一種血液及尿液中硫化氫的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種血液及尿液中硫化氫的檢測方法。利用硫化氫與對氨基二甲基苯胺及三氯化鐵作用，形成疏水性的亞甲基藍，通過分散液液微萃取，既分離了尿液、血液基體對顯色反應的干擾，又進行富集，提高了檢測的靈敏度。所加入乙腈消除基體干擾，同時起到分散液液微萃取中分散劑的作用，萃取效果好，富集倍數大，檢測限可達到0.02μg/mL。方法具有準確度高、檢測樣本量大、檢測樣品量少、檢測效率高等特點。
【專利說明】一種血液及尿液中硫化氫的檢測方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于體內藥物檢測【技術領域】，具體涉及一種血液及尿液中硫化氫的檢測方法。 【背景技術】
[0002]內源性硫化氫(H2S)是一種新近發現的氣體信號分子，對神經、心血管、消化、呼吸、代謝以及生殖系統的生理功能具有重要的調節意義，而且參與這些系統的許多疾病的病理生理調節，尤其與心血管系統緊密相連，拓展了 H2S在心血管系統的藥理學領域，以H2S為靶點的治療具有潛在的臨床應用前景。越來越多的證據表明內源性H2S與多種疾病有著密切的關系，在臨床多種疾病中，內源性H2S的生成和代謝發生了改變，并進一步影響了疾病的發展過程。一種可靠、準確的血液、尿液中內源性H2S的測定方法對監測體內H2S含量及相關疾病的預測及診斷有重要意義。
[0003]H2S檢測方法主要包括亞甲基蘭分光光度法、硫離子選擇電極法、熒光衍生法、氣相色譜法、熒光探針及免疫分析法等。目前現有H2S檢測技術主要集中在大氣、水等環境樣品中。其檢測靈敏度在lmg/kg，而體內內源性硫化氫(H2S)含量在Mmol級，且基體干擾大及樣品量少等影響，目前沒有成熟檢測技術及方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種穩定性好、干擾小、準確、靈敏測定血液及尿液中硫化氫含量的方法。
[0005]本發明的目的通過以下技術方案予以實現。
[0006]除非另有說明，本發明所采用的百分數均為重量百分數。
[0007]一種血液及尿液中硫化氫的檢測方法，包括以下步驟:
(1)硫化氫標準工作曲線的制作:分別取S2-濃度為Wg/mL的Na2S標準溶液0.20、
0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸懼水稀釋至5mL,搖勻,放置20min。于波長665nm處,測定吸光度，制作工作曲線，得到硫化氫的線性回歸方程、相關系數、相對標準偏差、回收率；
(2)樣品檢測:
尿液的檢測:取5mL尿液，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入有機溶劑萃取劑300μ?，加入乙腈0.5~2mL，渦旋混合lmin，離心，分相，將有機溶劑萃取劑取出，于波長665nm處，測定吸光度，代入回歸方程，計算出樣品中硫化氫的含量；
血液的檢測:取5mL新鮮血液，放入離心機中離心，取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL，離心分離，取上清液2mL，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入有機溶劑萃取劑300μ?,潤旋混合lmin,離心,分相,將有機溶劑萃取劑取出，于波長665nm處,測定吸光度，代入回歸方程，計算出樣品中硫化氫的含量；
其中，步驟(1) (2)中所述的0.2%對氨基二甲基苯胺為0.1g對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶于50mL 6mol/L鹽酸；三氯化鐵溶液為25g三氯化鐵溶于50mL蒸餾水中；有機萃取劑包括四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷中之一種；分散劑包括甲醇、乙腈、丙酮中之一種；離心時間 10-25min，離心速率 3000-8000r / min。
[0008]相對于現有技術，本發明具有以下顯著優點:
1、通過硫化氫與三氯化鐵及對氨基二甲基苯胺作用，形成疏水性的亞甲基藍，利用分散液液微萃取技術萃取亞甲基藍，既分離了三價鐵離子、尿液、血液基體對顯色反應的干擾，又進行富集，提高了檢測的靈敏度，檢測限可達到0.02Pg/mL。
[0009]2、通過加入乙腈消除基體干擾，同時起到分散液液微萃取中分散劑的作用，萃取效果好，富集倍數大。
【具體實施方式】
[0010]下面結合實施例對本發明作進一步地說明，但本發明的保護范圍并不限于此。
[0011]實施例1
利用本發明檢測人 體尿液中硫化氫的含量。
[0012]1、硫化氫標準工作曲線的制作:分別取S2I農度為lPg/mL的Na2S標準溶液0.20、
0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入有機溶劑萃取劑30(^L，乙腈0.5mL，于波長665nm處，測定吸光度，得到線性回歸方程y=0.5805x+0.0015，相關系數R2=0.9980，6次平行測定，相對標準偏差RSD=L 21、回收率=94.5% ；
2、尿液的檢測:取5mL尿液，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min。加入三氯甲烷300μ?,乙腈0.5mL,潤旋混合lmin,4000r / min離心IOmin,分相,取出管底三氯甲燒,于波長665nm處，測定吸光度為0.031，代入步驟(1)所得的線性回歸方程，計算出尿液中硫化氫的含量為0.053Pg/mL。
[0013]實施例2
利用本發明檢測人體血液中硫化氫的含量。
[0014]1.按實施例1制作硫化氫標準工作曲線。
[0015]2.血液的檢測:取5mL新鮮血液,放入離心機中，離心6000r / min離心20min,取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL, 5000r / min離心IOmin,取上清液2mL,加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL,搖勻，放置20min。加入四氯化碳300μ?,潤旋混合lmin, 3500r / min離心12min,分相，取出管底四氯化碳，于波長665nm處，測定吸光度為0.028，代入步驟(1)所得的線性回歸方程，計算出血液中硫化氫的含量為0.(MOPg/mL。
[0016]實施例3
利用本發明檢測人體血液中硫化氫的含量。
[0017]1.按實施例1制作硫化氫標準工作曲線。
[0018]2.血液的檢測:取5mL新鮮血液,放入離心機中，離心8000r / min離心IOmin,取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL, 6000r / min離心5min,取上清液2mL,加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μL，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL,搖勻，放置20min。加入二氯化碳300μ?,潤旋混合lmin,5000r / min離心5min,分相，取出管底二氯化碳，于波長665nm處，測定吸光度為0.026，代入步驟(1)所得的線性回歸方程,計算出血液中硫化氫 的含量 為0.043Pg/mL。
【權利要求】
1.一種血液及尿液中硫化氫的檢測方法，包括以下步驟: (1)硫化氫標準工作曲線的制作:分別取S2-濃度為Wg/mL的Na2S標準溶液0.20、0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min，于波長665nm處，測定吸光度，制作工作曲線，得到硫化氫的線性回歸方程、相關系數、相對標準偏差、回收率； (2)樣品檢測: 尿液的檢測:取5mL尿液，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min，加入有機溶劑萃取劑300μ?，乙腈0.5 mL,渦旋混合lmin，離心，分相，將有機溶劑萃取劑取出，于波長665nm處，測定吸光度，代入回歸方程，計算出樣品中硫化氫的含量； 血液的檢測:取5mL新鮮血液，放入離心機中離心，取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL，離心分離，取上清液2mL，加入0.2%對氨基二甲基苯胺200μ?，立即加蓋緩慢倒轉均勻，再加入50%三氯化鐵溶液I滴，用蒸餾水稀釋至5mL，搖勻，放置20min，加入有機溶劑萃取劑300μ?,潤旋混合lmin,離心,分相,將有機溶劑萃取劑取出，于波長665nm處,測定吸光度，代入回歸方程，計算出樣 品中硫化氫的含量。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述的0.2%對氨基二甲基苯胺為0.1g對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶于50mL 6mol/L鹽酸。
3.權利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述的50%三氯化鐵溶液為25g三氯化鐵溶于50mL蒸餾水中。
4.權利要求1所述的檢測方法，其特征在于:分散劑包括甲醇、乙腈、丙酮中之一種。
5.權利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述的有機萃取劑包括四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷中之一種。
6.權利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述的離心時間10-25min，離心速率3000-8000r / min0
【文檔編號】G01N21/31GK103776786SQ201410062197
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月22日 優先權日:2014年2月22日
【發明者】楊亞玲, 趙嬌, 寧金艷, 王軍, 呂云輝 申請人:云南健牛生物科技有限公司