金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒及其制備方法，包括檢測試劑R1和陰性對照試劑R2，陰性對照試劑R2為聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，其特征是檢測試劑R1采用免疫聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，免疫聚苯乙烯微球采用羥基功能化聚苯乙烯微球與至少兩種特異蛋白偶聯而成。羥基功能化聚苯乙烯微球制備方法，采用烷基化殼聚糖與聚苯乙烯微球進行反應，利用羥基功能化聚苯乙烯微球表面分布的高密度羥基，提高羥基功能化聚苯乙烯微球與特異蛋白的偶聯效率，使得免疫聚苯乙烯微球表面偶聯上的特異蛋白或抗體物質大大提高，具有檢測靈敏度高、準確度高，漏檢率少等優點。
【專利說明】金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術及微生物檢測領域，涉及一種基于免疫聚苯乙烯微球凝集反應的金黃色葡萄球菌快速鑒定試劑盒。本發明適用于臨床微生物或食品微生物樣本中的金黃色葡萄球菌快速檢測。
技術背景
[0002]葡萄球菌是在人類皮膚及粘膜上棲生的常見菌株。其中金黃色葡萄球菌可引起包括表皮化膿在內的大范圍化膿性感染，食物中毒和中毒性休克，及其它各種疾病。因此金黃色葡萄球菌為實驗室經常遇到的最常見的致病菌之一，由于金黃色葡萄球菌感染發生頻率高并且嚴重，而且金黃色葡萄球菌對眾多常規抗生素有耐藥性，因此迫切需要快速而準確的診斷，以便對病人采取有效的治療措施。另外在食品制造中發現葡萄球菌是較好的微生物總體污染水平的指示菌，因此對感染嚴重的樣品需要一種高度特異性的金黃色葡萄球菌快速鑒定方法。
[0003]乳膠凝集法是近年來出現的一種較為常用的快速檢測方法。該方法利用金黃色葡萄球菌表面特有的血漿凝固酶，能與血漿纖維蛋白物質發生特異凝集反應的原理，將血漿纖維蛋白物質與乳膠顆粒共價偶聯制備成致敏的乳膠顆粒，該交聯后的致敏微球能夠與上述金黃色葡萄球菌表面的血漿凝固酶發生反應，產生微球凝集現象，從而達到快速鑒定金黃色葡萄球菌的目的。該方法具有較高的特異性，檢測時間短，檢測效率高。但是，對呈現血漿凝固酶陰性的少數金黃色葡萄球菌菌株會有漏檢現象，造成假陰性的結果，檢測準確度較差。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題在于提供一種檢測速度快、檢測靈敏度高、檢測準確度好的金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒及其制備方法。
[0005]本發明金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒的技術方案包括檢測試劑Rl和陰性對照試劑R2，陰性對照試劑R2為聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，其特征是檢測試劑Rl采用免疫聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，免疫聚苯乙烯微球采用羥基功能化聚苯乙烯微球與至少兩種特異蛋白偶聯而成。
[0006]本發明的制備方法為:
[0007]1、檢測試劑Rl的制備方法:在每IOOml微球緩沖液中，加入0.5g免疫聚苯乙烯微球；
[0008]2、陰性對照試劑R2的制備方法:在每IOOml微球緩沖液中，加入0.5g聚苯乙烯微球；
[0009]其中微球緩沖液的制備方法為:
[0010]①.配制濃度為0.1?1M，PH值為6.0?9.0的磷酸鹽緩沖液、tri s緩沖液、碳
酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液；[0011]②.取上述一種緩沖液，加入曲拉通系列和吐溫系列中的一種或多種化合物，使配制后的化合物濃度為0.5?2% ；
[0012]③.向步驟②中配制好的緩沖液中加入PEG2000、酪蛋白、明膠、脫脂牛奶中的一種或多種化合物，使配制后的化合物濃度為I?5% ;
[0013]④.將步驟③配制好的微球緩沖液攪拌均勻，置于2?8°C的溫度環境保存；
[0014]其特征是:
[0015]免疫聚苯乙烯微球的制備方法為:
[0016]①.將羥基功能化聚苯乙烯微球分散于水溶液中，使其濃度為2?5% ;
[0017]②.取上述的溶液10ml，加入I?2ml新配的濃度為0.1?0.5M / L的Na104溶液，混勻，4°C溫度環境靜置20分鐘；
[0018]③.在步驟②溶液中加入I?2ml，0.16M的乙二醇水溶液，混勻，室溫避光靜置30?60分鐘；
[0019]④.在步驟③取得的溶液中，加入特異蛋白溶液，混勻，裝入透析袋，用0.05M /LPH7.0碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌，在4°C溫度環境中透析16?20小時，中途更換二次透析液，混合后特異蛋白濃度為I?IOmg / ml ；
[0020]⑤.在步驟④取得的溶液中，加入新鮮配制的濃度為5mg / ml的NaBH4溶液2?5ml，混勻，在4°C溫度環境中反應2小時后，裝入透析袋，用0.1M / LPH7.0磷酸鹽緩沖液緩緩攪拌，4°C溫度環境中透析16?20小時，中途更換二次透析液；
[0021]⑥.取出透析好的反應液，用0.1M / LPH7.0PBS加至20ml，置于2?8°C的溫度
環境保存。
[0022]最好是，羥基功能化聚苯乙烯微球的制備方法為:
[0023]①.烷基化殼聚糖:將殼聚糖、Κ0Η、異丙醇混合置于三頸燒瓶中，勻速攪拌，升溫至40°C保持I小時，使殼聚糖堿化后升溫至60°C，并滴加鹵代烴，恒溫攪拌反應2?12小時；其中每ml異丙醇加0.05?0.1g殼聚糖和0.1?0.2g KOH ;每ml反應液含0.10?0.30ml鹵代烴；
[0024]②.將經過步驟①的反應物用丙酮和蒸餾水交替洗滌，直至洗出的蒸餾水中不再有鹵離子，烘干后得到烷基化殼聚糖；
[0025]③.將步驟②取得的烷基化殼聚糖，溶于濃度為I?5%醋酸溶液中，靜置16?20小時，使其充分溶解分散，溶解后烷基化殼聚糖的濃度為I?5% ;
[0026]④.取經過步驟③的烷基化殼聚糖溶液，滴加到聚苯乙烯微球溶液中，室溫下勻速攪拌I?10小時，呈均勻分散的膠狀溶液后，離心分離得到羥基功能化聚苯乙烯微球；在羥基功能化聚苯乙烯微球溶液中，烷基化殼聚糖的濃度為0.01?0.5%，聚苯乙烯微球的濃度為0.1?1%。
[0027]本發明的優點之一在于:提供一種新的基于免疫聚苯乙烯微球凝集反應的金黃色葡萄球菌快速鑒定方法，該方法采用多重檢測機制，同時識別金黃色葡萄球菌表面的血漿凝固酶、SPA、多糖抗原、莢膜抗原等，提高了檢測試劑的特異性和準確度，減少漏檢率；
[0028]本發明的優點之二在于:提供一種羥基功能化聚苯乙烯微球制備方法，采用烷基化殼聚糖與聚苯乙烯微球進行反應，制備成一種表面分布有高密度羥基基團的功能化聚苯乙烯微球，采用羥基功能化聚苯乙烯微球與抗體物質偶聯制備成免疫聚苯乙烯微球，利用羥基功能化聚苯乙烯微球表面分布的高密度羥基，提高羥基功能化聚苯乙烯微球與特異蛋白的偶聯效率，使得免疫聚苯乙烯微球表面偶聯上的特異蛋白或抗體物質大大提高，提高試劑的檢測靈敏度。
【具體實施方式】
[0029]本發明的金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒，包括檢測試劑Rl和陰性對照試劑R2，陰性對照試劑R2為聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，檢測試劑Rl為免疫聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，免疫聚苯乙烯微球采用羥基功能化聚苯乙烯微球與至少兩種特異蛋白偶聯而成。所述特異蛋白可以為人或動物的血漿、人或動物的IgG免疫球蛋白、抗SPA單克隆抗體或多克隆抗體、抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖抗原單克隆抗體或多克隆抗體、抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體或多克隆抗體。
[0030]本發明金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒的配制方法:
[0031]1、檢測試劑Rl的制備方法:在每IOOml微球緩沖液中，加入0.5g免疫聚苯乙烯微球；
[0032]2、陰性對照試劑R2的制備方法:在每IOOml微球緩沖液中，加入0.5g聚苯乙烯微球；
[0033]其中微球緩沖液的制備方法為:
[0034]①.配制濃度為0.1?1M，PH值為6.0?9.0的磷酸鹽緩沖液、tr i s緩沖液、
碳酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液；
[0035]②.取上述一種緩沖液，加入曲拉通系列和吐溫系列中的一種或多種化合物，使配制后的化合物濃度為0.5?2% ；
[0036]③.向步驟②中配制好的緩沖液中加入PEG2000、酪蛋白、明膠、脫脂牛奶中的一種或多種化合物，使配制后的化合物濃度為I?5% ;
[0037]④.將步驟②和步驟③配制好的微球緩沖液攪拌均勻，置于2?8°C的溫度環境保存；
[0038]免疫聚苯乙烯微球的制備方法為:
[0039]①.將羥基功能化聚苯乙烯微球分散于水溶液中，使其濃度為2?5% ;
[0040]②.取上述的溶液10ml，加入I?2ml新配的濃度為0.1?0.5M / L的Na104溶液，混勻，4°C溫度環境靜置20分鐘；
[0041]③.在步驟②溶液中加入I?2ml，0.16M的乙二醇水溶液，混勻，室溫避光靜置30?60分鐘；
[0042]④.在步驟③取得的溶液中，加入特異蛋白溶液，混勻，裝入透析袋，用0.05M /LPH7.0碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌，在4°C溫度環境中透析16?20小時，中途更換二次透析液，混合后特異蛋白濃度為I?IOmg / ml ；
[0043]⑤.在步驟④取得的溶液中，加入新鮮配制的濃度為5mg / ml的NaBH4溶液2?5ml，混勻，在4°C溫度環境中反應2小時后，裝入透析袋，用0.1M / LPH7.0磷酸鹽緩沖液緩緩攪拌，4°C溫度環境中透析16?20小時，中途更換二次透析液；
[0044]⑥.取出透析好的反應液，用0.1M / LPH7.0PBS加至20ml，置于2?8°C的溫度
環境保存。[0045]羥基功能化聚苯乙烯微球的制備方法為:
[0046]①.烷基化殼聚糖:將殼聚糖、Κ0Η、異丙醇混合置于三頸燒瓶中，勻速攪拌，升溫至40°C保持I小時，使殼聚糖堿化后升溫至60°C，并滴加鹵代烴，恒溫攪拌反應2?12小時；其中每ml異丙醇加0.05?0.1g殼聚糖和0.1?0.2g KOH ;每ml反應液含0.10?
0.30ml鹵代烴；
[0047]②.將經過步驟①的反應物用丙酮和蒸餾水交替洗滌，直至洗出的蒸餾水中不再有鹵離子，烘干后得到烷基化殼聚糖；
[0048]③.將步驟②取得的烷基化殼聚糖，溶于濃度為I?5%醋酸溶液中，靜置16?20小時，使其充分溶解分散，溶解后烷基化殼聚糖的濃度為I?5% ;
[0049]④.取經過步驟③的烷基化殼聚糖溶液，滴加到聚苯乙烯微球溶液中，室溫下勻速攪拌I?10小時，呈均勻分散的膠狀溶液后，離心分離得到羥基功能化聚苯乙烯微球；在羥基功能化聚苯乙烯微球溶液中，烷基化殼聚糖的濃度為0.01?0.5%，聚苯乙烯微球的濃度為0.1?1%。
[0050]輕基功能化聚苯乙烯微球制備的優選方案為:
[0051]①.殼聚糖的烷基化:將5g殼聚糖、IOg KOH與IOOml異丙醇混合置于三頸燒瓶中，勻速攪拌，升溫至40°C保持I小時，使殼聚糖堿化后升溫至60°C，并滴加20ml鹵代烴，恒溫攪拌反應8小時；鹵代烴采用氯代十二烷，制備成的烷基化殼聚糖為十二烷基殼聚糖；
[0052]②.將經過步驟①的反應物用丙酮和蒸餾水交替洗滌，直至洗出的蒸餾水中不再有鹵離子，烘干后得到烷基化殼聚糖；
[0053]③.將烷基化殼聚糖，溶于濃度為2%的醋酸溶液中，靜置12小時，使其充分溶解分散，溶解后烷基化殼聚糖的濃度為1% ；
[0054]④.取經過步驟③的烷基化殼聚糖溶液，滴加到聚苯乙烯微球溶液中，使烷基化殼聚糖的濃度為0.01%，聚苯乙烯微球的濃度為0.5%，室溫下勻速攪拌5小時，呈均勻分散的膠狀溶液后，離心分離得到羥基功能化的聚苯乙烯微球。
[0055]微球緩沖液制備的優選方案為:
[0056]①.配制濃度為1M，PH值為6.0的磷酸鹽緩沖液；
[0057]②.在上述磷酸鹽緩沖液中加入I %的曲拉通和0.5%的吐溫10，攪拌均勻；
[0058]③.向步驟②中配制好的緩沖液中加入1%的PEG2000、2%的酪蛋白，攪拌均勻；
[0059]④.將步驟②和步驟③配制好的混合緩沖液攪拌均勻，并將制成微球緩沖液置于4°C的溫度環境保存。
[0060]免疫聚苯乙烯微球制備的優選方案為:
[0061]①.將羥基功能化聚苯乙烯微球分散于水溶液中，使其終濃度為3% ；
[0062]②.取上述的溶液10ml，加入2ml新配的濃度為0.5M / L的Na104溶液，混勻，4°C溫度環境靜置20分鐘；
[0063]③.在步驟②溶液中加入加入2ml、0.16M的乙二醇水溶液，混勻，室溫避光靜置30分鐘；
[0064]④.在步驟③取得的溶液中，加入人血漿、抗SPA單克隆抗體、抗金黃色葡萄球菌莢膜多糖單克隆抗體特異蛋白溶液，使各種特異蛋白的濃度為2mg / ml，混勻后裝入透析袋，用0.05M / LPH7.0碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌，4°C溫度環境中透析12小時，中途更換二次透析液；
[0065]⑤.在步驟④取得的溶液中，加入新鮮配制的濃度為5mg / ml的NaBH4溶液2ml，混勻，在4°C溫度環境中反應2小時后，裝入透析袋，用0.1M / LPH7.0磷酸鹽緩沖液緩緩攪拌，4°C溫度環境中透析12小時，中途更換二次透析液；
[0066]⑥.取出透析好的反應液，用0.1M / LPH7.0PBS加至20ml，置4°C的溫度環境保存。
【權利要求】
1.一種金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒，包括檢測試劑Rl和陰性對照試劑R2，陰性對照試劑R2為聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，其特征是檢測試劑Rl采用免疫聚苯乙烯微球與微球緩沖液的混合物，免疫聚苯乙烯微球采用羥基功能化聚苯乙烯微球與至少兩種特異蛋白偶聯而成。
2.根據權利要求1所述的金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒的制備方法: 1)、檢測試劑Rl的制備方法:在每100ml微球緩沖液中，加入0.5g免疫聚苯乙烯微球； 2)、陰性對照試劑R2的制備方法:在每100ml微球緩沖液中，加入0.5g聚苯乙烯微球； 其中微球緩沖液的制備方法為: ①.配制濃度為0.1~1M，PH值為6.0~9.0的磷酸鹽緩沖液、tri s緩沖液、碳酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液； ②.取上述一種緩沖液，加入曲拉通系列和吐溫系列中的一種或多種化合物，使配制后的化合物濃度為0.5~2% ; ③.向步驟②中配制好的緩沖液中加入PEG2000、酪蛋白、明膠、脫脂牛奶中的一種或多種化合物，使配制后的化合物濃度為I~5% ; ④.將步驟③配制好的微球緩沖液攪拌均勻，置于2~8°C的溫度環境保存； 其特征是: 免疫聚苯乙烯微球的制備方法為: ①.將羥基功能化聚苯乙 烯微球分散于水溶液中，使其濃度為2~5%; ②.取上述的溶液10ml，加入I~2ml新配的濃度為0.1~0.5M / L的Na104溶液，混勻，4 °C溫度環境靜置20分鐘； ③.在步驟②溶液中加入I~2ml，0.16M的乙二醇水溶液，混勻，室溫避光靜置30~60分鐘； ④.在步驟③取得的溶液中，加入特異蛋白溶液，混勻，裝入透析袋，用0.05M / LPH7.0碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌，在4°C溫度環境中透析16~20小時，中途更換二次透析液，混合后特異蛋白濃度為I~IOmg / ml ； ⑤.在步驟④取得的溶液中，加入新鮮配制的濃度為5mg/ ml的NaBH4溶液2~5ml，混勻，在4°C溫度環境中反應2小時后，裝入透析袋，用0.1M / LPH7.0磷酸鹽緩沖液緩緩攪拌，4°C溫度環境中透析16~20小時，中途更換二次透析液； ⑥.取出透析好的反應液，用0.1M / LPH7.0 PBS加至20ml，置于2~8°C的溫度環境保存。
3.根據權利要求2所述的金黃色葡萄球菌鑒定試劑盒的制備方法，其特征是羥基功能化聚苯乙烯微球的制備方法為: ①.烷基化殼聚糖:將殼聚糖、KOH、異丙醇混合置于三頸燒瓶中，勻速攪拌，升溫至40°C保持I小時，使殼聚糖堿化后升溫至60°C，并滴加鹵代烴，恒溫攪拌反應2~12小時；其中每ml異丙醇加0.05~0.1g殼聚糖和0.1~0.2g KOH ;每1111反應液含0.10~0.30ml鹵代烴； ②.將經過步驟①的反應物用丙酮和蒸餾水交替洗滌，直至洗出的蒸餾水中不再有鹵離子，烘干后得到烷基化殼聚糖； ③.將步驟②取得的烷基化殼聚糖，溶于濃度為I~5%醋酸溶液中，靜置16~20小時，使其充分溶解分散，溶解后烷基化殼聚糖的濃度為I~5% ; ④.取經過步驟③的烷基化殼聚糖溶液，滴加到聚苯乙烯微球溶液中，室溫下勻速攪拌I~10小時，呈均勻分散的膠狀溶液后，離心分離得到羥基功能化聚苯乙烯微球；在羥基功能化聚苯乙烯微球溶液中，烷基化殼聚糖的濃度為0.01~0.5%，聚苯乙烯微球的濃度為0.1~1%。·
【文檔編號】G01N33/531GK103852580SQ201410057836
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月18日 優先權日:2014年2月18日
【發明者】李超, 吳玲智, 諸葛銳軍, 林磊, 許天鴻 申請人:溫州市康泰生物科技有限公司