一種正品冬蟲夏草的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了十種新的、正品冬蟲夏草特有的蛋白質。本發明還公開了一種正品冬蟲夏草的檢測方法，它是檢測待檢樣品含有前述10種蛋白中任意一種或者任意多種蛋白的方法。本發明正品冬蟲夏草的檢測方法準確度高，操作方便，成本低廉，同時，本發明公開的新的蛋白具有促淋巴細胞增殖的作用，可以制備成為促進淋巴細胞增殖的藥物，應用前景良好。
【專利說明】一種正品冬蟲夏草的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及正品冬蟲夏草的檢測方法。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草為麥角菌科冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲體上的幼蟲尸體及子座的復合體，具有補腎益肺、止血化痰之功效，與人參、鹿茸并稱為中國三大補藥，在臨床上常用于治療久咳虛喘、陽痿遺精、勞嗽咯血、腰膝酸軟等肺腎疾病。現代藥理學研究證明，冬蟲夏草具有免疫調節、抑制腫瘤細胞生長、保護肝腎功能、促進心腦血管循環、降低血糖等藥理作用，在臨床上具有獨特的療效。
[0003]由于冬蟲夏草作用明顯，生長環境特殊、資源稀少，價格昂貴，市場上出現大量摻偽品、混淆品，常見的混淆品包括蛹蟲草(又稱北蟲草)、涼山蟲草、亞香椿蟲草(又名古尼蟲草)、金針蟲草，常見的偽品主要由地蠶、石蠶、僵蠶、甘遂等。
[0004]然而，目前冬蟲夏草的鑒定方法多以形狀、大小、顏色等形狀進行鑒別，跟鑒定人的經驗技術有很大關系，難以準確鑒定。需要尋找一種簡便、準確、可靠的鑒別方法。
【發明內容】
[0005]為了解決上述問題，本發明提供了一種正品冬蟲夏草的檢測方法，還提供了冬蟲夏草特有的10種蛋白質及其用途。
[0006]本發明首先提供了十種新的、正品冬蟲夏草特有的蛋白質，它們的分子量和N端序列分別如下:
[0007]蛋白1:分子量為13.136KDa, N端序列為GAVLWVPSV ；
[0008]蛋白2:分子量為11.749KDa, N端序列為DQEYTVF ；
[0009]蛋白3:分子量為13.871KDa, N端序列為KRHEVVYPW ；
[0010]蛋白4:分子量為22.535KDa, N端序列為YWSMNEK ；
[0011]蛋白5:分子量為35.674KDa, N端序列為HRDQNPE ；
[0012]蛋白6:分子量為34.061KDa, N端序列為CMTWYE ；
[0013]蛋白7:分子量為36.931KDa, N端序列為LPWFRHY ；
[0014]蛋白8:分子量為39.032KDa, N端序列為PVAGMSK ；
[0015]蛋白9:分子量為96.178KDa, N端序列為CTWSPRV ；
[0016]蛋白10:分子量為95.497KDa, N端序列為GAVLWVPSV。
[0017]本發明正品冬蟲夏草的檢測方法，它是檢測待檢樣品中含有前述10種蛋白的任意一種或者任意多種的方法。
[0018]本發明正品冬蟲夏草的檢測方法，它包括如下步驟:
[0019](I)取待檢樣品，組織破碎，用中性緩沖液浸提，離心，得上清液；
[0020](2)檢測步驟(I)所得上清液含有分子量為13.136kDa、ll.749kDa、13.871kDa、22.535kDa、35.674kDa、34.061kDa、36.931kDa、39.032kDa、96.178kDa 和 / 或 95.497kDa 的蛋白。
[0021]中性緩沖液，是指pH范圍為6?8的緩沖液。
[0022]浸提，系指將藥材中的可溶物轉移到適宜溶劑中的過程。
[0023]優選地，步驟(I)所述組織破碎采用液氮研磨法，具體地，將待檢樣品置于冷研缽中，加入液氮迅速研磨成細粉。
[0024]優選地，步驟(I)所述中性緩沖液為磷酸鹽緩沖液。進一步優選地，所述所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.3。
[0025]優選地，步驟(I)所述中性緩沖液加有抗氧化劑和表面活性劑。
[0026]優選地，所述抗氧化劑為β -巰基乙醇；所述表面活性劑為TweenSO。
[0027]其中，所述β -巰基乙醇的濃度為0.2%?l%(w/v);所述Tween80濃度為0.2%?1% (w/v)。優選地，Tween80濃度為0.5% (w/v);所述β _巰基乙醇的濃度為0.2% (w/v)。
[0028]優選地，步驟(I)所述浸提是研磨浸提。
[0029]優選地，步驟(I)所述浸提的時間是I?4h，優選為4h。
[0030]步驟(2)中，所述分子量為13.136KDa的蛋白質，其N端序列為GAVLWVPSV。
[0031]所述分子量為11.749KDa的蛋白質，其N端序列為DQEYTVF。
[0032]所述分子量為13.87IKDa的蛋白質，其N端序列為KRHEVVYPW。
[0033]所述分子量為22.535KDa的蛋白質，其N端序列為YWSMNEK。
[0034]所述其分子量為35.674KDa的蛋白質，其N端序列為HRDQNPE。
[0035]所述分子量為34.06IKDa的蛋白質，其N端序列為CMTWYE。
[0036]所述分子量為36.93IKDa的蛋白質，其N端序列為LPWFRHY。
[0037]所述分子量為39.032KDa的蛋白質，其N端序列為PVAGMSK。
[0038]所述分子量為96.178KDa的蛋白質，其N端序列為CTWSPRV。
[0039]所述分子量為95.497KDa的蛋白質，其N端序列為GAVLWVPSV。
[0040]優選地，步驟(2)所述檢測包含如下步驟:
[0041]I)取步驟(I)所述上清液，純化，加入樣品緩沖液，即為上樣液；
[0042]2)上樣，電泳，染色，洗脫，即可。
[0043]步驟I)中，所述純化采用TCA/丙酮法、Readyprep2-D cleanup kit純化法或者TCA/丙酮法與Readyprep2_D cleanup kit法聯用的方法。
[0044]所述TCA/丙酮法的步驟如下:在步驟(I)的上清液中，加入8?10倍體積的含有0.07%DTT的10%TCA/丙酮溶液，混勻，靜置，離心，棄上清，加入丙酮洗滌，干燥，用2-DE水化液或者含有0.05%DTT的PBS磷酸鹽緩沖液溶解解，離心，上清即為純化蛋白液。
[0045]10%TCA/丙酮溶液:是指1gTCA (三氯乙酸)加入到10ml丙酮中形成的溶液。
[0046]所述Readyprep2_D cleanup kit 純化法是指米用 Readyprep2_D cleanup kit 純化的方法，步驟如下:
[0047]①在步驟(I)的上清液中，加入上清液3倍體積的沉淀劑I,混合,冰浴15min ；
[0048]②加入上清液3倍體積的沉淀劑2，混合；離心，棄上清，重復2?3次；
[0049]③加入上清液0.4倍體積的洗劑1，離心，棄洗劑；
[0050]④加入上清液3倍0.25倍體積的水，混勻，加入上清液0.0I倍體積的洗劑2和上清液0.05倍體積的洗劑2附加劑，混勻，-20°C冷凍30min，過程中每1min漩渦混合30秒；
[0051]⑤離心，棄上清，重復I次，干燥；
[0052]⑥加入2-DE水化液或者含有0.05%DTT的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，上清液即為純化樣品液。
[0053]所述TCA/丙酮法與Readyprep2_D cleanup kit法聯用的方法(即TCA/丙酮法+Readyprep2-D cleanup kit兩步純化法)，步驟如下:
[0054]1、TCA/丙酮法:在步驟(1)的上清液中，加入8~10倍體積的含有0.07%DTT的TCA/丙酮溶液，混勻，靜置，離心，棄上清，加入丙酮洗滌，干燥，用磷酸鹽緩沖液溶解，得TCA/丙酮純化液；
[0055]I1、Readyprep2_D cleanup kit 法:米用 Readyprep2_D cleanup kit 純化:
[0056]①在TCA/丙酮純化液加入3倍體積的沉淀劑I,混合,冰浴15min ；
[0057]②加入TCA/丙酮純化液3倍體積的沉淀劑2，漩渦混合，離心，棄上清，重復2~3次；
[0058]③加入TCA/丙酮純化液0.4倍體積的洗劑1，離心，棄洗劑；
[0059]④加入TCA/丙酮純化液3倍0.25倍體積的水，混勻，加入TCA/丙酮純化液0.01倍體積的洗劑2和TCA/丙酮純化液0.05倍體積的洗劑2附加劑，混勻，-20°C冷凍30min，過程中每1min漩渦混合30秒；
[0060]⑤離心，棄上清，重復I次，干燥；
[0061]⑥加入2-DE水化液或者含有0.05%DTT的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，上清液即為純化樣品液。
[0062]步驟I)中,所述上樣液中，蛋白濃度為I~3μ g/μ I,優選為2 μ g/μ I。
[0063]步驟I)中，所述樣品緩沖液是添加有0.lmol/1溴酚藍、2% (w/v) SDS,25% (v/v)甘油和14.4mmol/L^-巰基乙醇的Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl的濃度為60mmol/l。
[0064]步驟2)中，所述電泳為SDS-PAGE電泳、Tricine-SDS-PAGE電泳或者雙向電泳。
[0065]其中，所述SDS-PAGE電泳中，分離膠濃度為12%、交聯度為3%，濃縮膠濃度為4%、交聯度為3%。
[0066]其中，所述Tricine-SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為16.5%、交聯度為5%，濃縮膠濃度為4%、交聯度為3%。
[0067]所述雙向電泳中，等電聚焦電泳的程序如下表:
[0068]
【權利要求】
1.10種蛋白質，其特征在于:它們的分子量和N端序列分別如下: 蛋白1:分子量為13.136KDa，N端序列為GAVLffVPSV ； 蛋白2:分子量為11.749KDa，N端序列為DQEYTVF ； 蛋白3:分子量為13.871KDa，N端序列為KRHEVVYPW ； 蛋白4:分子量為22.535KDa，N端序列為YWSMNEK ； 蛋白5:分子量為35.674KDa，N端序列為HRDQNPE ； 蛋白6:分子量為34.061KDa，N端序列為CMTWYE ； 蛋白7:分子量為36.931KDa，N端序列為LPWFRHY ； 蛋白8:分子量為39.032KDa，N端序列為PVAGMSK ； 蛋白9:分子量為96.178KDa，N端序列為CTWSPRV ； 蛋白10:分子量為95.497KDa，N端序列為GAVLWVPSV。
2.一種正品冬蟲夏草的檢測方法，其特征在于:它是檢測待檢樣品含有權利要求1所述10種蛋白中任意一種或者任意多種蛋白的方法。
3.根據權利要求2所述 的檢測方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)取待檢樣品，組織破碎，用中性緩沖液浸提，離心，得上清液； (2)檢測步驟(1)所得上清液含有分子量為13.136kDa、11.749kDa、13.871kDa、22.535kDa、35.674kDa、34.061kDa、36.931kDa、39.032kDa、96.178kDa和 / 或 95.497kDa 的蛋白； 優選地，步驟(1)所述組織破碎的方法為液氮研磨法； 優選地，步驟(1)所述中性緩沖液是磷酸鹽緩沖液；進一步優選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.3 ; 優選地，步驟(1)所述中性緩沖液中添加有抗氧化劑和表面活性劑；進一步優選地，所述抗氧化劑為β -巰基乙醇；所述表面活性劑為TweenSO ； 優選地，步驟(1)所述浸提的時間是I~4h。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述β-巰基乙醇的濃度為0.2%~1% (w/v);所述 Tween80 濃度為 0.2% ~1% (w/v)。
5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述β-巰基乙醇的濃度為0.2%(w/V);所述 Tween80 濃度為 0.5% (w/v)。
6.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述檢測的步驟如下: 1)取步驟(1)所述上清液，純化，得純化蛋白液； 2)上樣，電泳，染色，洗脫，即可。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于:步驟I)中，所述純化采用TCA/丙酮法、Readyprep2_D cleanup kit 法或者 TCA/ 丙酮法與 Readyprep2_D cleanup kit 法聯用的方法； 優選地，所述TCA/丙酮法的步驟如下:在步驟(1)的上清液中，加入8~10倍體積的含有0.07% (w/v)DTT的10%TCA/丙酮溶液，混勻，靜置，離心，棄上清，用丙酮洗滌，干燥，再用2-DE水化液或者含有0.05%DTT的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，上清即為純化蛋白液； 優選地，所述Readyprep2_D cleanup kit 純化法是指米用 Readyprep2_D cleanup kit純化的方法，步驟如下:①在步驟(1)的上清液中，加入上清液3倍體積的沉淀劑I,混合,冰浴15min； ②加入上清液3倍體積的沉淀劑2，混合；離心，棄上清，重復2~3次； ③加入上清液0.4倍體積的洗劑1，離心，棄洗劑； ④加入上清液3倍0.25倍體積的水，混勻，加入上清液0.01倍體積的洗劑2和上清液.0.05倍體積的洗劑2附加劑，混勻，-20°C冷凍30min，過程中每1min漩渦混合30秒； ⑤離心，棄上清，重復I次，干燥； ⑥加入2-DE水化液或者含有0.05%DTT的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，上清液即為純化樣品液； 優選地，所述TCA/丙酮法與Readyprep2_D cleanup kit法聯用的方法,步驟如下: . 1、TCA/丙酮法:在步驟(1)的上清液中，加入8~10倍體積的含有0.07%DTT的TCA/丙酮溶液，混勻，靜置，離心，棄上清，加入丙酮洗滌，干燥，用磷酸鹽緩沖液溶解，得TCA/丙酮純化液； I1、Readyprep2_Dcleanup kit 法:米用 Readyprep2_D cleanup kit 純化: ①在TCA/丙酮純化液加入3倍體積的沉淀劑I，混合，冰浴15min； ②加入TCA/丙酮純化液3倍體積的沉淀劑2，漩渦混合，離心，棄上清，重復2~3次； ③加入TCA/丙酮純化液0.4倍體積的洗劑1，離心，棄洗劑； ④加入TCA/丙酮純化液3倍0.25倍體積的水，混勻，加入TCA/丙酮純化液0.01倍體積的洗劑2和TCA/丙酮純化液0.05倍體積的洗劑2附加劑，混勻，-20°C冷凍30min，過程中每1min鏇渦混合30秒； ⑤離心，棄上清，重復I次，干燥； ⑥加入2-DE水化液或者含有0.05%DTT的磷酸鹽緩沖液溶解，離心，上清液即為純化樣品液。
8.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于:步驟2)中，所述電泳為SDS-PAGE電泳、Tricine-SDS-PAGE電泳或者雙向電泳； 優選地，所述SDS-PAGE電泳中，分離膠濃度為12%、交聯度為3%，濃縮膠濃度為4%、交聯度為3% ； 優選地，所述Tricine-SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為16.5%、交聯度為5%，濃縮膠濃度為4%、交聯度為3% ； 優選地，所述雙向電泳中，等電聚焦電泳的程序如下表:
SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為12%、交聯度為2.7%，濃縮膠濃度為4%、交聯度為2.7%。
9.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于:所述電泳為雙向電泳時，上樣量以蛋白重量計為600 μ go
10.權利要求1所述的10種蛋白質在制備促進淋巴細胞增殖的藥物中的用途。
【文檔編號】G01N1/28GK104076082SQ201410082003
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2013年3月7日
【發明者】國錦琳, 陳璐, 彭成, 萬德光 申請人:成都中醫藥大學