一種用于免疫復合物緩沖解離劑的cic抗體緩沖液解離劑的制作方法
【專利摘要】本發明涉及醫學檢測領域，公開了一種用于免疫復合物緩沖解離劑的CIC抗體緩沖液解離劑，每1L的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分：甘氨酸、35%-37%的濃鹽酸、氯化鈉、液體生物防腐劑、蒸餾水。本發明利用該種免疫復合物緩沖解離劑檢測CIC的方法，建立了特異性檢測CIC中抗體的標準操作流程，這是目前現有CIC檢測方法都無法解決的問題。本發明同時具備特異、靈敏、批量高效、重復性好、不受干擾、可定量或定性檢測的技術特征。該種免疫復合物緩沖解離劑應用于患有感染性疾病、內分泌代謝性疾病、自身免疫性疾病、部分腫瘤疾病患者的體液標本中CIC的檢測。
【專利說明】一種用于免疫復合物緩沖解離劑的Cic抗體緩沖液解離劑
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學檢測領域，尤其涉及一種用于免疫復合物緩沖解離劑的CIC抗體緩沖液解離劑。
【背景技術】
[0002]細菌、病毒等病原體侵入機體后或致敏物質(抗原，含自身抗原)刺激機體發生免疫應答，進而產生特異性免疫效應細胞或抗體，并與抗原發生特異性結合，所得到的復合物稱為免疫復合物(又稱抗原抗體復合物，immune complex, IC),主要有IgG, IgM, IgA, IgE型免疫復合物，其中以IgG和IgM最常見。由于抗原與抗體比例不同，所形成的IC分子大小各異，通常有三種形式:一是抗原抗體比例適當時，形成大分子的不溶性IC(大于19S)，易被吞噬細胞捕獲、吞噬和清除。二是抗原量過剩時，形成小分子的可溶性IC (小于6.6S)，易透過腎小球濾過隨尿排出體外。三是抗原量稍過剩時，形成中等大小的可溶性IC(8.8-19S)，它既不被吞噬細胞清除，又不能通過腎小球濾過排出，可較長時間游離于血液和其他體液中，又稱循環免疫復合物(circulating immuno complex, CIC)。
[0003]正常情況下，機體內的游離抗原與相應抗體結合形成1C，可被機體的防御系統清除，作為清除異物抗原的一種方式，對機體有利。但在某些病理情況下，體內形成的IC不能被及時清除，可在局部沉積，通過激活補體，并在血小板、中性粒細胞等參與下，引起一系列連鎖反應而導致組織損傷，出現臨床癥狀，稱為免疫復合物病(immuno complex disease,I⑶)。檢查組織內或循環體液中IC的存在有助于某些疾病的診斷、發病機制的研究、預后評估、病情活動觀察和療效判斷等。因此，準確、特異、靈敏檢測免疫復合物對疾病的診斷、治療和預后評估具有重要的臨床意義，CIC的檢測日益受到重視。
[0004]世界衛生組織(WHO)曾組織進行CIC檢測方法學研究，發現尚無任何一種技術同時具備特異、靈敏、批量高效、重復性好的所有特點。由于方法的復雜性、敏感性和所檢測CIC類型的局限性，目前的常用CIC檢測技術均受到免疫復合物內免疫球蛋白種類及亞類、復合物大小、抗原與抗體比例、固定補體的能力等因素影響，在臨床免疫學實驗室應用受到很大限制。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有CIC檢測技術及檢測過程中，不能同時具備特異、靈敏、批量高效、重復性好、不受干擾的技術問題，公開了一種解決了以上技術問題的免疫復合物緩沖解離劑，還公開了該種免疫復合物緩沖解離劑的應用領域。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決。
[0007]一種免疫復合物緩沖解離劑，以如下體積比例配比計，各組分及含量為，135-165 u I 的 CIC 分離劑、290-315 U I 的 CIC 洗滌劑、5-16 U I 的 CIC 復溶劑、65-76 U I 的CIC抗體緩沖液解離劑和65-76 ill的CIC抗體緩沖液解離中和劑。以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復合物為例，本發明的試劑配方可以使CIC中的抗體解離率達到37.5%-51.0%(抗體解離率:指Cic解離后檢測到的抗體量與實際CIC中抗體量的百分比)。而現有的CIC檢測技術因為抗體被破壞或一些干擾因素的存在，無法檢測Cic中的抗體。
[0008]其中，每IL的CIC分離劑包括以下組分:5.2g-7.7g的硼砂、4.lg-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC分離劑的作用如下:當每IL的CIC分離劑中包括5.2g-7.7g的硼砂、4.lg-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水時，被分離的CIC達到最大量，同時改用氯化鈉也可避免了傳統沉淀方法中氟化鈉殘留對后續檢測抗體的干擾。本發明采用的聚乙二醇，作為優選選用聚乙二醇6000 ;本發明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0009]每IL的CIC洗滌劑包括以下組分:5.2g-7.7g的硼砂、4.lg-6.1g的硼酸、35g_45g的聚乙二醇、8.0g-11.7g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。以上配方的CIC洗滌劑主要針對CIC分離劑的配方進行設計，其作用是洗去體液標本中多余的雜蛋白。本發明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0010]每IL的CIC復溶劑包括以下組分:8.0g-9.5g的氯化鈉、(λ Olg-0.03g的氫氧化鈉、50 μ 1-500 μ I的聚乙二醇辛基苯基醚、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC復溶劑針對解離時的緩沖量大小而設計，以上配方的CIC復溶劑對分離CIC的損傷程度最小；采用等滲的聚乙二醇辛基苯基醚，低濃度的聚乙二醇辛基苯基醚協助溶解CIC。本發明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100，本發明中提到的液體生物防腐劑為 Proclin-300。
[0011]每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:3.5-5.5g的甘氨酸、4.0ml-6.0ml質量分數為35%-37%的濃鹽酸、4.4g-6.6g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。該組分的CIC抗體緩沖液解離劑使CIC中抗體解離效果較為理想。如以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復合物為參照，抗體解離率達到37.5%_51.0%。本發明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0012]作為優選，每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:4.0g-5.0g的甘氨酸、
4.5ml-5.5ml質量分數為35.5%_36.5%的濃鹽酸、4.8g_6.0g的氯化鈉、120 μ 1-450 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。該組分的CIC抗體緩沖液解離劑使CIC中抗體解離效果較為理想。如以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復合物為參照，抗體解離率達到40%-51%。本發明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0013]作為優選，每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g-5.0g的甘氨酸、
5.0ml-5.5ml質量分數為36%_36.5%的濃鹽酸、5.5g_6.0g的氯化鈉、200 μ 1-450 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。該組分的CIC抗體緩沖液解離劑使CIC中抗體解離程度最為理想。如以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復合物為參照，抗體解離率達到45%-51%。本發明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0014]作為優選，每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g的甘氨酸、
5.0ml質量分數為36%的濃鹽酸、5.5g的氯化鈉、200 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。該組分的CIC抗體緩沖液解離劑使CIC中抗體達到最大程度的解離。如以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復合物為參照，抗體解離率達到51.0%。本發明中提到的液體生物防腐劑為 Procl in-300 ο[0015]每IL的CIC抗體緩沖液解離中和劑包括以下組分:6.8g-10.0g的氨基丁三醇、6.5g-9.6g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC抗體緩沖液解離劑主要是對CIC解離的抗體緩沖液進行中和，使滲透壓、pH達到抗體的最適環境，以利于對抗體的檢測。本發明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0016]以上提到的該種免疫復合物緩沖解離劑應用于患有感染性疾病、內分泌代謝性疾病、自身免疫性疾病、部分腫瘤疾病患者的血清、胸腹水、尿液、腦脊液、關節腔液中CIC的檢測。感染性疾病、內分泌代謝性疾病、自身免疫性疾病、部分腫瘤疾病等患者的血清、胸腹水、尿液、腦脊液、關節腔液等體液標本中是否存在相應CIC，我們可以通過分離CIC，從而推斷患者血清、胸腹水、尿液、腦脊液、關節腔液等體液中是否存在相應特異性標志物的CIC以及含量高低，以了解CIC在上述疾病發生發展過程中的病理生理作用及相關性；相關標志物陰性體液標本中若檢測到相應Cic中的抗原或抗體(通常情況下，抗原解離率高于抗體解離率)，則能提高該標志物的檢出率及對相應疾病的診斷靈敏度。
[0017]一種利用以上的免疫復合物緩沖解離劑檢測CIC的方法，檢測CIC中抗體的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫復合物為例，由下述步驟組成，
[0018]A.分離:向2支Iml的離心管分別加入150 μ I含有CIC的待測樣本，再分別加入135 μ 1-165 μ I的CIC分離劑；混勻后，在37°C放置30min，進行離心，離心結束后棄去上清液；
[0019]B.洗滌:向兩支離心管中，分別加入290μ 1_315μ I的CIC洗滌劑，離心后，棄去上清液，并將CIC沉淀物浙干；
[0020]C.復溶:分別向含有浙干的CIC沉淀物的離心管中，加入5μ 1_16μ I的CIC復溶劑，離心管安裝于振蕩器上，振蕩至溶液中無塊狀沉淀物；
`[0021]D.空白樣品檢測:將一支離心管標記為空白樣品管,并加入65 μ 1-76 μ I的抗體緩沖液解離劑和65 μ 1-76 μ I的抗體緩沖液解離中和劑，混勻后檢測抗-HBs，將檢測結果作為空白值；
[0022]E.CIC抗體解離:將另一支離心管標記為測定樣品管,并加入65 μ 1-76 μ I抗體緩沖液解離劑，在15°C放置30min(在15°C空氣孵育放置30min或在15°C°C水浴放置30min)，得到解離液；
[0023]F.CIC抗體解離中和:向步驟E中得到的解離液中，加入65 μ 1-76 μ I抗體緩沖液解離中和劑，混勻后檢測抗-HBs，將檢測結果作為測定值。
[0024]HBsAg-抗-HBs免疫復合物解離后抗體檢測結果判斷標準，如下表所示:
[0025]表1HBsAg-抗-HBs免疫復合物解離后抗體檢測結果判斷標準
[0026]
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【權利要求】
1.一種用于免疫復合物緩沖解離劑的Cic抗體緩沖液解離劑，其特征在于:包括CIC抗體緩沖液解離劑；其中，每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:3.5g-5.5g的甘氨酸、4.0ml-6.0ml質量分數為35%_37%的濃鹽酸、4.4g_6.6g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。
2.權利要求1所述的一種用于免疫復合物緩沖解離劑的CIC抗體緩沖液解離劑，其特征在于:每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:4.0g-5.0g的甘氨酸、4.5ml_5.5ml質量分數為35.5%-36.5%的濃鹽酸、4.8g_6.0g的氯化鈉、120 μ 1-450 μ I的液體生物防腐齊U、余量為蒸餾水。
3.權利要求1所述的一種用于免疫復合物緩沖解離劑的CIC抗體緩沖液解離劑，其特征在于:每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g-5.0g的甘氨酸、5.0ml-5.5ml質量分數為36%-36.5%的濃鹽酸、5.5g-6.0g的氯化鈉、200 μ 1-450 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。
4.權利要求1所述的一種用于免疫復合物緩沖解離劑的CIC抗體緩沖液解離劑，其特征在于:每IL的CIC抗體緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g的甘氨酸、5.0ml質量分數為36%的濃鹽酸、5.5g的氯化鈉、200 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。
【文檔編號】G01N33/53GK103776996SQ201410032043
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】成軍, 張益明, 馬炬明, 陳達偉, 孫長貴, 戴玉柱, 王國政, 江曉肖 申請人:中國人民解放軍第一一七醫院