一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法及應用，屬于新型納米功能材料與生物傳感【技術領域】。具體是基于磺酸化石墨烯（HSO3-GS）和雙金屬納米多孔合金材料鉑鐵（PtFe），制備的檢測谷胱甘肽轉移酶的夾心型電化學免疫傳感器，用于檢測血清中的谷胱甘肽轉移酶。其特征在于：（1）磺酸化石墨烯的制備；（2）雙金屬多孔材料鉑鐵—辣根過氧化物酶—谷胱甘肽轉移酶二抗復合物的制備；（3）電化學免疫傳感器的制備。PtFe對H2O2具有很強的催化能力，同時利于固定更多的二抗、保持物質生物活性；將電子媒介體天青A加入底液中，避免了修飾到電極上后的泄漏問題，制備的傳感器靈敏度高、特異性好、易于操作、檢測限低。
【專利說明】一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法及應用。具體是基于磺酸化石墨烯(HSO3-GS)和雙金屬納米多孔合金材料鉬鐵(PtFe)，制備谷胱甘肽轉移酶的夾心型電化學免疫傳感器，用于檢測血清中的谷胱甘肽轉移酶。屬于新型納米功能材料與生物傳感【技術領域】。
【背景技術】
[0002]谷胱甘肽轉移酶(GST)主要是在肝臟中參與生物轉化第二相反應的一種生物酶，它既能在組織中又可在血清中檢測到，而其它許多腫瘤標志物只能在組織中檢測到，而且檢測血清中的GST對機體無侵襲性，可以大大方便臨床的應用，因此谷胱甘肽轉移酶免疫傳感器的研制具有重要的意義。
[0003]本發明基于合成納米材料磺酸化石墨烯(HSO3-GS)以及雙金屬納米多孔材料鉬鐵(PtFe)制備谷胱甘肽轉移酶夾心型免疫傳感器的研究，突出了電極修飾材料對生物傳感器增大響應、提高檢測靈敏度、增大線性范圍等作用。HSO3-GS具有比表面積大、能加強電子傳導等優勢，利用化學鍵合作用可直接與谷胱甘肽轉移酶一抗聯接，無需采用傳統交聯劑戊二醛固定化。采用PtFe有利于固定更多的二抗、保持物質生物活性，并且對H2O2具有很強的催化能力。兩者利用簡單滴涂法修飾于玻碳電極上可增強電極在反應過程中的電化學響應。將電子媒介體天青A加入底液中，避免了修飾到電極上后的泄漏問題。
[0004]本發明制得的生物傳感器的響應電流與GST濃度在0.01?12 ng/mL范圍內保持良好的線性關系，檢測限為2.1 pg/mL。
[0005]本發明利用免疫反應的高特異性，結合HSO3-GS和PtFe，制備了 一種谷胱甘肽轉移酶夾心型免疫傳感器。
[0006]本發明具有靈敏度高、特異性好、檢測成本低、能快速檢測谷胱甘肽轉移酶等優勢，且本發明制備過程簡單，操作過程簡便，有效克服了目前谷胱甘肽轉移酶檢測方法的不足。
【發明內容】
[0007]本發明的目的之一在于避免傳統檢測方法的儀器設備復雜、操作過程繁瑣、檢測人員要求高等缺點，提供了一種靈敏度高、特異性強、重現性好、操作簡便的快速檢測谷胱甘肽轉移酶的電化學免疫傳感器的制備方法。
[0008]本發明的目的之二是將該電化學免疫傳感器應用于谷胱甘肽轉移酶的檢測。
[0009]為了實現上述目的，本發明是通過以下措施來實現的。
[0010]一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(I)PtFe的制備
將PtFeAl合金片放到裝有0.5?1.0 mol.T1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，40?50°C條件下，放置24?48 h，將得到的產物用二次水反復洗，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0011](2) PtFe/辣根過氧化物酶/谷胱甘肽轉移酶二抗復合物(PtFe/HRP/Ab2)制備 將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比
為PtFe: HRP: Ab2 = 1: 0.5 ^ 2: 0.5 ^ 2進行混合，4°C條件下，進行振蕩孵化，孵化12~24 h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0012](3)電化學免疫傳感器的制備
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0,0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.L-1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2~0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于90 mV ；
2)將殼聚糖分散的HSO3-GS修飾于玻碳電極表面,室溫干燥；
3)將谷胱甘肽轉移酶一抗(Ab1)滴涂到步驟2)HS03-GS修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干； 4)將濃度為100Pg.ml/1牛血清白蛋白滴涂到步驟3)41^修飾的電極表面,4°C下濕潤條件下晾干；
5)將GST滴涂在步驟4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
6)將PtFe/HRP/Ab2滴涂在步驟5)GST修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，電化學免疫傳感器制備完成。
[0013]所述HSO3-GS的濃度為0.5~2.5 mg.mL—1，所述PtFe懸浮液的濃度為10mg.ml/1,所述HRP的濃度為1.0 mg.ml/1,所述Ab2的濃度為1.0 mg.mL'
[0014](4)電化學免疫傳感器的應用 用于谷胱甘肽轉移酶的檢測，步驟如下:
1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在0.01~12 ng.ml/1范圍內不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至上述步驟4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照上述步驟6)修飾電極，連接至電化學工作站中，分別將電極置于含有 2.0 ~3.0 mmol.L-1 天青 A 和 1.0 ~5.0 mmol.L-1 H2O2 的 ρΗ=7.4 的 PBS緩沖溶液中測定其電流變化；
2)根據所得電流差值與GST濃度呈線性關系，繪制工作曲線；
3)依據工作曲線的繪制方法進行樣品中GST的檢測，檢測結果從工作曲線中查得。
[0015]本發明的有益成果
(I)谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器，HSO3-GS引入到谷胱甘肽轉移酶抗原電化學免疫傳感器的制備當中，利用HSO3-GS良好的電子傳遞能力，顯著改善了電極的性能。
[0016](2)將PtFe與腫瘤標志物二抗直接孵化，利用鉬鐵優異的生物相容性和高的催化性能，顯著提高了電化學免疫傳感器的重現性和穩定性。
[0017](3) PtFe與辣根過氧化物酶復合標記二抗，具有對信號的協同增敏作用。
[0018](4)本發明所制備的電化學免疫傳感器，操作簡單，檢測速度快，可在短時間內實現批量樣品的測定。
【具體實施方式】
[0019]實施例1 PtFe的制備將PtFeAl合金片放到裝有0.5 mo I.T1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，40 °C條件下，放置24 h，將得到的產物用二次水反復洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0020]實施例2 PtFe的制備
將PtFeAl合金片放到裝有1.0 mo 1-L^1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，50°C條件下，放置48 h，將得到的產物用二次水反復洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0021]實施例3 PtFe的制備
將PtFeAl合金片放到裝有0.7 mo 1-L^1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，45 V條件下，放置35 h，將得到的產物用二次水反復洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe。
[0022]實施例4 PtFe/HRP/Ab2 制備
將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe: HRP: Ab2 = 1: 0.5: 0.5進行混合，4°C條件下，進行振蕩孵化，孵化12 h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0023]實施例5 PtFe/HRP/Ab2 制備
將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe: HRP: Ab2 = 1:1:1進行混合，4°C條件下，進行振蕩孵化，孵化24h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0024]實施例6 PtFe/HRP/Ab2 制備
將裝有PtFe懸浮液超聲，移取PtFe懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe: HRP: Ab2 = 1: 2: 2進行混合，4°C條件下，進行振蕩孵化，孵化18h后，置于4 °C冰箱中保存待用。
[0025]實施例7電化學免疫傳感器的制備
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.I/1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2~0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于90 mV ；
(2)將殼聚糖分散的HSO3-GS修飾于玻碳電極表面,室溫干燥；
(3)將谷胱甘肽轉移酶一抗(Ab1)滴涂到步驟(2)HS03-GS修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干；
(4)將濃度為100Kg 牛血清白蛋白滴涂到步驟(S)Ab1修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
(5)將GST滴涂在步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
(6)將PtFe/HRP/Ab2滴涂在步驟(5)GST修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，電化學免疫傳感器制備完成。
[0026]實施例8電化學免疫傳感器的應用 用于谷胱甘肽轉移 酶的檢測，步驟如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在0.01 ng.ml/1范圍內不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至實施例7中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照實施例7中步驟(6)修飾電極，連接至電化學工作站中，分別將電極置于含有2.0 mmol.L-1天青A和1.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測定其電流變化；(2)根據所得電流差值與GST濃度呈線性關系，繪制工作曲線；
(3)依據工作曲線的繪制方法進行樣品中GST的檢測，檢測結果從工作曲線中查得。
[0027]實施例9電化學免疫傳感器的應用 用于谷胱甘肽轉移酶的檢測，步驟如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在12 ng.ml/1范圍內不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至實施例7中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照實施例7中步驟(6)修飾電極，連接至電化學工作站中，分別將電極置于含有3.0 mmol.L-1天青A和5.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測定其電流變化；
(2)根據所得電流差值與GST濃度呈線性關系，繪制工作曲線；
(3)依據工作曲線的繪制方法進行樣品中GST的檢測，檢測結果從工作曲線中查得。
[0028]實施例10電化學免疫傳感器的應用 用于谷胱甘肽轉移酶的檢測，步驟如下:
(1)采用0.10 mo I.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在5.0 ng.ml/1范圍內不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至實施例7中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照實施例7中步驟(6)修飾電極，連接至電化學工作站中，分別將電極置于含有2.5 mmol.L-1天青A和3.0 mmol.L-1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測定其電流變化；
(2)根據所得電流差值與GST濃度呈線性關系，繪制工作曲線；
(3)依據工作曲線的繪制方法進行樣品中GST的檢測，檢測結果從工作曲線中查得。
【權利要求】
1.一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雙金屬納米多孔材料鉬鐵(PtFe)的制備 將PtFeAl合金片放到裝有0.5~1.0 mol.T1NaOH溶液的小燒杯中，置于恒溫水浴中，40~50°C條件下，放置24~48 h，將得到的產物用二次水反復洗滌，室溫下晾干，即制備出所需的PtFe ； (2)PtFe/辣根過氧化物酶/谷胱甘肽轉移酶二抗復合物(PtFe/HRP/Ab2)制備 將PtFe懸浮液超聲，移取懸浮液、HRP溶液和Ab2溶液于一離心管中，體積比為PtFe:HRP: Ab2 = 1: 0.5~2: 0.5~2進行混合，4°C條件下，進行振蕩孵化，孵化12~24h后，置于4 1:冰箱中保存待用； (3)電化學免疫傳感器的制備。
2.如權利要求1所述的一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述的電化學免疫傳感器的制備，步驟如下: (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2~0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于80 mV ； (2)將殼聚糖分散的HSO3-GS修飾于玻碳電極表面,室溫干燥； (3)將谷胱甘肽轉移酶一抗(Ab1)滴涂到步驟(2)HS03-GS修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干； (4)將濃度為100Kg 牛血清白蛋白滴涂到步驟(S)Ab1修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干； (5)將谷胱甘肽轉移酶抗原(GST)滴涂在步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干； (6)將PtFe/HRP/Ab2滴涂在步驟(5)GST修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，電化學免疫傳感器制備完成。
3.如權利要求1所述的一種谷胱甘肽轉移酶抗原生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述HSO3-GS的濃度為0.5~2.5 mg.πι?Λ所述PtFe懸浮液的濃度為10 mg.mL—1，所述HRP的濃度為1.0 mg.ml/1,所述Ab2的濃度為1.0 mg.mL'
4.如權利要求1~3之一所述的制備方法制備的傳感器的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)采用0.10 mol.ml/1, pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液,配制在0.01~12 ng.mL-1范圍內不同濃度的GST溶液，將6 μ L不同濃度的GST溶液分別滴涂至權利要求2中步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，晾干后，按照權利要求2中步驟(6)修飾電極，連接至電化學工作站中，分別將電極置于含有2.0~3.0 mmol1天青A和1.0~5.0 mmol1 H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液中測定其電流變化； (2)根據所得電流差值與GST濃度呈線性關系，繪制工作曲線； (3)依據工作曲線的繪制方法進行樣品中GST的檢測，檢測結果從工作曲線中查得。
【文檔編號】G01N27/48GK103868971SQ201410036028
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】魏琴, 李月云, 閆濤, 胡麗華, 張勇, 吳丹, 李賀, 魏東 申請人:濟南大學