一種檢測尿液中3-羥基可替寧的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測尿液中3-羥基可替寧的方法。包括建立(3R,5S)-3-羥基可替寧與(3S,5S)-3-羥基可替寧標準溶液工作曲線；并對尿液樣品進行酶解、稀釋和過濾后上HPLC-MS-MS檢測，進而換算出尿樣中(3R,5S)-3-羥基可替寧與(3S,5S)-3-羥基可替寧的濃度，然后計算兩者的比例。該方法可以為評估個體的代謝健康狀況以及評價煙氣中尼古丁的暴露程度提供一種科學的判定方法，具有檢測限低、穩定性好、快速準確等優點，填補了這一【技術領域】的空白。
【專利說明】一種檢測尿液中3-羥基可替寧的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于煙草生物堿理化檢驗【技術領域】，具體涉及一種檢測尿液中(3R, 5S)-3-羥基可替寧與(3S，5S)-3-羥基可替寧的方法。
【背景技術】
[0002]尼古丁是煙草中的主要生物堿，在煙草中平均含量達4 %，約占煙草生物堿總量的95%。吸煙者抽吸煙草主要是因為尼古丁能夠帶來生理和心理方面的滿足感，研究證明尼古丁對人體的生理作用主要包括對中樞神經系統、心血管系統和內分泌系統等的作用。尼古丁在人體內(主要是在肝臟中，其次是在肺和腎臟中)可以很快的代謝成多種產物，主要代謝產物有3-羥基可替寧及其糖苷、可替寧及其糖苷、尼古丁及其糖苷、降煙堿、降可替寧、尼古丁氮氧化物、可替寧氮氧化物，這些代謝產物約占人體吸收尼古丁總量的90%以上。在人尿樣中的可替寧及其糖苷約占尼古丁吸收量的26%，3-羥基可替寧及其糖苷約占尼古丁吸收量的41%，但目前人們更習慣使用可替寧作為尼古丁暴露在尿樣中的生物標志物，這主要是因為在人體中約71%以上的尼古丁首先被代謝成可替寧，然后才被進一步代謝成3-羥基可替寧及其糖苷排出體外。
[0003]1990年Peyton Jacob等的研究首次發現普通人體代謝生成3_輕基可替寧具有高度立體選擇性，在普通人尿樣中(3R，5S)-3_羥基可替寧(即反式-3-羥基可替寧)與(3S，5S)-3-羥基可替寧(即順式-3-羥基可替寧)的比例約為95:5，但并未進行大規模統計，也未對該結果進行深入分析。隨后煙草科技工作者和醫療衛生工作者進行的諸多有關3-羥基可替寧的研究主要集中于(3R，5S)-3-羥基可替寧，很少有人同時進行(3R, 5S)-3-羥基可替寧與(3S，5S)-3-羥基可替寧的研究。
[0004]由于人體本身就是一個動態的不對稱化學反應有機系統，所以卷煙煙氣中的尼古丁經過各種途徑代謝成可替寧，后者再進一步被代謝成(3R，5S)-3-羥基可替寧與(3S, 5S)-3-羥基可替寧的比例必然反映出人體相關器官的解毒能力以及健康狀況。深入研究證實，對于健康人群(3R，5S)-3-羥基可替寧與(3S，5S)-3-羥基可替寧的比例約為50:1?40:1，變化范圍很小，而吸煙的代謝異常患者尿樣中的這一比例出現明顯變化。如何實現同時對尿樣中兩種3-羥基可替寧含量的準確檢測并對兩者的比值進行深入分析，現有技術中尚未有很好的解決辦法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種通過高效液相色譜-質譜-質譜聯用技術檢測尿液中(3R，5S)-3-羥基可替寧與(3S，5S)-3-羥基可替寧含量的方法，為評估個體的代謝健康狀況以及煙氣中尼古丁的暴露程度提供一種科學的判定方法。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案予以實現。
[0007]除非另有說明，本發明中所采用的百分數均為重量百分數。
[0008]一種檢測尿液中3-羥基可替寧的方法，其特征在于:首先配制含有(3R，5S)-3_羥基可替寧、(3S，5S)-3-羥基可替寧和(3R，5S)-3-羥基可替寧_(13的混合標準溶液，進行HPLC-MS-MS分析并建立標準溶液工作曲線；然后在尿液樣品中加入(3R，5S)-3-羥基可替寧-d3溶液、pH6.0的磷酸納緩沖溶液和β -葡糖苷酸酶進行酶解，再加超純水稀釋，用水相濾膜過濾后上HPLC-MS-MS檢測。
[0009]一種檢測尿液中3-羥基可替寧的方法，具體包括以下步驟:
[0010](I)標準曲線建立:
[0011]以乙腈為溶劑，配制含有(3R，5S)-3-羥基可替寧、(3S，5S)-3-羥基可替寧和(3R, 5S)-3-羥基可替寧-d3的混合標準溶液，通過保留時間確定(3R，5S)-3-羥基可替寧和(3S, 5S)-3-羥基可替寧的色譜峰；以HPLC-MS-MS色譜圖中(3R，5S)-3-羥基可替寧的濃度與(3R，5S)-3-羥基可替寧-d3的濃度之比為橫坐標，以色譜圖中(3R，5S)-3-羥基可替寧的定量離子對峰面積與(3R，5S)-3-羥基可替寧-d3的定量離子對峰面積之比為縱坐標，建立(3R，5S)-3-羥基可替寧的標準溶液工作曲線；按同樣的方法建立(3S，5S)-3-羥基可替寧的標準溶液工作曲線；
[0012](2)尿樣處理:準確移取尿樣于試管中，加入(3R, 5S)-3-羥基可替寧_d3溶液，再加入磷酸納緩沖溶液和β_葡糖苷酸酶，充分混勻后置于恒溫振蕩器中或置于微波輔助萃取儀中，37°C避光恒溫酶解；向酶解后的尿樣中加入超純水稀釋，用0.2μπι水相濾膜過濾，待檢測；
[0013](3) HPLC-MS-MS 檢測條件:
[0014]液相條件:用C18色譜柱和甲酸水溶液-甲酸乙腈溶液對樣品進行分離；
[0015]質譜條件:用正離子模式(ESI+)進行多反應檢測(MRM)，分析物特征離子對如表I ;
[0016]表1分析物特征離子對
[0017]
【權利要求】
1.一種檢測尿液中3-羥基可替寧的方法，其特征在于:首先配制含有(3R，5S)-3-羥基可替寧、(3S，5S)-3-羥基可替寧和(3R，5S)-3-羥基可替寧_(13的混合標準溶液，進行HPLC-MS-MS分析并建立標準溶液工作曲線；然后在尿液樣品中加入(3R，5S)-3-羥基可替寧-d3溶液、pH6.0的磷酸納緩沖溶液和β -葡糖苷酸酶進行酶解，再加超純水稀釋，用水相濾膜過濾后上HPLC-MS-MS檢測。
2.根據權利要求1所述的檢測尿液中3-羥基可替寧的方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)標準曲線建立: 以乙腈為溶劑，配制含有(3R，5S)-3-羥基可替寧、(3S，5S)-3-羥基可替寧和(3R, 5S)-3-羥基可替寧-d3的混合標準溶液，通過保留時間確定(3R，5S)-3-羥基可替寧和(3S, 5S)-3-羥基可替寧的色譜峰；以HPLC-MS-MS色譜圖中(3R，5S)-3-羥基可替寧的濃度與(3R，5S)-3-羥基可替寧-d3的濃度之比為橫坐標，以色譜圖中(3R，5S)-3-羥基可替寧的定量離子對峰面積與(3R，5S)-3-羥基可替寧-d3的定量離子對峰面積之比為縱坐標，建立(3R，5S)-3-羥基可替寧的標準溶液工作曲線；按同樣的方法建立(3S，5S)-3-羥基可替寧的標準溶液工作曲線； (2)尿樣處理:準確移取尿樣于試管中，加入(3R,5S) -3-羥基可替寧_d3溶液，再加入磷酸納緩沖溶液和β -葡糖苷酸酶，充分混勻后置于恒溫振蕩器中或置于微波輔助萃取儀中，37°C避光恒溫酶解；向酶解后的尿樣中加入超純水稀釋，用0.2 μ m水相濾膜過濾，待檢測； (3)HPLC-MS-MS 檢測條件: 液相條件:用C18色譜柱和甲酸水溶液-甲酸乙腈溶液對樣品進行分離； 質譜條件:用正離子模式進行多反應檢測，分析物特征離子對如表1 ;` 表1分析物特征離子對
ψΨ? I定量離子對(m/ζ)I輔助定性離子對(m/z)(3R, 5S) -3-羥基可替寧192.2193 — 80193 — 134(3S, 5S)-3-羥基可替寧192.2193 — 80193 — 134(3R, 5S) -3- 羥基可替寧 -(13195.2196 — 80196 — 134 (4)實際檢測:使用優化后的液相色譜分離條件，對處理好的尿液樣品溶液進行HPLC-MS-MS檢測，使用標準溶液工作曲線計算待測尿液樣品溶液中的(3R，5S)_3_羥基可替寧與(3S，5S)-3-羥基可替寧，進而換算得到原始尿液樣品中的(3R，5S)-3-羥基可替寧與(3S，5S)-3-羥基可替寧含量，再計算得到該尿樣中(3R，5S)-3-羥基可替寧與(3S, 5S) -3-羥基可替寧的比值。
【文檔編號】G01N30/02GK103776928SQ201410014213
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】者為, 王文元, 段焰青, 馮斌, 夏建軍, 陳興, 蔣舉興, 黨立志 申請人:紅云紅河煙草(集團)有限責任公司