一種采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用納米膜濃縮尿提取微囊泡的方法，首先，收集人的晨尿，低速離心，收集上清液；其次，把上清液經過納米膜濃縮，透析濾過，除去水分和可溶性蛋白，收集納米膜中的上清液；然后，將上清液超速離心，收集沉淀，用超純水重懸，即得到尿微囊泡；本發明方法能夠迅速提取尿樣本中的微囊泡，為臨床和基礎科學研究提供準確的信息，為實現快速、大規模處理尿樣本提供了可能。
【專利說明】一種采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微囊泡提取【技術領域】，具體涉及一種采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法。
【背景技術】
[0002]尿液作為一種無損傷的尿蛋白生物標記物的來源，越來越多的引起大家的興趣。尿微囊泡是由腎小管上皮細胞分泌，釋放進入尿道的囊泡，因此，有可能攜帶有腎臟結構和功能損傷的分子標記物。蛋白組學方法已經鑒定出尿中大量高豐度蛋白，尿微囊泡所含有的信息被認為是疾病的候選生物標記物。尿微囊泡蛋白組學的開發有助于理解泌尿系統尿微囊泡的生物學功能，更有利于理解相關疾病病理生理機制，也是尋找疾病發病機制過程中的尿生物標記物的靶點。
[0003]外泌體(Exosomes)是一類起源于內吞體系統，由細胞多囊體通過質膜融合的方式而分泌的直徑在40_100nm之間的微囊泡。Exosomes最初被發現是在1981年，由Trams等在研究正常細胞和腫瘤細胞脫落小體的5’核苷酸外切酶的活性時，電鏡下發現直徑在500-1000nm的囊泡中還有很多次級囊泡，和直徑大約40nm的囊泡。Exosomes由脂質雙層、跨膜蛋白和含有蛋白的親水核、mRNAs和miciORNAs組成，能夠作為細胞間的載體，通過貨物載體功能，傳遞生物的、生理的和病理的信息。exosomes參與細胞內信號轉導。依賴于其起源，exosomes能夠調節免疫調節過程、建立腫瘤逃逸機制和介導再生和退化過程。exosomes是由分子組成的復雜的細胞間信號器，具有多種功能，是潛在的臨床診斷新工具，潛在的新的疾病治療靶點。
[0004]國內外目前報道的尿微囊泡提取技術主要是超速離心法。超速離心法適用于小量尿樣本的處理，一般不超過5mL尿液，該方法需要200000g的超速離心機，密度梯度離心,價格昂貴，不能一次性處理大量樣本。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，該方法能夠一次性處理大量樣本，且樣本處理量大，所需儀器相對成本較低，處理流程簡便。
[0006]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:一種采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，含以下步驟:
[0007](I)低速離心，選取新鮮晨尿標本，采用低速離心機，離心后，收集上清液；
[0008](2)納米膜濃縮，將步驟(I)中獲得的上清液倒入納米膜中濃縮，透析濾過除去水分和可溶性蛋白，待溶液濾過到靠近納米膜底部時，加入超純水洗脫，進一步除去尿液中的可溶性蛋白，純化尿微囊泡，收集上清液；
[0009](3)超速離心，將步驟(2)獲得的上清液，采用超速離心機離心后，收集離心管底部尿沉淀，用超純水重懸后即得到尿微囊泡。
[0010]本發明步驟(I)中低速離心時離心機的相對離心力RCF為2000g，溫度為室溫，離心時間為30min。
[0011]本發明首先采用低速離心以去除樣本中的細胞碎片、細菌等雜物。
[0012]本發明步驟(I)中采用的新鮮晨尿標本為人的新鮮晨尿，未添加防腐劑，室溫放置不超過3個小時，或者保存于4°C冰箱，如需運輸，需加入干冰。
[0013]本發明步驟(2)中待溶液優選濾過到靠近納米膜底部3?5cm處時，優選加入200mL超純水洗脫，進一步除去尿液中的可溶性蛋白，純化尿微囊泡,優選收集5mL上清液。
[0014]本發明步驟(2)中所述納米膜的截留分子量優選為lOOOkDa。
[0015]當采用的納米膜的截留分子量太低時，所獲得的尿微囊泡純度不夠，含有分子量較大的可溶性蛋白，我們采取的納米膜最大截留分子量，選擇為IOOOkDa,只有當納米膜的截留分子量約為IOOOkDa時，結合低速離心機和超速離心機，能提取出較純的尿微囊泡。
[0016]本發明步驟(3)中超速離心機離心時，離心機的相對離心力RCF為至少40000g，離心溫度為4°C，離心時間為I?2小時。
[0017]本發明步驟(3)中超速離心機離心時，離心機的相對離心力RCF優選為40000?lOOOOOg，離心溫度為4°C，離心時間為I?2小時。
[0018]與現有技術相比，本發明具有如下優點:
[0019](I)本發明處理方法簡便:超速離心法處理大量尿標本時如50mL，需要先將尿液真空干燥至5mL (—般是原體積的10%)，再進行超速離心，提取尿微囊泡；而本發明中則結合納米膜濃縮法利用納米膜透析的同時除去了大量的水分，方便快捷；
[0020](2)本發明方法特異性強:現有技術中超速離心法真空干燥過程中不可避免的會弓I起溫度的改變，可能會破壞尿微囊泡的膜，損失部分微囊泡；
[0021](3)本發明方法節省時間:超速離心法各個流程下來所花費時間較長，處理一個樣品一般需要3-5天的時間，而本發明中的納米膜濃縮法只需要2天的時間；
[0022](4)本發明方法經濟費用低:超速離心法需要200000g的超速離心機，價格昂貴，而本發明中的納米膜濃縮法只需要40000g的離心機，能節省經濟費用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是實施例1-3中尿微囊泡的40000倍透射電鏡圖；
[0024]圖2是實施例1-3中尿微囊泡的50000倍透射電鏡圖；
[0025]圖3是實施例1-3中NanoSight觀察到的尿微囊泡的粒徑濃度圖,其中橫坐標代表粒徑0_900nm,縱坐標代表囊泡濃度,單位IO6個/mL ;
[0026]圖4是實施例1-3中NanoSight觀察到的尿微囊泡的視頻截圖，圖中白色球形亮點即為囊泡；
[0027]圖5是實施例1-3中NanoSight觀察到的尿微囊泡的粒徑相對強度圖，其中橫坐標為粒徑0-900nm，縱坐標為相對強度；
[0028]圖6是實施例1-3中NanoSight觀察到的尿微囊泡的粒徑相對強度三維圖。
【具體實施方式】
[0029]實施例1
[0030]本實施例提供的采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，具體含以下步驟:[0031](I)低速離心:取IOOmL健康志愿者的晨尿標本,進行研究,低速離心機(Allegra?X-22Centrifuge, Beckman Coulter),相對離心力(RCF) 2000g,室溫，30 分鐘，除去細胞碎片、細菌等雜物，收集上清液；
[0032](2)納米膜濃縮:將低速離心收集的上清液全部倒入納米膜中，透析濾過，待溶液濾過到納米膜底部3-5cm處時，加入200mL超純水洗脫，進一步除去尿液中的可溶性蛋白，純化尿微囊泡，收集5mL上清液；
[0033]其中納米膜透析時可以采用簡易的納米膜濃縮裝置，可以使用時自己搭配，具體可以包括漏斗I個，納米膜長度30?35cm，IOOOmL量筒一個，通用型膜夾(UniversalClosures) 一個,封口膜(2cmX6cm)兩片。
[0034]關于納米膜購自仕必純(上海)貿易有限公司Spectrum Labs Inc，其截留分子量為 IOOOkDa0
[0035](3)超速離心:采用超速離心機，RCF40000g，4°C，2小時，丟棄上清液，收集離心管底部尿沉淀，即尿微囊泡，ImL超純水重懸；
[0036]超速離心前，最好利用分析天平對所有樣本進行兩兩配平，保證不損傷分析天平的軸，要求做到精確到小數點后3位(μ g)。
[0037](4)透射電鏡觀察:取步驟(3)中制備的尿微囊泡20 μ L，點樣于銅網，5分鐘后，予3% (W/V)磷鎢酸負染2分鐘，超純水洗滌兩遍，干燥5分鐘后檢測，調節透射電鏡焦距，觀察尿微囊泡的形態和粒徑，具體結果見圖1-2中所示，從圖1-2可以看出，尿微囊泡分布均勻，呈杯狀或圓形，粒徑在30?lOOnm。
[0038]采用透射電鏡觀察之前，要求對所收集的尿微囊泡進行蛋白定量，取10μ g/mL的尿微囊泡進行形態學觀察。蛋白定量可以采取Bradford考馬斯亮藍法對所收集的尿微囊泡進行蛋白定量，取BSA作為標準品，等比稀釋，繪制標準曲線，根據標準曲線檢測待測樣品的尿微囊泡蛋白濃度；重復三次測量，取平均值。
[0039](5)NanoSight檢測:用超純水稀釋尿微囊泡，等比稀釋，稀釋為200倍，針筒上樣，每次2?3m，上樣前后均用超純水清洗檢測槽；調整NanoSight儀器參數，至合適焦距，對微囊泡進行分析記錄。檢測結果見圖3-6中所示，從圖3-6中可以看出，尿微囊泡的粒徑主峰在102nm，沒有雜峰，樣品較純，圖4中顯示，圖中亮點即為尿囊泡，圖5中顯示樣品的粒徑/相對強度圖，其中橫坐標為粒徑0-900nm，縱坐標為相對強度，可見IOOnm粒徑的囊泡占大多數；圖6是樣品的粒徑/相對強度三維圖，從6中也可以看出IOOnm粒徑的囊泡占大多數。
[0040](6)檢測結果
[0041]透射電鏡下尿微囊泡成杯狀或球形，分布均勻，具體可見圖1-2中所示。
[0042]尿微囊泡的粒徑平均值為102nm，具體可見圖3中所示。
[0043]尿微囊泡分布均勻，布朗運動顯著。
[0044]所觀察到的尿微囊泡的數量為3.8X 108/mL，由于樣品稀釋200倍，故原樣品的尿微囊泡的數據應該為7.6X KT/mL。
[0045]實施例2
[0046]本實施例提供的采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，具體含以下步驟:
[0047](I)低速離心:取IOOmL健康志愿者的晨尿標本,進行研究,低速離心機(Allegra?X-22Centrifuge, Beckman Coulter),相對離心力(RCF) 2000g,室溫，30 分鐘，除去細胞碎片、細菌等雜物，收集上清液；
[0048](2)納米膜濃縮:將低速離心收集的上清液全部倒入納米膜中，透析濾過，待溶液濾過到納米膜底部3-5cm處時，加入200mL超純水洗脫，進一步除去尿液中的可溶性蛋白，純化尿微囊泡，收集5mL上清液；
[0049]關于納米膜購自仕必純(上海)貿易有限公司Spectrum Labs Inc,其截留分子量為 IOOOkDa0
[0050](3)超速離心:采用超速離心機，RCF60000g，4°C，1.5小時，丟棄上清液，收集離心
管底部尿沉淀，即尿微囊泡，ImL超純水重懸；
[0051](4)透射電鏡觀察:取步驟(3)中制備的尿微囊泡20 μ L，點樣于銅網，5分鐘后，予3% (W/V)磷鎢酸負染2分鐘，超純水洗滌兩遍，干燥5分鐘后檢測，調節透射電鏡焦距，觀察尿微囊泡的形態和粒徑，具體結果見圖1-2中所示，從圖1-2可以看出，尿微囊泡分布均勻，呈杯狀或圓形，粒徑在30?lOOnm。
[0052](5)NanoSight檢測:用超純水稀釋尿微囊泡，等比稀釋，稀釋為200倍，針筒上樣，每次2?3m，上樣前后均用超純水清洗檢測槽；調整NanoSight儀器參數，至合適焦距，對微囊泡進行分析記錄。檢測結果見圖3-6中所示，從圖3-6中可以看出，尿微囊泡的粒徑主峰在102nm，沒有雜峰，樣品較純，圖4中顯示，圖中亮點即為尿囊泡，圖5中顯示樣品的粒徑/相對強度圖，其中橫坐標為粒徑0-900nm，縱坐標為相對強度，可見IOOnm粒徑的囊泡占大多數；圖6是樣品的粒徑/相對強度三維圖，從6中也可以看出IOOnm粒徑的囊泡占大多數。
[0053](6)檢測結果
[0054]透射電鏡下尿微囊泡成杯狀或球形，分布均勻，具體可見圖1-2中所示。
[0055]尿微囊泡的粒徑平均值為102nm，具體可見圖3中所示。
[0056]尿微囊泡分布均勻，布朗運動顯著。
[0057]實施例3
[0058]本實施例提供的采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，具體含以下步驟:
[0059](I)低速離心:取IOOmL健康志愿者的晨尿標本,進行研究,低速離心機(Allegra?X-22Centrifuge, Beckman Coulter),相對離心力(RCF) 2000g,室溫，30 分鐘，除去細胞碎片、細菌等雜物，收集上清液；
[0060](2)納米膜濃縮:將低速離心收集的上清液全部倒入納米膜中，透析濾過，待溶液濾過到納米膜底部3-5cm處時，加入200mL超純水洗脫，進一步除去尿液中的可溶性蛋白，純化尿微囊泡，收集5mL上清液；
[0061]納米膜購自仕必純(上海)貿易有限公司Spectrum Labs Inc,其截留分子量為IOOOkDa0
[0062](3)超速離心:釆用超速離心機，RCF100000g，4°C，l小時，丟棄上清液，收集離心管底部尿沉淀，即尿微囊泡，ImL超純水重懸；
[0063](4)透射電鏡觀察:取步驟(3)中制備的尿微囊泡20 μ L，點樣于銅網，5分鐘后，予3% (W/V)磷鎢酸負染2分鐘，超純水洗滌兩遍，干燥5分鐘后檢測，調節透射電鏡焦距，觀察尿微囊泡的形態和粒徑，具體結果見圖1-2中所示，從圖1-2可以看出，尿微囊泡分布均勻，呈杯狀或圓形，粒徑在30?lOOnm。
[0064](5)NanoSight檢測:用超純水稀釋尿微囊泡，等比稀釋，稀釋為200倍，針筒上樣，每次2?3m，上樣前后均用超純水清洗檢測槽；調整NanoSight儀器參數，至合適焦距，對微囊泡進行分析記錄。檢測結果見圖3-6中所示，從圖3-6中可以看出，尿微囊泡的粒徑主峰在102nm，沒有雜峰，樣品較純，圖4中顯示，圖中亮點即為尿囊泡，圖5中顯示樣品的粒徑/相對強度圖，其中橫坐標為粒徑0-900nm，縱坐標為相對強度，可見IOOnm粒徑的囊泡占大多數；圖6是樣品的粒徑/相對強度三維圖，從6中也可以看出IOOnm粒徑的囊泡占大多數。
[0065](6)檢測結果
[0066]透射電鏡下尿微囊泡成杯狀或球形，分布均勻；具體可見圖1-2中所示。
[0067]尿微囊泡的粒徑平均值為102nm，具體可見圖3中所示。
[0068]尿微囊泡分布均勻，布朗運動顯著。
[0069]以上列舉具體實施例對本發明進行說明。需要指出的是，以上實施例只用于對本發明作進一步說明，不代表本發明的保護范圍，其他人根據本發明的提示做出的非本質的修改和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，其特征是含以下步驟: (1)低速離心，選取新鮮晨尿標本，采用低速離心機，離心后，收集上清液； (2)納米膜濃縮，將步驟(1)中獲得的上清液倒入納米膜中濃縮，透析濾過除去水分和可溶性蛋白，待溶液濾過至靠近納米膜底部時，加入超純水洗脫，進一步除去尿液中的可溶性蛋白，純化尿微囊泡，收集上清液； (3)超速離心，將步驟(2)獲得的上清液，采用超速離心機離心后，收集離心管底部尿沉淀，用超純水重懸后即得到尿微囊泡。
2.根據權利要求1所述的采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步驟(1)中低速離心時離心機的相對離心力RCF為2000g，溫度為室溫，離心時間為30min。
3.根據權利要求1所述的采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步驟(2)中采用的納米膜的截留分子量為1000kDa的納米膜。
4.根據權利要求1所述的采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步驟(3)中超速離心機離心時，離心機的相對離心力RCF至少為40000g，離心溫度為4°C，離心時間為1~2小時。
5.根據權利要求4所述的采用納米膜濃縮法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步驟(3)中超速離心機離心時，離心機的相對離心力RCF為40000g~100000g，離心溫度為4°C，離心時間為1~2小時。
【文檔編號】G01N1/34GK103900890SQ201410083345
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】哈利·郝瑟福, 鄒和群, 李永強, 谷東風, 姜勇, 盧卡·穆桑特 申請人:南方醫科大學第三附屬醫院