一種用功能蛋白質組技術研究hbo對nscs分化調控的方法
【專利摘要】一種用功能蛋白質組技術研究HBO對NSCS分化調控的方法，包括在體研究和離體研究，制作腦缺血缺氧大鼠模型，運用免疫熒光染色分別雙標神經干細胞分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞，利用激光捕獲顯微切割技術分別獲取分化的神經細胞及未分化的神經干細胞，采用蛋白質順序分級抽提法分別提取各種細胞各組分的總蛋白質，通過Internet網進行搜尋已確定蛋白質的歸屬，運用生物信息學技術和MS-Fit軟件方法，進行蛋白質鑒定和功能分析。
【專利說明】—種用功能蛋白質組技術研究HBO對NSCS分化調控的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種試驗方法，特別是涉及一種用功能蛋白質組技術研究HBO對NSCS分化調控的方法。
【背景技術】
[0002]神經干細胞(NSC)是一類存在于神經系統中具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，它們在一定條件下可分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，并表現有相應的形態和電生理特征。經過10余年的研究，人們發現成年脊椎動物和成人的神經干細胞集中在腦內的三個特定區域:一個是位于腦室區和腦室下區(SVZ)，這兩個區域的室管膜細胞是由神經母細胞組成的混合細胞群，他們可以遷移到嗅球產生前體細胞、星形細胞；另一個在連接側腦室和嗅球的區域；第三個是海馬。神經干細胞的發現使得人們對中樞神經系統的發育、神經的再生等都有了新的認識，為腦血管疾病的治療帶來了新的希望。有研究表明當腦內出現某些病理變化或在某些細胞因子作用下這些NSC被激活，發生增殖、遷徙和分化。腦缺血不但可以促使齒狀回(DG)的神經干細胞增殖，也可以影響腦室下區的神經干細胞，而且未缺血側大腦半球NSC的增殖也有增加，其中缺血側大腦半球NSC增殖最為明顯。研究還發現腦缺血能激活NSC分化，而分化的神經元能部分的替代和修復損傷的神經元。以上研究證實了腦缺血情況下NSC可被激活，發生增殖、遷移和分化，說明了 NSC可參與腦血管疾病的病理生理過程。從而提示我們，探討神經干細胞增殖與分化的分子機制及干預手段(如高壓氧、康復等)對NSC的增殖與分化和神經元再生的促進作用對于腦血管疾病的研究具有十分重要的意義。
[0003]隨著人類基因組計劃(HGP)的勝利完成，使得生命科學進入了后基因組時代，研究熱點轉移到蛋白質組學，有研究發現基因的存在和多樣性與蛋白質的存在和多樣性之間是不均衡的。因此，利用基因組的研究成果進行大規模的蛋白質組研究已經成為必然。1994年澳大利亞學者Wilkins和Williams首先提出“蛋白質組”(PR0TE0ME)的概念，蛋白質組學就是從整體的角度，分析細胞內動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律的一個新的研究領域。可以發現與病理改變有關的蛋白質和疾病特異性蛋白質，這些蛋白質既可以為認識疾病發病機理提供線索，也可以作為疾病診斷的分子標記，還可以作為治療和藥物開發的靶點。
[0004]蛋白質組學是指基因組表達的全部蛋白質的表達模式及功能模式，其內容包括鑒定蛋白質的表達、存在方式(修飾形式)、結構、功能和相互作用等，而鑒于蛋白質組學研究的難度，許多學者提出了功能蛋白質組的研究思路，即研究在特定時間、特定環境和實驗條件下基因組活躍表達的蛋白質，功能蛋白質組是總蛋白質組的一部分，通過對功能蛋白質組的研究，不僅能闡明某一群體蛋白質的功能，也可研究某一生理、病理狀態下蛋白質表達的情況，豐富總蛋白質組數據庫，并最終描繪出接近于“全體蛋白質”的蛋白質組學。在細胞分化等重大生命活動中，蛋白質不僅具有表達時間、表達量的差異，而且具有對外界的環境刺激，包括生理信號、病理信號及外界物理、化學因素等刺激，能動地產生反應的能力，這是生命現象區別于非生命現象的基本特征之一。
[0005]高壓氧(HBO)是指機體處于高氣壓環境中所呼吸與環境等壓的純氧，而利用吸入高壓氧治療疾病的方法稱為高壓氧療法。大量臨床和實驗研究證實HBO可提高腦組織的氧含量及氧儲量，減少腦細胞因缺氧而變性壞死；提高有氧代謝，減少無氧酵解，降低腦內乳酸鹽濃度，從而糾正酸中毒，改善腦內環境；可收縮腦血管，減少腦組織的血流量，從而減輕腦水腫，降低顱內壓；可提高超氧化物歧化酶(SOD)的含量，加強清除自由基和抗氧化能力，減少再灌注對腦組織的損傷；可恢復“缺血半影區”功能，促進神經細胞的恢復與再生。遠期和近期的臨床和實驗均已表明，高壓氧對腦血管疾病的急性癥狀和后遺的運動、感覺、語言、智力和記憶障礙有較好的療效。最近研究發現HBO可動員骨髓中的干細胞，使血液外周循環中的⑶34+細胞增加8倍，干細胞因子增加50%，并且高比率表達VEGF2和SDGF受體；可上調神經營養因子_3、堿性成纖維生長因子的表達，而這些因子的濃度改變能影響細胞周圍微環境而激活NSC增殖和分化；可增加腦缺血缺氧大鼠神經干細胞Nestin蛋白的表達，使Brdu免疫染色陽性細胞大量增加；我們預實驗也展示了高壓氧可以上調腦源性神經干細胞向神經元分化。因此，我們認為HBO在對NSCs干預過程中的作用必然引起了從遺傳信息到整體功能實現中的分子、細胞器、整體多層面的結構與功能狀態的改變，而決定這些層面的結構與功能的基礎是基因，而直接的決定因素主要是蛋白質。因此以蛋白質表達為指標，以蛋白質調控改變和功能修飾為研究方向，進行高壓氧多環節、多靶點調整作用的研究，可望對高壓氧治療腦血管疾病的作用機理研究取得突破性進展。
[0006]目前我國腦血管疾病的患病率逐年增加，高壓氧治療對急性神經元保護和腦血管疾病后遺癥的改善取得了重要的進展，但對神經干細胞分化調控的分子機制了解確很少。本項目采用功能蛋白質組學技術和生物信息學技術等方法，從離體和在體實驗兩個方面研究高壓氧對神經干細胞分化調控的分子機制，建立功能蛋白質組學和生物信息學等技術平臺，利用此平臺將高壓氧的多靶點、多途徑作用特點與蛋白質表達關聯起來，比較各自不同的表達差異譜，對應蛋白表達靶點，闡明高壓氧治療的作用機制。為高壓氧治療腦血管疾病開辟新的研究和應用領域，同時為其臨床應用奠定堅實的理論基礎。
【發明內容】
[0007]腦缺血缺氧動物模型制作:除正常對照組、假手術組外，其余各組均造模，腦缺血缺氧模型采用經典Rice模型；高壓氧處理:大鼠模型制作后3h、6h、12h、24h內放入高壓氧艙，壓力為0.2MPa，艙內氧濃度為80%，每次lh，l次/d，連續7d ;免疫熒光染色雙標:取各組大鼠腦組織，用多聚甲醛固定，將腦冠固定后的腦組織進行常規脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，切片，分別加入一抗fcdu、Nestin, GFAP, Tuj1、Galc，4°C過夜，再用PBS漂洗，在加入Cy3/FITC標記的二抗，37°C溫育2h，用免疫熒光顯微鏡觀察神經干細胞的分化情況；采用激光捕獲顯微切割技術分別游離各組熒光標記的各種細胞，采用蛋白質順序分級抽提法分別提取細胞各組分的總蛋白質，運用功能蛋白質組技術和生物信息學技術研究高壓氧對神經干細胞分化相關蛋白的表達影響；
[0008]離體研究包括以下步驟:
[0009]神經干細胞培養:無菌條件下分離新生鼠腦組織，機械分成Imm3大小組織，加入培養液吹打成單細胞懸液，取少量細胞懸液接種于培養瓶，添加有bFGF和B27的DMEM/F12的培養液，置于5%C02培養箱中，神經球形成后再次機械分離克隆制成單細胞懸液，將部分細胞懸液接種到新的培養瓶中培養，7d后機械分離克隆傳代I次，方法同前，將培養的第3代神經干細胞制成單細胞懸液，分裝在不同的25ml培養瓶中，分為正常對照組、模型對照組、高濃度氧組、高壓空氣組、高壓氧組，I瓶/組；制造干細胞缺血缺氧模型:除正常對照組夕卜，其余各組均造模，當培養的神經干細胞達80%的融合時換為新鮮的完全培養基，次日將培養基棄去代之以新鮮的無血清DMEM/F12培養基，并將細胞置于93%N2，5%C02, 2%02的培養箱37°C培養；神經干細胞在此環境中作用3h、6h、12h、24h，再Brdu共孵育48h后被用于相關實驗；神經干細胞活力的測定從每組取Iml細胞懸液移入96孔酶標板，細胞密度為每孔103?104個細胞，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37°C孵育4h，終止培養，吸去培養上清液，每孔加入150ulDMS0，震蕩IOmin使結晶物充分溶解，選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度值，高壓氧下誘導神經干細胞分化:將上述高壓氧組缺血缺氧細胞懸液接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養板中，將一部分細胞于貼壁2h后進行Nestin免疫熒光染色；另一部分加入去除生長因子的血清DMEM/F12培養基繼續培養7d，并同時將之置于高壓氧環境下，壓力為0.2MPa，每次lh，I次/d，連續7d。其余各組即是將各組同時至于各組環境下；神經細胞特異免疫熒光染色:將上述各組細胞PBS充分漂洗，用多聚甲醛溶液固定。分別加入一抗Brdu、Nestin, GFAP, Tuj1、Galc，4°C過夜，用PBS漂洗，再加入Cy3/FITC標記的二抗，37°C溫育2h，用免疫熒光顯微鏡觀察神經干細胞的分化情況；應用流式細胞儀分別獲取各組熒光標記的各種細胞，采用蛋白質順序分級抽提法分別提取細胞各組分的總蛋白質，運用功能蛋白質組技術和生物信息學技術研究高壓氧對神經干細胞分化相關的蛋白表達影響。
【具體實施方式】
[0010]下面對本發明作進一步的詳細說明。
[0011]實施例1
[0012]腦缺血缺氧動物模型制作:除正常對照組、假手術組外，其余各組均造模，腦缺血缺氧模型采用經典Rice模型；高壓氧處理:大鼠模型制作后3h、6h、12h、24h內放入高壓氧艙，壓力為0.2MPa，艙內氧濃度為80%，每次lh，l次/d，連續7d ;免疫熒光染色雙標:取各組大鼠腦組織，用多聚甲醛固定，將腦冠固定后的腦組織進行常規脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，切片，分別加入一抗fcdu、Nestin, GFAP, Tuj1、Galc，4°C過夜，再用PBS漂洗，在加入Cy3/FITC標記的二抗，37°C溫育2h，用免疫熒光顯微鏡觀察神經干細胞的分化情況；采用激光捕獲顯微切割技術分別游離各組熒光標記的各種細胞，采用蛋白質順序分級抽提法分別提取細胞各組分的總蛋白質，運用功能蛋白質組技術和生物信息學技術研究高壓氧對神經干細胞分化相關蛋白的表達影響。
[0013]離體研究包括以下步驟:
[0014]神經干細胞培養:無菌條件下分離新生鼠腦組織，機械分成Imm3大小組織，加入培養液吹打成單細胞懸液，取少量細胞懸液接種于培養瓶，添加有bFGF和B27的DMEM/F12的培養液，置于5%C02培養箱中，神經球形成后再次機械分離克隆制成單細胞懸液，將部分細胞懸液接種到新的培養瓶中培養，7d后機械分離克隆傳代I次，方法同前，將培養的第3代神經干細胞制成單細胞懸液，分裝在不同的25ml培養瓶中，分為正常對照組、模型對照組、高濃度氧組、高壓空氣組、高壓氧組，I瓶/組；制造干細胞缺血缺氧模型:除正常對照組夕卜，其余各組均造模，當培養的神經干細胞達80%的融合時換為新鮮的完全培養基，次日將培養基棄去代之以新鮮的無血清DMEM/F12培養基，并將細胞置于93%N2，5%C02, 2%02的培養箱37°C培養；神經干細胞在此環境中作用3h、6h、12h、24h，再Brdu共孵育48h后被用于相關實驗；神經干細胞活力的測定從每組取Iml細胞懸液移入96孔酶標板，細胞密度為每孔103?104個細胞，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37°C孵育4h，終止培養，吸去培養上清液，每孔加入150ulDMS0，震蕩IOmin使結晶物充分溶解，選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度值，高壓氧下誘導神經干細胞分化:將上述高壓氧組缺血缺氧細胞懸液接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養板中，將一部分細胞于貼壁2h后進行Nestin免疫熒光染色；另一部分加入去除生長因子的血清DMEM/F12培養基繼續培養7d，并同時將之置于高壓氧環境下，壓力為0.2MPa，每次lh，I次/d，連續7d。其余各組即是將各組同時至于各組環境下；神經細胞特異免疫熒光染色:將上述各組細胞PBS充分漂洗，用多聚甲醛溶液固定。分別加入一抗fcdu、Nestin、GFAP、Tuj1、Galc，4°C過夜，用PBS漂洗，再加入Cy3/FITC標記的二抗，37°C溫育2h，用免疫熒光顯微鏡觀察神經干細胞的分化情況；應用流式細胞儀分別獲取各組熒光標記的各種細胞，采用蛋白質順序分級抽提法分別提取細胞各組分的總蛋白質，運用功能蛋白質組技術和生物信息學技術研究高壓氧對神經干細胞分化相關的蛋白表達影響。
[0015]總蛋白質的提取與定量:在體及離體的各種細胞各組分的總蛋白質提取參照《腫瘤蛋白質組學》操作，蛋白質定量按Ausubel所述的BradFord方法操作。
[0016]雙向凝膠電泳技術(2-DE技術):將總蛋白質與重泡漲液混合，加入IPG持膠槽中，放在IPGphor電泳儀上水化，等電聚焦；將膠條移至SDS凝膠上端，恒電流電泳，樣品中加入2D標準蛋白質作為內標。
[0017]凝膠染色與圖像采集分析:按Hochstrasser等的銀氨溶液染色法。染色后的凝膠用分子成像儀透射掃描，得到的數字化圖像文件用TOQuest(Bi0-Rad)進行軟件分析，利用內標2D-Marher的標準分子量和等電點來確定膠內蛋白質點的分子量和等電點。
[0018]蛋白質原位酶解:參照Bergman等的方法進行,取點器將感興趣的蛋白質點切割下放于EP管中；加入脫色工作液，反復乙腈脫水，加入TPCK-胰蛋白酶IOuL置于冰浴中，酶解后上清液轉移至EP管中,萃取液凍干后進行質譜分析。
[0019]MADL1-T0F肽質指紋圖分析:按《腫瘤蛋白質組學》操作，選用基質，樣品溶解；用美國Millipore公司的ZipTipTMC18器嘴脫鹽；制備好的樣品可使用美國Bruker公司的ProFlexTM III MADL1-T0F質譜儀進行分析，同時進行內部數據校正。
[0020]HPLC-Edman降解法測定多肽的氨基酸序列:按《腫瘤蛋白質組學》操作。酶解混合物溶液，離心后去上清液用ABI173AMiroBlotter毛細管HPLC系統分離，樣品峰使用ABI173AMiroBlotter收集到PVDF膜上，刀片切下與出峰位置對應的PVDF膜，用ABI475氣相蛋白質序列儀對PVDF膜上的樣品進行序列測定。
[0021]生物信息學鑒定蛋白質圖譜中差異蛋白質點的功能:按《腫瘤蛋白質組學》操作。通過Internet網進行搜尋以確定蛋白質的歸屬,運用生物信息學技術和MS-Fit軟件方法，進行蛋白質鑒定和功能分析。
[0022]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發明的內容并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，效果相似，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種用功能蛋白質組技術研究HBO對NSCS分化調控的方法，包括在體研究和離體研究，所述在體研究包括以下步驟:. 1)腦缺血缺氧動物模型制作:除正常對照組、假手術組外，其余各組均造模，腦缺血缺氧模型采用經典Rice模型； . 2)高壓氧處理:大鼠模型制作后3h、6h、12h、24h內放入高壓氧艙，壓力為0.2MPa，艙內氧濃度為80%，每次lh，I次/d，連續7d ；. 3)免疫熒光染色雙標:取各組大鼠腦組織，用多聚甲醛固定，將腦冠固定后的腦組織進行常規脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，切片，分別加入一抗fcdu、Nest in、GFAP、Tuj1、Galc，.4°C過夜，再用PBS漂洗，在加入Cy3/FITC標記的二抗，37°C溫育2h，用免疫熒光顯微鏡觀察神經干細胞的分化情況； . 4)采用激光捕獲顯微切割技術分別游離各組熒光標記的各種細胞，采用蛋白質順序分級抽提法分別提取細胞各組分的總蛋白質，運用功能蛋白質組技術和生物信息學技術研究高壓氧對神經干細胞分化相關蛋白的表達影響； 所述離體研究包括以下步驟:. 1)神經干細胞培養:無菌條件下分離新生鼠腦組織，機械分成Imm3大小組織，加入培養液吹打成單細胞懸液，取少量細胞懸液接種于培養瓶，添加有bFGF和B27的DMEM/F12的培養液，置于5%C02培養箱中，神經球形成后再次機械分離克隆制成單細胞懸液，將部分細胞懸液接種到新的培養瓶中培養，7d后機械分離克隆傳代I次，方法同前，將培養的第3代神經干細胞制成單細胞懸液，分裝在不同的25ml培養瓶中，分為正常對照組、模型對照組、高濃度氧組、高壓空氣組、高壓氧組，I瓶/組； . 2)制造干細胞缺血缺氧模型:除正常對照組外，其余各組均造模，當培養的神經干細胞達80%的融合時換為新鮮的完全培養基，次日將培養基棄去代之以新鮮的無血清DMEM/F12培養基，并將細胞置于93%N2，5%C02，2%02的培養箱37°C培養；神經干細胞在此環境中作用.3h、6h、12h、24h,再Brdu共孵育48h后被用于相關實驗； .3)神經干細胞活力的測定從每組取Iml細胞懸液移入96孔酶標板，細胞密度為每孔.103~104個細胞，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37°C孵育4h，終止培養，吸去培養上清液，每孔加入150ulDMS0，震蕩IOmin使結晶物充分溶解，選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度值， . 4)高壓氧下誘導神經干細胞分化:將上述高壓氧組缺血缺氧細胞懸液接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養板中，將一部分細胞于貼壁2h后進行Nestin免疫熒光染色；另一部分加入去除生長因子的血清DMEM/F12培養基繼續培養7d，并同時將之置于高壓氧環境下，壓力為0.2MPa，每次lh，I次/d，連續7d。其余各組即是將各組同時至于各組環境下；. 5)神經細胞特異免疫熒光染色:將上述各組細胞PBS充分漂洗，用多聚甲醛溶液固定。分別加入一抗&*(111、他8衍11、6?4?、1\^丨、6&1(3，41:過夜，用PBS漂洗，再加入Cy3/FITC標記的二抗，37°C溫育2h，用免疫熒光顯微鏡觀察神經干細胞的分化情況； . 6)應用流式細胞儀分別獲取各組熒光標記的各種細胞，采用蛋白質順序分級抽提法分別提取細胞各組分的總蛋白質，運用功能蛋白質組技術和生物信息學技術研究高壓氧對神經干細胞分化相關的蛋白表達影響。
【文檔編號】G01N33/68GK104020292SQ201410059175
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年2月21日 優先權日:2014年2月21日
【發明者】彭爭榮 申請人:中南大學湘雅醫院