以flrg作為標志物制備檢測工具的應用及檢測工具的制作方法
【專利摘要】本發明公開將可以作為孕婦患有的子癇前期也即先兆子癇疾病的檢測標志物應用于制備相應疾病的檢測工具以及通過該應用方式獲得的相應檢測工具等；具體涉及將FLRG作為用于妊娠的子癇前期的生物標志物的應用及檢測工具。采用將FLRG作為用于妊娠的子癇前期疾病的生物標志物的應用。本發明提供一種生物標志物的新的應用方式，該生物標志物在預測、預后、診斷妊娠的子癇前期疾病可以更加便利化，從而避免血液采集的繁瑣步驟。
【專利說明】以FLRG作為標志物制備檢測工具的應用及檢測工具
【技術領域】
[0001]本發明涉及將可以作為孕婦患有的子癇前期也即先兆子癇疾病的檢測標志物應用于制備相應疾病的檢測工具以及通過該應用方式獲得的相應檢測工具等；具體涉及以FLRG作為檢測、診斷子癇前期疾病的標志物制備相應檢測工具的應用及檢測工具。
【背景技術】
[0002]高血壓是妊娠期間遇到的最常見的醫療問題，使2-3%的妊娠復雜化。妊娠期間的高血壓疾病被分為4類:1、慢性高血壓；2、先兆子癇；3、先兆子癇加慢性高血壓以及4、妊娠期或妊娠性高血壓。慢性高血壓被定義為在妊娠前或懷胎20周之前，血壓超過140/90mmHg。在婦女妊娠期間首次鑒定到高血壓而且懷胎不足20周的時候，血壓升高通常表示慢性高血壓。相反，在懷胎20周后新發的血壓讀數升高則要求考慮并排除先兆子癇，也即子癇前期。子癇前期以高達所有妊娠的5%、首次妊娠的10%以及有慢性高血壓史的婦女的20-25%的比率發生。妊娠時的高血壓疾病可能造成母體和胎兒的發病率,并且它們仍然是母體死亡率的主要來源。
[0003]妊娠期高血壓所指的是高血壓出現在妊娠后半部分(懷胎>20周)，沒有任何其他子癇前期的特征，并且隨后是產后血壓正常化。在起初表現出明顯的妊娠期高血壓的婦女中，約三分之一發展出子癇前期綜合癥。正因為如此，應該密切觀察這些患者這方面的進展。妊娠期高血壓的病理生理學是未知的，但在沒有子癇前期的特征的情況下，母體和胎兒的結果一般是正常的。但是妊娠期高血壓可能是以后生命中高血壓的先兆。
[0004]子癇前期是妊娠中的多系統疾病，主要在于先前血壓正常的婦女在懷胎20周后發展出的新發高血壓(收縮壓和舒張壓分別> 140和90mmHg)以及蛋白尿(在24小時的尿液收集中蛋白排泄> 300mg，或者浸量尺> 2+)。子癇前期還可分為輕度子癇前期和重度子癇前期(收縮壓> 160mmHg或舒張壓> IlOmmHg,蛋白尿>5g/24小時),并且在最嚴重的情況下可以發展成為子癇。
[0005]盡管目前仍未清楚的了解先兆子癇確切的病理生理機制，但其主要是一種胎盤功能障礙疾病，導致伴隨有血管痙攣的內皮功能障礙綜合征。
[0006]雖然缺乏針對子癇前期的預防和治療方法，但是尋求可以預測該危及生命的妊娠疾病的發展或者有助于該疾病的檢測的非侵入性生物標志物仍然是最重要的。
[0007]現有技術中已有多種可用于預測子癇前期該種疾病的生物標志物，例如在專利申請號為CN201180019135.7、CN201180030104.1的專利文件中公開了多種可用于診斷、預測、預后和/或監測該種疾病的生物標志物，同時還公開了將各種生物標志物制備成的可檢測子癇前期疾病的檢測工具，例如試劑盒。
[0008]但是現有已經公開的子癇前期檢測工具的檢測對象大多為血液樣品，多數生物或化學標志物均存在于妊娠婦女的血液中。通過檢測血液樣品中的生物或化學標志物的方式往往比較費時費力。
【發明內容】
[0009]有鑒于此，本發明提供一種應用方式，具體為以FLRG作為檢測、診斷子癇前期疾病的標志物制備相應檢測工具的應用；該應用方式提供一種生物標志物的新的應用方式，該生物標志物在預測、預后、診斷妊娠的子癇前期疾病可以更加便利化，從而避免血液采集的繁瑣步驟。
[0010]為解決以上技術問題，本發明的技術方案是采用以FLRG作為檢測、診斷子癇前期疾病的標志物制備相應檢測工具的應用。
[0011]優選的，所述檢測工具的檢測對象為妊娠婦女的尿液。
[0012]優選的，所述檢測工具為定性檢測工具。
[0013]優選的，所述定性檢測工具為免疫層析試紙。
[0014]優選的，所述免疫層析試紙為膠體金免疫層析試紙。
[0015]優選的，所述膠體金免疫層析試紙設置有檢測線和控制線，膠體金濃度設置為0.5-2g/100ml，檢測線設置有以鼠抗人FLRG抗體為檢測抗體的檢測工作液，所述檢測工作液中鼠抗人FLRG抗體的濃度為0.5-3mg/ml ;控制線設置有以羊抗鼠IgG多克隆抗體為控制抗體的控制工作液，所述控制工作液中羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為0.2-lmg/ml。
[0016]優選的，所述檢測工具為重度子癇前期檢測工具。
[0017]優選的，所述重度子癇前期檢測工具對于FLRG的檢測限濃度為10-12ng/mL。
[0018]優選的，所述檢測限濃度為10ng/mL。
[0019]本發明還同時提供了前述任一應用方式制備得到的子癇前期檢測工具。
[0020]本發明與現有技術相比，其詳細說明如下:
[0021]本發明采用的核心技術方案為:以FLRG作為檢測、診斷子癇前期疾病的標志物制備相應檢測工具的應用
[0022]卵泡抑素相關基因(follistatin related-gene, FLRG),是一種富含半胱氨酸的單鏈糖基化蛋白，與卵泡抑素(follistatin，FS)具有高度的同源性，屬于卵泡抑素家族。FLRG結構具有高度的保守性，全長約7kb，包括5個外顯子和4個內含子，分別編碼信號肽、N末端、兩個FS區域、C末端。信號肽為23個氨基酸，含有兩個起始密碼子。在N末端存在兩個糖基化位點使FLRG在成熟過程中N端發生糖基化。FLRG的基本結構域是FS區，由大約70個氨基酸組成，其中含有10個半胱氨酸殘基。本發明人經過長期研究后發現該生物因子可存在于人尿液中，尤其是患有子癇前期的妊娠婦女和健康妊娠婦女的尿液中，該生物因子的含量差別較大。在患有子癇前期的妊娠婦女的尿液中，FLRG的含量可高達15.47±21.40ng/ml，而健康妊娠婦女的尿液中，FLRG的含量通常為0.18±0.37ng/ml。這使得FLRG作為子癇前期疾病檢測標志物成為可能。
[0023]本發明人還研究了患有子癇前期的妊娠婦女和健康妊娠婦女的血液中FLRG的含量差異；通過研究顯示，患有子癇前期的妊娠婦女和健康妊娠婦女的血液中FLRG的含量差異較小；因此，采用血液作為檢測對象并不能得到很好的檢測效果。
[0024]通過本發明人的上述研究可知，FLRG在作為預測、預后、診斷妊娠的子癇前期疾病的應用中，可優選采用將該生物標志物應用為制備成定性檢測子癇前期的工具，也即快速檢測工具，該工具可實現患者便利地自行對該疾病進行預測，從而可更加有效地確保母體和胎兒的安全。[0025]另外，當將FLRG作為生物標志物，并用于制備妊娠的子癇前期疾病的檢測工具，所述檢測工具的檢測對象為生物體的尿液時，由于檢測對象為生物體的尿液，特別是妊娠婦女的尿液，因而可實現無創檢測的方法；并且該檢測工具可實現對該疾病的定性檢測，無需大型的醫療檢測設備，因此其檢測一個樣品通常僅需要5-10分鐘，操作簡單，孕婦可自行操作，與現有的臨床檢測方式相比，其檢測速度大幅度提高。
[0026]進一步的，本發明還在前述的定性檢測工具上進一步研究，以達到更好的檢測效果。現有定性檢測工具中，最為常用的為免疫層析試紙，更優選可采用膠體金免疫層析試紙。當本發明應用方式所得的定性檢測妊娠的子癇前期疾病的檢測工具采用以下優選設置時:采用膠體金免疫層析試紙，其設置有檢測線和控制線，膠體金濃度設置為0.5-2g/100ml，檢測線設置有以鼠抗人FLRG抗體為檢測抗體的檢測工作液，所述檢測工作液中鼠抗人FLRG抗體的濃度為0.5-3mg/ml ;控制線設置有以羊抗鼠IgG多克隆抗體為控制抗體的控制工作液，所述控制工作液中羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為0.2-lmg/ml。該具體設置的應用方式所得的檢測工具在檢測效果上，靈敏度和特異性均可達到80%以上。
[0027]本發明人在此基礎上進一步研究了輕度子癇前期和重度子癇前期妊娠婦女患者的尿液中FLRG含量差異；通過研究發現，雖然輕度子癇前期妊娠婦女患者中尿液中的FLRG含量與重度子癇前期妊娠婦女患者中FLRG的含量差別不是特別明顯，但通過控制本申請應用方式中檢測工具對于FLRG的檢測限濃度可以對重度子癇前期妊娠患者達到更好的檢測效果，其靈敏度和特異性可以分別達到90%和80%以上。具體為控制檢測工具對于FLRG的檢測限濃度為10-12ng/mL,特別優選為10ng/mL。
[0028]本發明所述定性檢測工具，其可以采用標志物FLRG與反應底物反應后得到產物的顏色區別，或與底物結合后產物的顏色區別來定性區分子癇前期或健康妊娠婦女人群。
[0029]本發明所述對于FL RG的檢測限濃度應理解為，本發明所述應用方法得到的檢測工具在檢測子癇前期疾病時，檢測樣品中FLRG的濃度高于或等于該檢測限濃度時，定性或定量檢測結果為陽性，即患有子癇前期；當檢測樣品中FLRG的濃度低于該檢測限濃度時，定性或定量檢測結果為陰性，即未患有子癇前期。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1是健康對照組與子癇前期組中各兩例妊娠婦女的尿液樣本的細胞因子/趨化因子抗體芯片檢測結果圖；其中，B、D為子癇前期組，A、C為健康對照組。
【具體實施方式】
[0031]為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0032]以下實施例均為在華西第二醫院采集的試驗樣品，
[0033]實施例1
[0034]子癇前期組:124例子癇前期妊娠婦女；
[0035]健康對照組:135例健康妊娠婦女；
[0036]實驗對象臨床篩選標準:
[0037]子癇前期組一 (i)收縮壓≥HOmmHg ；[0038](i i )舒張壓≥ 90mmHg ；
[0039](iii)在24小時的尿液收集中蛋白排泄≥300mg，或者浸量尺≥2+。
[0040]健康對照組一(i)收縮壓<140mmHg ;
[0041](ii)舒張壓 <90mmHg ;
[0042](iii)在24小時的尿液收集中蛋白排泄<300mg，或者浸量尺〈2+。
[0043]實驗對象 年齡分布:124例子癇前期組妊娠婦女平均年齡28歲(年齡范圍19_35歲)，健康對照組平均年齡30歲(年齡范圍18-43歲)。
[0044]樣本收集方法:取各實驗組的尿液樣本。
[0045]A、實驗方法:細胞因子/趨化因子抗體芯片定性檢測
[0046]實驗條件:
[0047]I)將預先標記有174個細胞因子抗體的膜(RayBiotech，美國)放入檢測盒中，然后加入2ml封閉液,室溫封閉6小時；
[0048]2)棄去封閉液，加入1.2ml待檢樣本1份，4°C過夜孵育；
[0049]3)棄去樣本，用2ml洗滌緩沖液清洗5次；
[0050]4)加入Iml生物素偶聯的檢測抗體，室溫孵育2小時；
[0051]5)棄去抗體，用2ml洗滌緩沖液清洗5次；
[0052]6)加入2ml辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的鏈霉素親和素，室溫孵育2小時；
[0053]7)棄去液體，用2ml洗滌緩沖液清洗5次；
[0054]8)在膜上加入化學發光試劑500 μ I,避光作用2分鐘,觀察結果。
[0055]從子癇前期組、健康對照組中收集的待測樣本均采用上述實驗條件進行檢測，所得結果如圖1所示。
[0056]實驗結果:圖1中的標記I為Acrp30的表達信號,標記2為Adipsin的表達信號，標記3為FLRG的表達信號。
[0057]圖1是健康對照組與子癇前期組中各兩例妊娠婦女的尿液樣本的細胞因子/趨化因子抗體芯片檢測結果圖；其中，B、D為子癇前期組，A、C為健康對照組。
[0058]從圖1中可以看出，子癇前期組中的Acrp30、Adipsin以及FLRG的表達較強,而健康對照組中上述三者的表達較弱。
[0059]B、實驗方法:酶聯免疫吸附法定量檢測
[0060]實驗條件:
[0061]實驗材料:FLRG ELISA檢測試劑盒(R&D公司)
[0062]1.試劑的配制
[0063]洗漆緩沖液(WashBuffer)
[0064]底物溶液(Substrate Solution):使用前,將試劑盒中的顯色劑A和顯色劑B等量、避光混合15分鐘，每個孔需要兩種顯色劑的混合物200 μ I。
[0065]FLRG標準品:用Iml去離子水將FLRG標準品稀釋。稀釋后的標準品原液濃度為250ng/ml。為確保標準品充分混勻，在進一步稀釋前，將標準品放于搖床上輕輕晃動混勻至少15分鐘以上。
[0066]分別將250ng/ml 的標準品配置成濃度為 50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml,3.13ng/ml、l.56ng/ml的FLRG檢測標準品；RD5_7校準稀釋劑作為空白對照(Ong/ml)[0067]2.檢測程序
[0068]向每個微孔中加入100μ I FLRG Conjugate ;標準品、對照物、樣本的加入量為ΙΟΟμΙ，并加入到對應的微孔中。將微孔用試劑盒提供的膠條蓋好。將微孔板在室溫條件下置于水平搖床上500±50轉/分鐘培育1.5小時。洗板；每孔加底物溶液(SubstrateSolution) 200 μ I,室溫條件下，避光、平放培育30分鐘；每孔加50 μ I終止液(StopSolution)。孔中溶液的顏色將由藍色變為黃色。如果孔中溶液顏色為綠色或顏色變化不一致，輕輕拍打平板，以確保溶液充分混勻；30分鐘內測450nm吸光值。
[0069]3.制作標準曲線，計算樣本含量。
[0070]4.將計算所得的每個待測樣本的含量統計并繪制成圖表，并進行統計分析。
[0071]實驗結果:FLRG在子癇前期組尿液樣本中的濃度最高，平均可達到15.47ng/mL ；FLRG在健康對照組尿液樣本中的濃度較低，平均為0.18ng/mL。
[0072]從實施例1的實驗結果可知，發生子癇前期的妊娠婦女的尿液中含有大量的FLRG,而健康對照組的妊娠婦女的尿液中的FLRG含量較少。
[0073]并且從實施例1的實驗結果可知，FLRG可以作為用于妊娠的子癇前期疾病的生物標志物的應用。并且優選的，可將FLRG作為生物標志物，并用于制備妊娠的子癇前期疾病的檢測工具，所述檢測工具的檢測對象為生物體的尿液，特別是妊娠婦女的尿液。
[0074]以下是以妊娠婦女尿液中FLRG為檢測目標分子，并按照不同方式制備所得的定性或定量檢測工具的對照例，各對照例的制備方法如下:
[0075]對照例I——定量檢測工具I
[0076]采用試劑盒，該試劑盒設置有①鼠抗人FLRG單克隆抗體的多孔板，多孔板每孔包被鼠抗人FLRG單克隆抗體0.9 μ g?I μ g②生物素標記的鼠抗人FLRG單克隆抗體檢測液，主要由生物素標記的鼠抗人FLRG單克隆抗體、牛血清白蛋白、甘油和磷酸鹽緩沖液組成，生物素標記的鼠抗人FLRG單克隆抗體的濃度為24mg/mL，牛血清白蛋白的濃度為1.5g?3g/100mL,甘油的濃度為50mL/100mL③生物素標記的鼠抗人FLRG單克隆抗體結合的親和素-辣根過氧化物酶④顯色底物3'，3'，5，5'-四甲基聯苯胺和FLRG蛋白標準品。其對于妊娠婦女的尿液中FLRG的檢測限濃度為20ng/mL。
[0077]材料來源如下:
[0078]鼠抗人FLRG單克隆抗體:美國R&D公司
[0079]親和素-辣根過氧化物酶:上海雷浩信息科技有限公司
[0080]顯色底物3'，3'，5，5'-四甲基聯苯胺和FLRG蛋白標準品:美國R&D公司。
[0081]對照例2——定量檢測工具2
[0082]采用試劑盒，該試劑盒設置有A、磁性微球懸液:所述磁性微球為直徑
0.5 μ m-2 μ m的羥基化磁性微球與N-羥基硫代琥珀酸亞胺、碳二亞胺共同交聯所得；懸液中磁性微球的濃度為75-85個/ μ L ;Β、藻紅蛋白標記的鏈霉親和素和生物素標記的抗體檢測液:所述生物素為N-羥基琥珀酸亞胺酯；所述抗體為鼠抗人RFLG單克隆抗體；生物素標記的抗體的濃度為1.7-2mg/mL。C、可溶性細胞間粘附分子-1蛋白標準品以及標準品稀釋液。
[0083]材料來源如下:
[0084]1、RFLG蛋白標準品:購自R&D公司；[0085]2、鼠抗人RFLG單克隆抗體:購自R&D公司；
[0086]3、N-羥基硫代琥珀酸亞胺、N-羥基琥珀酸亞胺酯、2-嗎啉乙磺酸:購自Sigma公司；
[0087]4、藻紅蛋白標記的鏈霉親和素:購自Molecular Probes公司；
[0088]5、碳二亞胺:購自Pierce公司；
[0089]6、牛血清白蛋白(BSA):Roche公司。
[0090]試劑盒對于妊娠婦女的尿液中FLRG的檢測限濃度為15ng/mL。
[0091]對照例3
[0092]采用現有制備膠體金免疫層析試紙的通用方法制備本發明所述的子癇前期定性檢測工具。
[0093]所述檢測工具設置有檢測線和控制線，膠體金濃度設置為0.5g/100ml，檢測線設置有以鼠抗人FLRG抗體為檢測抗體的檢測工作液，所述檢測工作液中鼠抗人FLRG抗體的濃度為0.5mg/ml ;控制線設置有以羊抗鼠IgG多克隆抗體為控制抗體的控制工作液,所述控制工作液中羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為0.2mg/ml。
[0094]本對照例3中檢測工具對于妊娠婦女尿液中Adipsin的檢測限濃度為13ng/mL。
[0095]對照例4
[0096]采用現有制備膠體金免疫層析試紙的通用方法制備本發明所述的子癇前期定性檢測工具。
[0097]所述檢測工具設置有檢測線和控制線，膠體金濃度設置為2g/100ml，檢測線設置有以鼠抗人FLRG抗體為檢測抗體的檢測工作液，所述檢測工作液中鼠抗人FLRG抗體的濃度為3mg/ml ;控制線設置有以羊抗鼠IgG多克隆抗體為控制抗體的控制工作液,所述控制工作液中羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為lmg/ml。
[0098]本對照例4中檢測工具對于妊娠婦女尿液中Adipsin的檢測限濃度為12ng/mL。
[0099]對照例5
[0100]采用現有制備膠體金免疫層析試紙的通用方法制備本發明所述的子癇前期定性檢測工具。
[0101]所述檢測工具設置有檢測線和控制線，膠體金濃度設置為1.2g/100ml，檢測線設置有以鼠抗人FLRG抗體為檢測抗體的檢測工作液，所述檢測工作液中鼠抗人FLRG抗體的濃度為1.5mg/ml ;控制線設置有以羊抗鼠IgG多克隆抗體為控制抗體的控制工作液，所述控制工作液中羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為0.5mg/ml。
[0102]本對照例5中檢測工具對于妊娠婦女尿液中Adipsin的檢測限濃度為10ng/mL。
[0103]對照例6
[0104]采用現有制備膠體金免疫層析試紙的通用方法制備本發明所述的子癇前期定性檢測工具。
[0105]所述檢測工具設置有檢測線和控制線，膠體金濃度設置為1.5g/100ml，檢測線設置有以鼠抗人FLRG抗體為檢測抗體的檢測工作液，所述檢測工作液中鼠抗人FLRG抗體的濃度為2.5mg/ml ;控制線設置有以羊抗鼠IgG多克隆抗體為控制抗體的控制工作液，所述控制工作液中羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為0.8mg/ml。
[0106]本對照例6中檢測工具對于妊娠婦女尿液中Adipsin的檢測限濃度為llng/mL。[0107]上述對照例3-6中的材料來源如下:
[0108]鼠抗人FLRG抗體:RD公司，美國
[0109]羊抗鼠IgG多克隆抗體:武漢博士德公司，中國
[0110]實施例2
[0111]將不同方法獲得的對照例1-6子癇前期定性檢測工具分別用于檢測實施例1中的妊娠婦女尿液的臨床樣本，包括有子癇前期組和健康對照組，其中子癇前期組中的124例根據收縮壓和舒張壓大小以及蛋白尿24小時量區分為重度子癇前期組(sPE，篩選標準:收縮壓≥160mmHg，舒張壓≥1lOmmHg,蛋白尿>5g/24小時)54例和輕度子癇前期組(mPE，收縮壓≥140mmHg,舒張壓≥90mmHg,在24小時的尿液收集中蛋白排泄≥300mg)70例。健康對照組為135例。
[0112]樣本收集:取妊娠婦女尿液樣本。
[0113]利用對照例1-6分別對所收集的259例樣本進行檢測，所得檢測結果的陰性和陽性例數統計見表一:
[0114]表一
[0115]
【權利要求】
1.以FLRG作為檢測、診斷子癇前期疾病的標志物制備相應檢測工具的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述檢測工具的檢測對象為妊娠婦女的尿液。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述檢測工具為定性檢測工具。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述定性檢測工具為免疫層析試紙。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述免疫層析試紙為膠體金免疫層析試紙。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:所述膠體金免疫層析試紙設置有檢測線和控制線，膠體金濃度設置為0.5-2g/100ml，檢測線設置有以鼠抗人FLRG抗體為檢測抗體的檢測工作液，所述檢測工作液中鼠抗人FLRG抗體的濃度為0.5-3mg/ml ;控制線設置有以羊抗鼠IgG多克隆抗體為控制抗體的控制工作液，所述控制工作液中羊抗鼠IgG多克隆抗體的濃度為0.2-lmg/ml。
7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述檢測工具為重度子癇前期檢測工具。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述重度子癇前期檢測工具對于FLRG的檢測限濃度為10-12ng/mL。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述檢測限濃度為10ng/mL。
10.一種權利要求1-9中任一應用制備得到的妊娠的子癇前期疾病的檢測工具。
【文檔編號】G01N33/558GK103760340SQ201410042379
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2014年1月28日
【發明者】關祥乾, 胡懷忠 申請人:成都創宜生物科技有限公司