一種醬油中羧甲基賴氨酸的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種醬油中羧甲基賴氨酸的檢測方法，首先，進行醬油體系中CML的檢測前處理，包括游離態CML和結合態CML的檢測前處理；游離態CML檢測前處理：取樣，添加甲醇溶液稀釋，漩渦混勻，C18固相萃取柱凈化，加甲醇溶液洗脫，經微濾膜過濾后制得待測樣品1；結合態CML檢測前處理：取樣，硼氫化鈉還原，透析袋分離多肽及蛋白，鹽酸水解，真空除酸，C18固相萃取柱凈化，微濾膜過濾，真空干燥，復溶后制得待測樣品2；接著，對待測樣品1和2分別進行CML檢測；CML總含量為游離態CML與結合態CML含量的加和。本發明樣品前處理方法，具有排除干擾、保護色譜柱、安全可靠、能完整分析醬油中全部CML等特點。
【專利說明】一種醬油中羧甲基賴氨酸的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品檢測【技術領域】，具體涉及一種檢測食品中羧甲基賴氨酸(CML)的方法，尤其適用于醬油中CML含量的檢測，體系中CML的總含量為游離態CML與結合態CML含量的加和。
【背景技術】
[0002]CML是食品和生物體中由美拉德反應產生的高度氧化的化合物，此外，還可由糖氧化、脂質氧化中間產物經復雜變化產生，分為游離態CML (糖基化氨基酸)和結合態CML (糖基化多肽及蛋白質)。現有研究表明，食源性CML可能與腎衰竭、糖尿病、慢性心力衰竭、動脈粥樣硬化、老年癡呆癥等疾病的惡化有關，其中游離態CML對人體的危害更大。醬油是由大豆、小麥、水、鹽等原料經長期發酵制得的調味品，體系中富含蛋白質及碳水化合物，長期的發酵過程可能使其含有大量的CML，對人體健康造成潛在危害。
[0003]已報道的CML檢測方法主要有:ELISA、HPLC、GC-MS、LC-MS等。ELISA是CML檢測最為簡便、快速的方法，但由于在復雜的食品體系中，該技術特異性差、抗干擾能力差，因而其檢測結果備受質疑；HPLC和GC-MS技術分別需要對待測樣本進行熒光性和揮發性衍生處理，該過程耗時、操作復雜且會降低檢測靈敏度；LC-MS技術由于其高特異性、可靠性、可直接檢測不需衍生化處理等特性，被認為是CML檢測的最優技術。
[0004]為了確保檢測結果的準確性以及保護液-質系統，食品樣品使用LC-MS進行CML檢測前通常需要經過適當的前處理。目前還未有完善的醬油中CML檢測的前處理方法。已報道的液-質聯用檢測食品中CML的前處理方法主要為:取樣、硼氫化鈉還原、三氯乙酸(TCA)沉淀分離蛋白、蛋白鹽酸水解、干燥、復溶制得待測樣品。中國專利文獻CN103293243A公開了一種食品中羧甲基賴氨酸成分的檢測方法，并具體公開了脫脂、TCA沉淀分離蛋白、蛋白質鹽酸水解、FMOC-CL衍生、濃縮、溶解的前處理步驟。
[0005]但是，醬油中總氮45%存在于低分子量多肽(l_5kDa)中，45%存在于游離氨基酸中，上述TCA法不能完全沉淀分離低分子量多肽(糖基化多肽)，且無法沉淀分離游離氨基酸(糖基化氨基酸)，故無法完整得到醬油體系中總的CML含量，嚴重影響檢測結果的準確性和可靠性。
[0006]現在還沒有專門針對醬油中游離態CML檢測的前處理方法，也沒有將透析法應用到醬油中結合態CML檢測前處理技術中的報道。
【發明內容】
[0007]為解決現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于提供一種醬油中CML的定量檢測方法；將醬油體系中CML的檢測前處理分為游離態CML和結合態CML兩部分，可準確地獲得醬油中CML的完整含量。其中游離態CML檢測前處理可有效除去體系中大分子雜質及色素，具有防止污染色譜柱、延長色譜柱使用壽命等特點；結合態CML檢測前處理可完全分離醬油體系中蛋白質及多肽，具有可完整分析醬油中總的結合態CML含量的特點。[0008]本發明的目的通過以下技術方案實現:
[0009]—種醬油中羧甲基賴氨酸的檢測方法，首先，進行醬油體系中CML的檢測前處理，包括游離態CML的檢測前處理和結合態CML的檢測前處理；所述游離態CML的檢測前處理方法的具體步驟如下:
[0010](I)向醬油樣品中加甲醇溶液稀釋，漩渦混勻；
[0011](2)取上述稀釋液使用C18固相萃取柱凈化，加入甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；所述每ImL稀釋液對應甲醇溶液的添加量為5-8mL ；
[0012](3)將所述洗脫液經微濾膜處理，得到所需待測樣品I ;
[0013]所述結合態CML的檢測前處理方法的具體步驟如下:
[0014](I)向醬油樣品中加入硼酸緩沖液及硼氫化鈉溶液進行還原處理，所述醬油取樣量為3-7.5mg肽態氮含量當量；
[0015](2)將還原后的樣品于4°C條件下，采用截留分子量為500_1000Da的透析袋，每隔24h更換一次透析袋外液體，靜置透析5-7d ；
[0016](3)取透析袋內液體，加12mol/L的HCl使體系中HCl的濃度達到6mol/L，然后在110°C下水解12?16h ；
[0017](4)真空干燥除酸，加蒸餾水復溶，使用C18固相萃取柱凈化，加5_8mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；
[0018](5)將所述洗脫液經微濾膜處理，干燥、加100?300 μ L甲醇溶液復溶后制得待測樣品2 ；
[0019]然后，將經過前處理的待測樣品I和2分別進行CML檢測。
[0020]所述游離態CML的檢測前處理方法中步驟(1)，甲醇溶液的體積濃度為10%，稀釋倍數為100倍。
[0021]所述游離態CML的檢測前處理方法中步驟(2)，所述C18固相萃取柱使用前經3mL無水甲醇活化處理。
[0022]所述游離態CML的檢測前處理方法中步驟(2)，甲醇溶液的體積濃度為10%。
[0023]所述游離態CML的檢測前處理方法中步驟(3)，所述微濾膜孔徑為0.22 μ m。
[0024]所述結合態CML的檢測前處理方法中步驟(1)，所述硼酸緩沖液(0.5mol/L, pH9.2)添加后使體系中硼酸鈉最終摩爾濃度達到0.2mol/L，所述硼氫化鈉溶液(2mol/L的硼氫化鈉溶液溶于0.lmol/L的氫氧化鈉溶液)添加后使體系中硼氫化鈉的最終濃度達到
0.lmol/L。
[0025]所述結合態CML的檢測前處理方法中步驟(4)，所述C18固相萃取柱(2000mg/12mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)使用前經3mL無水甲醇活化處理，甲醇溶液的體積濃度為10%。
[0026]所述結合態CML的檢測前處理方法中步驟(5)，所述微濾膜孔徑為0.22 μ m。
[0027]所述結合態CML的檢測前處理方法中復溶步驟，甲醇溶液的體積濃度為10%。
[0028]所述CML檢測采用高效液相色譜-質譜。
[0029]所述高效液相色譜采用Watersl525機型,檢測條件為:
[0030]色譜柱:WatersAtlantis C18 色譜柱 4.6 X 150mm, 5 μ m
[0031]柱溫:30°C[0032]流動相:甲醇:水=1:9
[0033]流速:0.5mL/min
[0034]進樣量:IOyL;
[0035]質譜為單重四級桿質譜,采用機型為Waters Micromass ZQ,檢測條件為:
[0036]離子源:ESI+
[0037]毛細管電壓:3.0kV
[0038]錐孔電壓:20V
[0039]離子源溫度:100 °C
[0040]脫溶溫度:300°C
[0041]掃描模式:單離子記錄
[0042]CML 質荷比:205 (M+)。
[0043]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0044](I)本發明全面考慮醬油中游離態CML與結合態CML的含量，按照醬油樣本的特性將其所含游離態CML、結合態CML分別提取、純化，可準確獲得醬油中總的CML含量。
[0045](2)本發明所述的醬油中游離態CML的檢測前處理方法，采用C18固相萃取柱進行凈化處理，能夠除去待測樣品中本身含有的蛋白質分子、脂肪分子以及與CML分子量相近的干擾分子，同時由于C18是非極性吸附劑，而目標分子CML是極性分子，使用C18固相萃取柱對樣品進行凈化處理，在吸附樣品中雜質分子的同時，避免對目標分子的吸附，是一種安全可靠、成本低、操作簡單的前處理方法，具有提高檢測準確性、靈敏度，保護色譜柱及液-質系統的特點。
[0046](3)本發明所述的醬油中結合態CML的檢測前處理方法，當醬油取樣量為3mg肽態氮含量當量(最適取樣量范圍較低值)時，結合態CML檢測質譜響應信號良好，且可減少樣品中硼酸緩沖液及硼氫化鈉溶液的添加，從而減少雜質鹽的引入；本實驗采用截留分子量為500Da的透析袋，即分子量小于500的分子如游離態CML、硼酸鈉、硼氫化鈉、小分子色素等可自由進出半透膜，靜置一段時間后透析袋內外的溶液小分子達到平衡，即內外小分子濃度相同，此時更換透析袋外液體，經7d透析處理后可基本除去透析袋內游離態CML及其它小分子物質，此外，醬油體系中蛋白質和多肽的分子量95%大于lOOODa，因而會被阻擋在透析袋內，故此過程可分離醬油體系中游離態CML和結合態CML，并可完整獲得結合態CML ；本實驗采用優選水解時間12h，該條件既可使結合態CML完全水解釋放，又節省了能耗保證了實驗的安全性。
[0047](4)本發明所述樣品前處理方法，采用孔徑為0.22 μ m微濾膜進行過濾，以防止樣品中含有大粒徑雜質分子而對色譜系統造成損壞，同時也在一定程度上起到凈化樣品的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0048]圖1為CML標準品的色譜圖；
[0049]圖2為CML濃度和質譜信號峰面積關系的標準曲線。
【具體實施方式】[0050]下面結合【具體實施方式】做詳細說明。
[0051]取不同品牌日本醬油、不同品牌中國醬油采用實施例1的方法分別對其進行游離態、結合態CML的液-質檢測前處理；從上述醬油中選取代表性醬油等體積混合(混合醬油)，分別采用實施例1、實施例2、對比例1、對比例2的方法對混合醬油樣品進行游離態、結合態CML的液-質檢測前處理。
[0052]實施例1
[0053]分別對不同品牌日本醬油、不同品牌中國醬油及混合醬油進行CML檢測的前處理，具體包括如下步驟:
[0054]a、游離態CML的檢測前處理，并具體包括如下步驟:
[0055](I)取0.1mL醬油樣品，用10%甲醇溶液稀釋至10mL，漩渦混勻；
[0056](2)取ImL稀釋液，使用活化后的C18固相萃取柱凈化，加5mL10%甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；
[0057](3)取ImL洗脫液經0.22μπι微濾膜處理，得到所需待測樣品I。
[0058]在混合醬油樣品檢測的同時，進行除雜效果分析，具體包括如下步驟:
[0059]采用紫外可見分光光度計(50Conc，VARIAN, USA)，在294nm及420nm處測定經上述前處理后混合醬油樣品的吸光度值，以用10%甲醇溶液稀釋同等倍數的混合醬油作為對照組，評價上述方法的除雜效果。
[0060]進一步說明，CML溶液為無色透明液體且不具有紫外吸收，而醬油中含有一定量的具有紫外吸收的物質以及棕色物質，這些物質含量的變化可以作為凈化效果的指示。
[0061]在混合醬油樣品檢測的同時，進行添加回收實驗，取樣完畢后，按以下添加水平50 μ g/mLUOO μ g/mL添加CML標準品，以同樣的方法進行處理測定其回收率。
[0062]b、結合態CML的檢測前處理，并具體包括如下步驟:
[0063](I)取3mg肽態氮含量當量的醬油，加入硼酸緩沖液(0.5mol/L, pH9.2)，添加后使體系中硼酸鈉最終摩爾濃度達到0.2mol/L，并加入硼氫化鈉溶液(2mol/L的硼氫化鈉溶液溶于0.lmol/L的氫氧化鈉溶液)，添加后使體系中硼氫化鈉的最終濃度達到0.lmol/L,4°C下還原12h。
[0064](2)將還原后的樣品轉移至下端封閉的透析袋(截留分子量500Da)中，將透析袋上端扎緊，置于燒杯中，加入IOOmL的蒸餾水，于4°C條件下，靜置透析5d，每24h更換一次透析袋外蒸餾水；
[0065](3)取出透析袋內液體轉移至IOmLPE管中，加入12mol/L的HC1，添加后使體系中HCl的最終摩爾濃度達到6mol/L，置于110°C油浴中水解12h ；
[0066](4)采用真空干燥除去多余的HC1，加3mL蒸餾水復溶后采用C18固相萃取柱凈化，并添加5mL10%甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；
[0067](5)將所述洗脫液經0.22 μ m微濾膜處理，干燥后添加100 μ L10%甲醇溶液復溶，制得待測樣品2。
[0068]最后，使用高效液相色譜-單重四級桿質譜聯用儀，采用下述檢測條件對制得的待測樣品1、2進行檢測。
[0069]所述高效液相色譜(Watersl525)檢測條件為:
[0070]色譜柱:WatersAtlantis C18 色譜柱 4.6 X 150mm, 5 μ m[0071]柱溫:30°C
[0072]流動相:甲醇冰=1:9
[0073]流速:0.5mT ,/mi η
[0074]進樣量:10μ L
[0075]所述單重四級桿質譜(Waters Micromass ZQ)的檢測條件為:
[0076]離子源:ESI+
[0077]毛細管電壓:3.0kV
[0078]錐孔電壓:20V
[0079]離子源溫度:100°C
[0080]脫溶溫度:300°C
[0081]掃描模式:單離子記錄
[0082]CML 質荷比:205 (M+)
[0083]采用外標法對CML定量。
[0084]使用上述高效液相色譜-單重四級桿質譜聯用儀，采用上述檢測條件對CML標準品溶液進行檢測，得到CML標準品的色譜圖如圖1所示，并進一步得到CML濃度和質譜信號峰面積關系的標準曲線(圖2)。
[0085]表1:不同品牌日本醬油經本發明所述方法前處理后測得的CML含量
[0086]
【權利要求】
1.一種醬油中羧甲基賴氨酸的檢測方法，其特征在于，首先，進行醬油體系中CML的檢測前處理，包括游離態CML的檢測前處理和結合態CML的檢測前處理；所述游離態CML的檢測前處理方法的具體步驟如下: (O向醬油樣品中加甲醇溶液稀釋，漩渦混勻； (2)取上述稀釋液使用C18固相萃取柱凈化，加入甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；所述每ImL稀釋液對應甲醇溶液的添加量為5-8mL ； (3)將所述洗脫液經微濾膜處理，得到所需待測樣品I; 所述結合態CML的檢測前處理方法的具體步驟如下: (O向醬油樣品中加入硼酸緩沖液及硼氫化鈉溶液進行還原處理，所述醬油取樣量為3-7.5mg肽態氮含量當量； (2)將還原后的樣品于4°C條件下，采用截留分子量為500-1000Da的透析袋，每隔24h更換一次透析袋外液體，靜置透析5-7d ； (3)取透析袋內液體，加12mol/L的HCl使體系中HCl的濃度達到6mol/L，然后在110°C下水解12~16h ； (4)真空干燥除酸，加蒸餾水復溶，使用C18固相萃取柱凈化，加5-8mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液； (5)將所述洗脫液經微濾膜處理，干燥、加100~300μ L甲醇溶液復溶后制得待測樣品2； 然后，將經過前處理的待測樣品I和2分別進行CML檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述游離態CML的檢測前處理方法中步驟(1)，稀釋倍數為100倍。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述游離態CML的檢測前處理方法中步驟(2)，所述C18固相萃取柱使用前經3mL無水甲醇活化處理。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述游離態CML的檢測前處理方法中步驟(3)，所述微濾膜孔徑為0.22 μ m。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述結合態CML的檢測前處理方法中步驟(4)，所述C18固相萃取柱使用前經3mL無水甲醇活化處理。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述結合態CML的檢測前處理方法中步驟(5)，所述微濾膜孔徑為0.22 μ m。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述結合態CML的檢測前處理方法中步驟(I )，所述硼酸緩沖液0.5mol/L, pH9.2添加后使體系中硼酸鈉最終摩爾濃度達到0.2mol/L，所述硼氫化鈉溶液添加后使體系中硼氫化鈉的最終濃度達到0.lmol/L0
8.根據權利要求1~7所述的方法，其特征在于，所有步驟中甲醇溶液的體積濃度均為10%。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述CML檢測采用高效液相色譜-質譜。
10.根據權利要求9所述的方法,其特征在于,所述高效液相色譜采用Watersl525機型，檢測條件為:
色譜柱:Waters Atlantis C18 色譜柱 4.6 X 150mm, 5 μ m
柱溫:30°C流動相:甲醇:7jC =1:9流速:0.5mL/min進樣量:10yL ;質譜為單重四級桿質譜，采用機型為Waters Micromass ZQ,檢測條件為:尚子源:ESI毛細管電壓:3.0kV錐孔電壓:20V離子源溫度:100°C脫溶溫度:300°C掃描模式:單離子記錄CML 質荷比:205 (M+)。
【文檔編號】G01N30/14GK103884801SQ201410060895
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月21日 優先權日:2014年2月21日
【發明者】李琳, 李玉婷, 李冰, 蘇健裕, 徐振波, 卞華偉, 梁志理 申請人:華南理工大學, 中山大學附屬第三醫院