一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，它是用CdTe量子點與單增李斯特氏菌多克隆抗體的偶聯，單增李斯特氏菌單克隆抗體包被光纖，光纖探針插入含有待測菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發生的特異反應從而將抗原固定于光纖上，然后再將該光纖探針插入發含有檢測抗體的溶液中，使檢測抗體上的納米量子點也結合到光纖表面，再利用光纖倏逝波生物傳感器對單增李斯特氏菌進行檢測，對提高食品中病原微生物的檢出率具有重要應用價值，對于促進人類健康和我國的經濟發展具有重要意義。
【專利說明】一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫技術及衛生檢測【技術領域】，具體涉及一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法。
【背景技術】
[0002]目前單核細胞增生李斯特氏菌的檢測已經有多種檢測方法，如傳統的培養檢測方法、免疫學檢測方法、PCR技術及核酸探針等。這些傳統檢測方法包括前增菌、選擇性增菌，鏡檢以及血清學驗證，其方法涉及的實驗繁瑣、操作復雜，需要消耗較長時間，并且難以準確判斷。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種安全、快速、靈敏的檢測食品中單增李斯特氏菌的方法，一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法。
[0004]一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，它包括:
DCdTe量子點與單增李斯特氏菌多克隆抗體的偶聯 取水溶性CdTe量子點與PBS緩沖液混合，單增李斯特氏菌多克隆抗體加入到上述混合液中，然后將加入新制備的EDC溶液，將混合樣品在37 養箱中避光反應2個小時,然后4°C過夜，將反應混合液離心，上清液用超濾膜反復進行超濾，去除小分子物質和未反應的CdTe量子點，收集超濾膜截留的CdTe-多克隆抗體偶聯物；
2)捕獲抗體光纖探針的制備
將聚苯乙烯光纖表面，先用鹽酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下來在超純水中煮沸，使光纖表面具有親水的極化層；然后將處理好的光纖放入單增李斯特氏菌單抗的溶液中浸泡，取出用去離子水洗凈，即得到包被有捕獲抗體光纖探針；
3)單增李斯特氏菌的檢測
將CdTe-多克隆抗體偶聯物制成水溶液，將捕獲抗體光纖探針插入待測溶液中，然后再將捕獲抗體光纖探針放入CdTe-多克隆抗體偶聯物制成水溶液中，用光纖倏逝波生物傳感器檢測；
步驟I)所述的混合樣品，包含1.0mL量子點，1.0mL PBS，400uL抗體，IOOuL EDC ；
步驟2)所述的光纖為聚苯乙烯光纖；
步驟2)所述的單抗的溶液為15 μ g/ml ；
步驟3)所述的CdTe-多克隆抗體偶聯物制成水溶液為100 μ g/ml檢測多克隆抗體。
[0005]本方法建立了一種基于倏逝波場激發的量子點光纖探針生物傳感器檢測單核細胞增生性李斯特氏菌的方法。基于倏逝波場激發的量子點熒光光纖探針生物傳感器是熒光生物傳感器的一種。它主要結合了光在光纖中傳播時產生倏逝波場以及抗體一抗原免疫反應的高特異性和高靈敏度的特點。倏逝波場激發的原理是:當光在光纖內以全反射方式傳輸時，產生一種橫貫光纖的波，通過纖芯與包層的交界處傳出光纖，這種波隨傳播距離呈指數衰減，稱為倏逝波。由于傳送到待測微生物溶液中的倏逝波場深度只有波長量級，所以光纖倏逝波生物傳感器只能探測到結合于倏逝波場范圍內的熒光染料發出的熒光，而溶液中游離的熒光染料對測量結果無影響。因此與其他生物檢測手段相比，光纖倏逝波生物傳感器具有如下優點:1)靈敏度高，生物特異性強；2)操作簡單，測量速度快；3)可以對生物反應過程進行動態監測；4)可以使儀器小型化。
[0006]而量子點具有激發光譜寬，且連續分布，發射光譜呈對稱分布且寬度窄，顏色隨粒徑大小可調，不同發光波長的量子點可用同一波長的光激發，并且光化學穩定性極高，不易分解。量子點代替傳統的熒光染料檢測食品中的病源性微生物，其獲得了更強的熒光強度，更長的發光時間和放大了的信號，從而使得大大的降低了待測樣品的檢測限。
本發明提供了一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，它是用CdTe量子點與單增李斯特氏菌多克隆抗體的偶聯，單增李斯特氏菌單克隆抗體包被光纖，光纖探針插入含有待測菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發生的特異反應從而將抗原固定于光纖上，然后再將該光纖探針插入發含有檢測抗體的溶液中，使檢測抗體上的納米量子點也結合到光纖表面，再利用光纖倏逝波生物傳感器對單增李斯特氏菌進行檢測，該方法提高了檢測效率，對提高食品中病原微生物的檢出率具有重要應用價值，對于促進人類健康和我國的經濟發展具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1單增李斯特氏菌的檢測靈敏性實驗結果；
圖2.單增李斯特氏菌的特異性檢測結果。
【具體實施方式】
[0008]實施例1單核細胞增生李斯特菌抗原菌液的制備和BALB/c小鼠免疫
取本室_80°C保存的單核細胞增生李斯特菌U7tr7W77)，劃線法接種于胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA)培養基(pH7.3 土 0.1)上培養，常規方法增菌培養，6000r/min離心lOmin，收集菌體沉淀，用滅菌生理鹽水重復離洗三次后進行菌落計數(2.4 X IO9 CFU/mL),加入終濃度為0.3%的甲醛4°C過夜使菌體滅活。次日將洗脫好的菌液在20KHZ、150W的冰浴條件下進行超聲波使菌體細胞破碎，每次破碎10s，間隔10s，總用時20min。采用BCA蛋白測定試劑盒測定菌體蛋白含量，結果為2.548 mg/mL。
[0009]取8周齡雌性BALB/c小鼠進行免疫。首免采用上述滅活菌液(2X 108CFU/mL)與等量弗氏完全佐劑混合后腹腔注射50 μ L，皮下注射50 μ L，以后每隔2周免疫I次，換用弗氏不完全佐劑，劑量同前，共免3次。
[0010]3免后，小鼠斷尾采血，用常規間接ELISA方法檢測血清效價。其中，包被抗原是實施例I所制備的單核細胞增生李斯特菌菌液，稀釋度為1:40，陽性血清稀釋度1:1600，酶標二抗為HRP(辣根過氧化物酶)標記的兔抗小鼠IgG (稀釋度為1:15000)。測定結果表明，抗體效價為1:12800。
[0011]實施例2 CdTe量子點與單核細胞增生李斯特氏菌多克隆抗體的偶聯
取ImL的水溶性CdTe量子點與ImL PBS(ρΗ=7.4)緩沖液混合，將500uL的單核細胞增生李斯特氏菌多克隆抗體(lmg/ml)加入到上述混合液中，然后將IOOuL新制備的EDC溶液(4mg/ml)加入到混合液中，樣品在37°C培養箱中避光反應2個小時，然后4°C過夜，將2.5mL反應混合液(包含 1.0mL 量子點，1.0mL PBS,400uL 抗體，IOOuL EDC)5000r/min 離心 2min，取上清液，上清用截留分子量為IOOOOODa的超濾膜反復進行超濾，去除小分子物質和未反應的CdTe量子點，收集超濾膜截留的CdTe-抗體偶聯物，然后用PBS (pH7.4)溶解。4°C避光保存備用。
[0012]實施例3光纖與捕獲抗體的包被
將聚苯乙烯光纖表面，先用清洗液(36-38%濃HCL:70-90%乙醇溶液體積比為1:1)清洗10分鐘，再用70%濃硫酸清洗10分鐘，接下來在超純水中煮沸10分鐘，使光纖表面具有親水的極化層。然后將處理好的光纖放入15 μ g/ml抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體(保藏編號CGMCC N0.6252，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2012年6月20日，抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細胞株)的溶液中浸泡2h，取出用去離子水洗凈，即得到包被有捕獲抗體光纖探針。
[0013]實施例4應用光纖倏逝波生物傳感器檢測單核細胞增生李斯特氏菌
將包被有捕獲抗體光纖探針放入待測溶液中，如果該溶液中存在與光纖探針上捕獲抗體反應的單核細胞增生李斯特氏菌，由于該菌能與捕獲抗體特異性結合從而形成復合分子；然后再將光纖探針放入含有納米量子點標記的100 μ g/ml檢測抗體溶液中，保持lOmin，則該溶液中的檢測抗體與光纖上捕獲抗體結合的單核細胞增生李斯特氏菌通過免疫反應結合，從而將納米量子點固定在光纖上，然后通過光纖倏逝波生物傳感器(光纖倏逝波生物傳感器及光纖均由中科院長春光學精密機械與物理所提供)進行檢測。
[0014]實施例5檢測靈敏度的確定
將單增李斯特氏菌在Half-Fraser液體培養基中，30 °C培養18 h?24 h。然后進行二次增菌，取0.1 ml初次增菌的培養物，加入到10 mL Fraser培養液中，置35 °C培養24 h。TSA-YE瓊脂平板進行計數。將包被單增李斯特氏菌單克隆抗體的光纖分別插入濃度為 3X101 CUF/mL、3.3X102 CUF/mL、3X103 CUF/mL、3X104 CUF/mL、3X105 CUF/mL 和3X IO6 CUF/mL的單增李斯特氏菌溶液中孵育10 min同時加陰性對照，PBS清洗三遍后再與標記量子點的多抗反應lOmin，測量結果如圖1所示。當單增李斯特氏菌菌體濃度為3X IO1-3X IO6 CUF/mL時，可檢測到陽性信號；當菌體濃度小于3X IO1 CUF/mL時結果為陰性。
[0015]實施例6特異性試驗
用建立的免疫光纖生物傳感器檢測單核細胞增生性李斯特氏菌的方法對已知的單核細胞增生性李斯特氏菌(ATCC19111)、產氣莢膜梭菌(ATCC13124)、綿羊李斯特氏菌(ATCC11387)、英諾克李斯特氏菌(ATCC19119)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、腸炎沙門氏菌(ATCC13076)、傷寒沙門氏菌(ATCC13311)、大腸埃希菌(ATCC25922)、蠟樣芽胞桿菌(ATCC11778))、大腸桿菌0157 (ATCC35150)、空腸彎曲桿菌(ATCC33291)等細菌進行特異性交叉試驗，同時設陽性對照、空白對照。結果如圖2所示只有單核細胞增生李斯特氏菌能夠檢出，具有較強的信號。
[0016]實施例7人工添加樣品的檢測
取雞肉25g加入225mL的Half-Fraser液體培養基中，分別加入單核細胞增生李斯特菌懸液，使其濃度分別達到 5CFU/mL，10CFU/mL, 20CFU/mL, 30CFU/mL, 40CFU/mL, 50CFU/mL。均質后取2mL上清，煮沸滅菌，各取I mL用于檢測。每組試驗重復3次。檢測結果如表1所示，其檢測靈敏度可達到30 CFU/mL即在樣品中若含有30CFU/mL的單增李斯特氏菌即可被檢出。
【權利要求】
1.一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，它包括: DCdTe量子點與單增李斯特氏菌多克隆抗體的偶聯 取水溶性CdTe量子點與PBS緩沖液混合，單增李斯特氏菌多克隆抗體加入到上述混合液中，然后將加入新制備的EDC溶液，將混合樣品在37°C養箱中避光反應2個小時,然后4°C過夜，將反應混合液離心，上清液用超濾膜反復進行超濾，去除小分子物質和未反應的CdTe量子點，收集超濾膜截留的CdTe-多克隆抗體偶聯物； 2)捕獲抗體光纖探針的制備 將聚苯乙烯光纖表面，先用鹽酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下來在超純水中煮沸，使光纖表面具有親水的極化層；然后將處理好的光纖放入單增李斯特氏菌單抗的溶液中浸泡，取出用去離子水洗凈，即得到包被有捕獲抗體光纖探針； 3)單增李斯特氏菌的檢測 將CdTe-多克隆抗體偶聯物制成水溶液，將捕獲抗體光纖探針插入待測溶液中，然后再將捕獲抗體光纖探針放入CdTe-多克隆抗體偶聯物制成水溶液中，用光纖倏逝波生物傳感器檢測。
2.根據權利要求1所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，其特征在于:步驟I)所述的混合樣品，包含1.0mL量子點，1.0mL PBS，400uL抗體，IOOuLEDC。
3.根據權利要求2所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，其特征在于:步驟2)所述的光纖為聚苯乙烯光纖。
4.根據權利要求3所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，其特征在于:步驟2)所述的單抗的溶液為15 μ g/mlo
5.根據權利要求4所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特氏菌的方法，其特征在于:步驟3)所述的CdTe-多克隆抗體偶聯物制成水溶液為100 μ g/ml檢測多克隆抗體。
【文檔編號】G01N33/68GK103901210SQ201410082140
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】劉金華, 劉韜, 孟日增, 聶丹丹, 劉陽, 王韋琳 申請人:吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心