一種三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提出一種三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法，包括，瘤胃培養(yǎng)，酸處理，胰液培養(yǎng)三個(gè)步驟，本發(fā)明三步體外法技術(shù)中改變現(xiàn)有技術(shù)利用胰酶進(jìn)行飼料處理的方法，直接使用胰液進(jìn)行處理，除了能用來(lái)消化降解飼料樣本中的瘤胃非降解飼料蛋白(RUP)外，本發(fā)明所采用的胰液法還為反芻動(dòng)物小腸淀粉消化率、脂肪消化率的評(píng)價(jià)提供了一個(gè)很好的途徑。通過(guò)一次三步體外法就可以模擬出反芻動(dòng)物對(duì)飼料中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪的消化情況，測(cè)出蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪小腸消化率三個(gè)重要指標(biāo)。操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)且節(jié)約成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種反芻動(dòng)物小腸消化率測(cè)定方法，特別涉及一種采用胰液的三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在反芻動(dòng)物小腸中，可代謝蛋白質(zhì)是由瘤胃合成的微生物蛋白、瘤胃非降解飼料蛋白(RUP)及少量?jī)?nèi)源蛋白構(gòu)成。研究表明，微生物蛋白小腸消化率基本是固定的(80% -85% )，但是RUP小腸消化率受飼料類(lèi)型、飼料來(lái)源及加工方式等因素影響。飼料RUP小腸消化率是影響奶牛的產(chǎn)奶量、生產(chǎn)性能的重要參數(shù)。
[0003]目前，蛋白評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)不同飼料的RUP小腸消化率均采用固定值，在英國(guó)飼料評(píng)價(jià)系統(tǒng)、NRC體系中，所有飼料的RUP小腸消化率分別均為90%、80%。這種狀況對(duì)不同飼料顯然具有很大局限性。目前，測(cè)定飼料RUP小腸消化率主要有移動(dòng)尼龍袋法、三步體外法。移動(dòng)尼龍袋法由于存在操作成本高、過(guò)程復(fù)雜、與實(shí)際食糜移動(dòng)速率存在差異等缺點(diǎn)不易廣泛應(yīng)用。三步體外法是在特定溫度和PH條件下用一種酶或多酶復(fù)合物培養(yǎng)飼料樣品。三步體外法技術(shù)I)盡量的模擬反芻動(dòng)物的生理?xiàng)l件，包括瘤胃發(fā)酵的潛在影響；2)擁有快速、可靠、廉價(jià)的特點(diǎn)；3)適用廣泛的蛋白質(zhì)補(bǔ)充物。4)準(zhǔn)確的反應(yīng)不同蛋白質(zhì)的消化。所以，目前三步體外法常被用來(lái)作為評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物飼料RUP小腸消化率的方法。
[0004]目前常用三步體外法中所使用的是胰酶(SigmaP-7545)。
[0005]胰酶(Sigma P-7545)主要包含有糜蛋白酶、胰蛋白酶。
[0006]該胰酶的使用方法是:配置成pH值為7.8的磷酸緩沖溶液，其中包含有50ppm百里酚、3g/L胰酶(Sigma P-7545)。在三步體外法中第三步胰酶培養(yǎng)過(guò)程中，取13.5ml該溶液與0.5ml、lmol/L的NaOH溶液加入到培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。
[0007]該方法只能用來(lái)消化降解飼料樣本中的瘤胃非降解飼料蛋白(RUP)，測(cè)定出反芻動(dòng)物小腸蛋白質(zhì)消化率這一個(gè)反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的指標(biāo)。但這種方法不能測(cè)定小腸淀粉和脂肪的消化率，無(wú)法全面評(píng)價(jià)某種飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且無(wú)法消除飼料中淀粉和脂肪對(duì)蛋白質(zhì)消化率的影響。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提出一種三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法，本發(fā)明三步體外法技術(shù)中直接使用胰液進(jìn)行處理，不僅能用來(lái)消化降解飼料樣本中的瘤胃非降解飼料蛋白(RUP)，還能消化通過(guò)瘤胃的飼料中的淀粉和脂肪，可以測(cè)定出反芻動(dòng)物小腸蛋白質(zhì)消化率、淀粉消化率、脂肪消化率，評(píng)價(jià)出三個(gè)反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明一種三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法，其具體步驟為:
[0010]I)、瘤胃培養(yǎng)[0011]稱(chēng)取約15g飼料，裝入9cmX15cm的尼龍袋中，懸吊在瘤胃中16小時(shí)，培養(yǎng)后，用自來(lái)水沖洗袋子至流水澄清，并且55°C干燥48小時(shí)，取出袋子中殘余樣本，并測(cè)定N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0012]2)、酸處理
[0013]稱(chēng)0.6?0.7g殘余的樣本,放入50ml離心管,加入10ml>pH值為1.9的0.1mol/L的HCl溶液，38°C水浴振蕩培養(yǎng)I小時(shí)；
[0014]3)、胰液培養(yǎng)
[0015]利用胰液培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，離心管立即加入3ml、100% (wt/vol) TCA溶液，停止酶的作用并沉淀未消化的蛋白質(zhì)，以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；
[0016]測(cè)定沉淀物中N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0017]通過(guò)步驟I)中N含量、淀粉含量、脂肪含量與步驟3)中同種物質(zhì)含量比值的百分率得出飼料樣本的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪小腸消化率。
[0018]所述步驟3)中胰液培養(yǎng)的具體操作為:培養(yǎng)物中加入13.5ml的磷酸緩沖液，再用lmol/1的NaOH溶液將培養(yǎng)液pH值調(diào)至7.6，再加入胰液2.5ml，38°C水浴振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
[0019]所述胰液來(lái)自于安裝胰液收集管的閹牛、奶?；蜓?，獲取后4°C保存至實(shí)驗(yàn)室，備用。
[0020]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所采用的胰液法完全可以代替目前常用的胰酶法用于三步體外法培養(yǎng)技術(shù)，且能夠更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物各種飼料的小腸蛋白質(zhì)消化率。
[0021]同時(shí)，本發(fā)明所采用的胰液法為反芻動(dòng)物小腸淀粉消化率、脂肪消化率的評(píng)價(jià)提供了一個(gè)很好的途徑。通過(guò)一次三步體外法就可以模擬出反芻動(dòng)物對(duì)飼料中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪的消化情況，測(cè)出蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪小腸消化率三個(gè)重要指標(biāo)。操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)且節(jié)約成本。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為胰液加入量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體外蛋白質(zhì)消化率的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述:
[0024]本發(fā)明一種三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法，其具體步驟為:
[0025]I)、瘤胃培養(yǎng)
[0026]稱(chēng)取約15g飼料,裝入9cmX15cm的尼龍袋中，懸吊在瘤胃中16小時(shí),培養(yǎng)后,用自來(lái)水沖洗袋子至流水澄清，并且55°C干燥48小時(shí)，取出袋子中殘余樣本，并測(cè)定N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0027]2)、酸處理
[0028]稱(chēng)0.6?0.7g殘余的樣本，放入50ml離心管,加入10ml>pH值為1.9的0.1mol/L的HCl溶液，38°C水浴振蕩培養(yǎng)I小時(shí)；
[0029]3)、胰液培養(yǎng)[0030]利用胰液培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，離心管立即加入3ml、100% (wt/vol) TCA溶液，停止酶的作用并沉淀未消化的蛋白質(zhì)，以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；
[0031]測(cè)定沉淀物中N含量、淀粉含量、脂肪含量；
[0032]通過(guò)步驟I)中N含量、淀粉含量、脂肪含量與步驟3)中同種物質(zhì)含量比值的百分率得出飼料樣本的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪小腸消化率。
[0033]所述步驟3)中胰液培養(yǎng)的具體操作為:培養(yǎng)物中加入13.5ml的磷酸緩沖液，再用lmol/1的NaOH溶液將培養(yǎng)液pH值調(diào)至7.6，再加入胰液2.5ml，38°C水浴振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。小腸內(nèi)的PH —般介于7.2-8.0，所以使用磷酸緩沖液和NaOH溶液將pH調(diào)到7.6以有利于消化酶活性的發(fā)揮。依據(jù)試驗(yàn)研究，最佳胰液加入量為2.5ml (圖1)。
[0034]所述胰液來(lái)自于安裝胰液收集管的2只周歲閹牛，體重為350kg，獲取2只閹牛的胰液，等比例混合，4°C保存至實(shí)驗(yàn)室，備用。
[0035]國(guó)際上公認(rèn)的測(cè)定蛋白質(zhì)小腸消化率的方法為胰酶法。如圖1所示，胰酶(SigmaP-7545)法測(cè)定的蛋白質(zhì)小腸消化率為91.8% (叉號(hào)表示)；本發(fā)明中所采用的2.5ml胰液培養(yǎng)24小時(shí)的胰液培養(yǎng)方法測(cè)定的蛋白質(zhì)小腸消化率為93.2% (正方好表不),與胰酶法測(cè)定值差異不顯著(P > 0.10)。采用Iml (菱形號(hào))或5ml (三角號(hào))胰液測(cè)定的消化率與胰酶法不符。
[0036]如表1所示，本發(fā)明所采用的胰液法與目前常用的胰酶(Sigma P-7545)法對(duì)體外蛋白質(zhì)消化率沒(méi)有影響(P > 0.10)。各種原料樣本均表示兩種方法之間差異不顯著。
[0037]表1酶法和胰液法對(duì)體外蛋白質(zhì)飼料蛋白質(zhì)消化率的比較
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種三步體外技術(shù)測(cè)定養(yǎng)分小腸消化率的方法，其具體步驟為: 1)、瘤胃培養(yǎng) 取適量飼料，裝入尼龍袋，懸吊在瘤胃中16小時(shí)，培養(yǎng)后，用自來(lái)水沖洗袋子至流水澄清，并且55°C干燥48小時(shí)，取出袋子中殘余樣本，并測(cè)定N含量、淀粉含量、脂肪含量； 2)、酸處理 稱(chēng)0.6?0.7g殘余的樣本,放入50ml離心管,加入IOml> pH值為1.9的0.lmol/L的HCl溶液，38°C水浴振蕩培養(yǎng)I小時(shí)； 3)、胰液培養(yǎng) 利用胰液培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，離心管立即加入3ml、100% (wt/vol)TCA溶液，停止酶的作用并沉淀未消化的蛋白質(zhì)，以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘； 測(cè)定沉淀物中N含量、淀粉含量、脂肪含量； 通過(guò)步驟I)中N含量、淀粉含量、脂肪含量與步驟3)中同種物質(zhì)含量比值的百分率得出飼料樣本的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪小腸消化率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中胰液培養(yǎng)的具體操作為:培養(yǎng)物中加入13.5ml的磷酸緩沖液，再用lmol/1的NaOH溶液將培養(yǎng)液pH值調(diào)至7.6，再加入胰液2.5ml，38°C水浴振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述胰液來(lái)自于安裝胰液收集管的閹牛、奶?；蜓?，獲取后4°C保存至實(shí)驗(yàn)室，備用。
【文檔編號(hào)】G01N33/00GK103760305SQ201410016733
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】徐 明, 高明 申請(qǐng)人:徐 明