原分別與樣品中被檢測抗體分子上兩個抗原結合位點結合，形成固相抗原-抗體-酶標抗原免疫復合物，由于反應系統中固相抗原和酶標抗原的量相對于待測抗體是過量的，因此復合物的形成量與待測抗體的含量成正比(在方法可檢測范圍內)，測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質量(0D值)，即可確定待測抗體含量。本發明可以用于豬戊型肝炎病毒總抗體的檢測，診斷操作簡單，檢測時間短，攜帶方便；為戊型肝炎病毒流行病學大規模調查提供相應的研究基礎和一定的技術保障，更好的預防和控制HEV疾病的流行；采用雙抗原夾心法原理，包被抗原與血清中抗體產生特異性結合，結合抗原抗體復合物與標記抗原再次產生抗原抗體反應，兩個抗原結合不同的抗原結合位點，特異性好，靈敏度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]圖1是本發明實施例提供的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的結構示意圖；
[0043]圖中:1、硝酸纖維素膜；2、檢測線；3、質控線；4、樣本墊；5、吸水墊；6、金標墊；7、PVC 板；
[0044]圖2是本發明實施例提供的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法流程圖；
[0045]圖3是本發明實施例提供的S基因的PCR擴增示意圖；
[0046]圖中:M:DL2000marker;1: S 基因擴增片段；
[0047]圖4是本發明實施例提供的P12基因的PCR擴增示意圖；
[0048]圖中:Μ:λ-EcoT14 I digest marker ;1:P12 基因擴增片段;
[0049]圖5是本發明實施例提供的S基因的酶切鑒定示意圖；
[0050]圖中:M:DL2000marker ;1: S基因酶切鑒定片段；
[0051]圖6是本發明實施例提供的P12基因的酶切鑒定示意圖；
[0052]圖中:M:DL2000marker ；1:P12基因酶切鑒定片段；
[0053]圖7是本發明實施例提供的His-S蛋白的SDS-PAGE分析示意圖；
[0054]圖8是本發明實施例提供的His-S蛋白純化示意圖；
[0055]圖9是本發明實施例提供的His_P12蛋白的SDS-PAGE分析示意圖；
[0056]圖10是本發明實施例提供的His_P12蛋白純化示意圖。
【具體實施方式】
[0057]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0058]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。[0059]如圖1所示，本發明實施例的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條主要由吸水玻璃纖維層、硝酸纖維素膜層、吸水濾紙層和白色塑料墊板組成；硝酸纖維素膜1、檢測線2、質控線3、樣本墊4、吸水墊5、金標墊6、PVC板7組成；
[0060]檢測線2和質控線3設置在硝酸纖維素膜I的左右兩側，吸水墊5和金標墊6設置在硝酸纖維素膜I上方的兩側，樣本墊4設置在金標墊6上，PVC板7設置在硝酸纖維素膜I的下方；
[0061]P12抗原和陽性樣本包被硝酸纖維素膜產生的T線(檢測線)和C線(質控線)；硝酸纖維素膜上方為抗原標金后鋪布的無紡布，即金標墊，金標墊上方為樣本墊；硝酸纖維素膜下方為吸水墊，從左至右樣本墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊緊密的排列在PVC板上；
[0062]本發明的使用方法:
[0063]首先在樣本墊上的反應孔處加入10 μ I的全血、血清或血漿，讓樣品完全吸收融入圓孔里的樣品墊內，在方孔上方Icm處垂直地拿著緩沖瓶，在試劑盒底部的方孔內加入2滴緩沖液，加緩沖液15分鐘內讀結果，在測試區域內出現粉紅色線的痕跡就表明陽性結果，超過15分鐘后讀取的結果將認為是無效的，必須要重做。
[0064]檢測結果判斷:
[0065]陽性:反應板孔中質控線端出現粉紅色線，檢測線端出現粉紅色線，為豬HEV總抗體陽性；
[0066]陰性:反應板孔中質控線端出現粉紅色線，檢測線端不出現粉紅色線，為豬HEV總抗體陰性。
[0067]失效:反應板孔中質控線端不出現粉紅色線，或質控線端、檢測線端均不出現粉紅色線,為試劑盒失效。
[0068]如圖2所示，本發明實施例的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0069]SlOl:制備HEV包被抗原；
[0070]S102:制備HEV標記抗原；
[0071]S103:制備膠體金；
[0072]S104:HEV抗原-膠體金標記物的制備；
[0073]S105:組裝膠體金快速診斷試紙條。
[0074]以下結合本發明的具體實施例對本發明做進一步的說明:
[0075]第一步，HEV包被抗原的制備:
[0076]首先PCR擴增豬源SWCH189株HEV 0RF2 (蘭州獸醫研究所傳染病室保存)基因部分的兩個片段，上下游引物設計如表I和表2所示，分別帶有BamH I和Not I酶切位點；
[0077]表1:swCH189株S片段設計引物為:
【權利要求】
1.一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法包括以下步驟: 第一步，HEV包被抗原的制備: 首先PCR擴增豬源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的兩個片段，上下游引物分別帶有BamH I和Not I酶切位點；FS為S片段上游引物，帶有BamH I酶切位點，RS為片段下游引物，帶有Not I酶切位點；FP12為P12片段上游引物，帶有BamH I酶切位點，RP12為片段下游引物，帶有Not I酶切位點； PCR片段擴增后回收，采用BamH I和Not I雙酶切，連接到pMD18_T載體，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，挑取轉化子，小提質粒，用BamH I和Not I酶切鑒定，鑒定陽性克隆分別命名為T-S和T-P12; 將pET32a ( + )與鑒定的克隆質粒分別以BamH I /Not I進行消化，進行瓊脂糖電泳，膠回收目的片段后進行連接，構建可在大腸桿菌中表達的重組質粒，命名PET-S和PET-P12，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，挑取轉化子，小提質粒，用BamH I和Not I限制性內切酶進行酶切鑒定； 陽性重組質粒PET-S和pET-P12轉化Rossetta (DE3)感受態細胞，挑選單克隆菌落于氨節西林鈉LB培養液中培養IOh,菌液以1:100的比例加入到IL含100yg/ml氨節西林鈉的LB培養基37°C振蕩培養至0D600=0.8，加入的終濃度為0.5mmol/L的IPTG，25°C誘導5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton-X_100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，分析確定表達產物在大腸桿菌的存在形式，結果發現重組蛋白以包涵體的形式存在； 目的蛋白進行SDS-PAGE，命名為S蛋白，純化的S蛋白為包被抗原； 第二步，HEV標記抗原的制備: 將陽性克隆PET-P12于Amp+LB培養液中培養10h，菌液以1:100的比例加入到IL含,100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養基37°C振蕩培養至0D600=0.8，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，25°C誘導5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進行SDS_PAGEJ；|定表達產物以包涵體的形式存在于沉淀，通過蛋白的純化得到的蛋白命名為P12蛋白，為標記蛋白； 第三步，膠體金的制備，具體包括以下步驟: 首先將HauC14先配制成0.01%水溶液，取100ml于磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入Iml 1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2Η20)水溶液，邊加熱邊攪拌，繼續加熱煮沸15min，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續而轉成黑色，隨后逐漸穩定成紅色，全過程2~3min，冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積； 第四步，HEV抗原-膠體金標記物的制備，具體包括以下步驟: 首先采用紫外分光光度計在0D595測定標記抗原P12的蛋白濃度； 取IOml膠體金，邊攪拌邊緩慢加入100 μ I的0.lMCBpHIO調節pH至7.6，繼續攪拌至完全混勻；標記抗原P12按10 μ g/ml進行標記,繼續攪拌至完全混勻，靜置20min ;加入,0.5ml封閉液，室溫下封閉15分鐘，封閉液為0.5%BSA, 20mM PB, 150Mm NaCl，0.1%穩定劑Τ，0.01%Proclin300, ；1 2000r/min離心20分鐘，吸出上清，收集沉淀；沉淀中加入1/2體積的金標洗液，超聲混勻；12000r/min離心20min,棄上清,收集沉淀,金標洗液為20mM PB,.150mM NaCl, 1%BSA，0.01%NaN3 ;超聲混勻三次，最后收集的沉淀采用pH7.4的膠體金懸浮液懸浮，超聲混勻后于4°C保存，膠體金懸浮液為20mM PB, 150mM NaCl，1%BSA, 2%Twee_20，.0.2%Sucrose,0.01%Proclin300 ； 第五步，試紙條的組裝: 膠體金懸浮液將金標P12抗原標記物6倍稀釋，均勻的鋪于普通無紡布，加入量以加入液體開始向外流出為止，于55度烘箱干燥2小時后4°C存放； 金標懸浮液將S抗原稀釋至1.2mg/ml,將對照抗體稀釋至0.6mg/ml后用噴膜機噴涂在NC膜上形成檢測線和控制線，置37°C烘箱烘烤20~30min。
2.如權利要求1所述的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的制備方法，其特征在于，在第一步中，蛋白純化采用Invitrogene clonetech蛋白純化柱,具體步驟如下: 步驟一，準備IL表達菌體細胞，取5ml菌液12000r/min離心2min，棄去上清，加入lmmol/L PH7.4的PBS充分懸浮,4°C 6000r/min離心15min,保留沉淀,如此反復離心3次；步驟二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反復凍融循環3~5次，以實現最大的裂解； 步驟三,加入100 μ I的I XFastBreakTMcellLysisReagent溶液于沉淀中，充分懸浮； 步驟四，加入I μ I的DNase I ,室溫下200r/min/min搖震30min ； 步驟五，加入30μ I的N1-Particles或加入0.03g的NaCl固體； 步驟六，采用移液器反復吸吹混合10次后，室溫靜置孵育30min ； 步驟七，加EP管放入碳磁力架上30s，鎳柱被吸附到靠近磁力架的一邊，用移液器將剩余的液體吸出來； 步驟八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反復吸吹混合10次，室溫靜置孵育lOmin，之后放入磁力架30s，將剩余的液體吸出來，采用同樣的液體反復洗兩遍，最后一次的液體務必吸干凈，不要有殘留； 步驟九，加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌體蛋白的液體并分別標號，同時將純化的蛋白和各自的鎳柱進行蛋白電泳分析結果O
3.一種豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條包括:硝酸纖維素膜、檢測線、質控線、樣本墊、吸水墊、金標墊、PVC板； 檢測線和質控線設置在硝酸纖維素膜的左右兩側，吸水墊和金標墊設置在硝酸纖維素膜上方的兩側，樣本墊設置在金標墊上，PVC板設置在硝酸纖維素膜的下方。
4.如權利要求3所述的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條的使用方法: 首先在樣本墊上的反應孔處加入10 μ I的全血、血清或血漿，讓樣品完全吸收融入圓孔里的樣品墊內，在方孔上方Icm處垂直地拿著緩沖瓶，在試劑盒底部的方孔內加入2滴緩沖液，加緩沖液15分鐘內讀結果，在測試區域內出現粉紅色線的痕跡就表明陽性結果，超過15分鐘后讀取的結果將認為是無效的，必須要重做。
5.如權利要求3所述的豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于，該豬HEV總抗體膠體金快速診斷試紙條檢測300份豬血清，靈敏度為98.1%，特異性為98.5%，準確率為96.6%。
【文檔編號】G01N33/543GK103823057SQ201410083353
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】蘭喜, 楊彬, 常曉依, 柳紀省, 張韻, 殷相平, 李寶玉, 李學瑞, 李志勇, 方玉萍 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所