納米氧化銅模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法
【專利摘要】本發明公開一種納米氧化銅模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，所述的納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征首先是將葡萄糖，葡萄糖氧化酶和磷酸鹽緩沖液三者混合溫浴，然后向其中加入磷酸鹽緩沖液，對苯二甲酸和納米氧化銅繼續溫浴。上述混合液的反應產物的熒光激發波長和發射波長分別為315nm和421nm。葡萄糖含量測定的線性范圍為3～120μmol/L，檢測限為1.94μmol/L。該方法可用于血糖濃度的測定。
【專利說明】納米氧化銅模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米氧化銅作為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，屬于分析化學和納米【技術領域】。
【背景技術】
[0002]目前，臨床測定血糖的方法有鄰甲苯胺法和酶法。鄰甲苯胺法操作簡單，成本低，但特異性較差，并且鄰甲苯胺試劑不穩定，毒性大。酶法是利用酶的高選擇性催化進行分析的方法。根據酶種類的不同，酶法可分成己糖激酶法、葡萄糖脫氫酶法和葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法。商品化的血糖儀中多為一步反應完成，但選擇性較差，受麥芽糖、木糖、半乳糖等物質干擾嚴重，常導致血糖測定值假性升高；葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法操作簡便，試劑來源廣且價格便宜，是我國衛生部推薦的血糖測定方法。
[0003]熒光，是指一種光致發光的冷發光現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光(通常是紫外線或X射線)照射，吸收光能后進入激發態，并且立即退激發并發出比入射光的波長長的出射光；而且一旦停止入射光，發光現象也隨之立即消失。具有這種性質的出射光就被稱之為熒光。近年來由于熒光分析法具有靈敏度高，線性范圍寬，分析成本低，設備操作簡單以及提供信息量大等優點，已經在分析化學、環境科學、臨床醫學等領域吸引了人們的廣泛關注。
[0004]本發明基于納米氧化銅良好的模擬過氧化物酶性能，結合葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖產生過氧化氫的反應，提供一種納米氧化銅催化過氧化氫氧化對苯二甲酸產生熒光信號測定葡萄糖的新方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是基于納米氧化銅良好的模擬過氧化物酶性能，結合葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖產生過氧化氫的過程，提供一種納米氧化銅催化過氧化氫氧化對苯二甲酸產生熒光信號測定葡萄糖的新方法。
[0006]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:所述一種納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是首先將葡萄糖、葡萄糖氧化酶和磷酸鹽緩沖液三者混合溫浴進行葡萄氧化酶酶促反應，然后向其中加入磷酸鹽緩沖液，對苯二甲酸和納米氧化銅繼續溫浴進行熒光反應，用熒光分光光度計測定上述混合液反應產物的熒光強度。
[0007]所述熒光反應產物的最大激發波長和發射波長分別為315 nm和421 nm。
[0008]所述的葡萄糖氧化酶酶促反應體系pH值優選為7.0,葡萄糖氧化酶濃度優選為15U/mL0
[0009]所述的葡萄糖氧化酶酶促反應溫度優選為37 V，反應時間優選為20分鐘。
[0010]所述的熒光反應體系的pH值優選為7.0，納米氧化銅濃度優選為0.4 mg/L，對苯二甲酸濃度優選為3.0 mmol/Lo[0011]所述的熒光反應溫度優選為45 °C，反應時間優選為120分鐘。
[0012]本發明所述的利用納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是在EP管中分別加入62.5 μ?濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液和0.5 mL不同濃度的葡萄糖溶液而形成不同葡萄糖濃度的混合液，將上述不同葡萄糖濃度的混合液分別置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中3.525mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 PL濃度為40 mg/L的納米氧化銅，45°C溫浴，120分鐘后分別測定其在421 nm處的熒光強度，激發波長為315 nm,以熒光強度對葡萄糖濃度作圖得到標準曲線以用于測定葡萄糖。
[0013]所述的納米氧化銅由如下步驟制得:1)取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2)快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml,加完后繼續攪拌5分鐘，得到褐色氧化銅沉淀；3)將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇 洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。
[0014]本發明所述的一種利用納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定血清葡萄糖含量的熒光分析方法，其特征是它由以下步驟組成:(I)在EP管中分別加入稀釋后的血清、葡萄糖氧化酶和磷酸鹽緩沖液混合溫浴；(2)向上述EP管中加入磷酸鹽緩沖液，對苯二甲酸和納米氧化銅繼續溫浴；(3)將反應產物置于熒光分光光度計中檢測熒光強度，根據葡萄糖標準曲線測定血糖濃度。
[0015]本發明所述的利用納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定血清葡萄糖的熒光分析方法，其特征是在EP管中分別加入62.5 μ?濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液和0.5 mL稀釋40倍的血清而形成混合液，將上述混合液置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中3.525 mL濃度為200 mmol/L、pH 7.0的的磷酸鹽緩沖液，0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 μ?濃度為40 mg/L的納米氧化銅，45°C溫浴，120分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度，激發波長為315 nm，所述的納米氧化銅由如下步驟制得:1)取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2)快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10ml,加完后繼續攪拌5分鐘，得到褐色氧化銅沉淀；3)將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。
[0016]本發明的技術方案具體步驟如下:
(一)納米氧化銅的制備:
取醋酸銅溶液和冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰，快速加入氫氧化鈉溶液，加完后，繼續攪拌后，得到黑色氧化銅。將反應得到的黑色氧化銅立即離心，用無水乙醇洗滌，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。將納米氧化銅粉體分散于二次蒸餾水中得到棕色納米氧化銅膠體溶液。
[0017]納米氧化銅具體制備步驟如下:
(1)取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；
(2)快速加入0.04g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml,加完后繼續攪拌5分鐘，得到褐色氧化銅沉淀；(3)將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得直徑為6nm的納米氧化銅粉體。
[0018](二)葡萄糖的測定
在EP管中分別加入葡萄糖氧化酶、磷酸鹽緩沖溶液和不同濃度的葡萄糖溶液，將混合液放入37 °C恒溫水浴鍋中靜置。20分鐘后向其中加入磷酸鹽緩沖液，對苯二甲酸和納米氧化銅繼續溫浴，水浴溫度為45°C。120分鐘后測定其熒光強度。以熒光強度對葡萄糖濃度作圖并得到標準曲線。
[0019](三)血糖的測定
將葡萄糖替換為稀釋后的血清樣品重復步驟二，將所得熒光強度代入標準曲線即可進行血糖的測定。
[0020]本發明的優點:
本發明利用納米氧化銅的模擬過氧化物酶特性，與葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的反應結合，成功構建了一種檢測葡萄糖的熒光分析方法。該技術測定葡萄糖的線性范圍為3~120Mmol/L，其檢測限為1.94 Mmol/L。本發明具有靈敏度高，樣品需求量少，重現性好，成本低等優點。血清葡萄糖樣品的成功測定展現出該方法在臨床檢測，食品檢測以及環境監測等實際應用中具有較好的潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為pH值對熒光強度的影響圖。
[0022]圖2為反應溫度對熒光強度的影響圖。
[0023]圖3為納米氧化銅濃度對熒光強度的影響圖。
[0024]圖4為對苯二甲酸濃度對熒光強度的影響圖。
[0025]圖5為葡萄糖氧化酶酶促反應時間對熒光強度的影響圖。
[0026]圖6為突光反應時間對突光強度的影響圖。
[0027]圖7為葡萄糖的標準曲線圖。
[0028]圖8為乳糖，麥芽糖，果糖和葡萄糖的熒光強度對比圖。
【具體實施方式】
[0029]實例1:
納米氧化銅具體制備步驟如下:(I)取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；(2)快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml,加完后繼續攪拌5分鐘，得到褐色氧化銅沉淀；(3)將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得直徑為6 nm的納米氧化銅粉體。
[0030]實例2:
將0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為I mol/L的過氧化氫和50 41^濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅加入到3.65 mL濃度為200 mmol/L不同pH的磷酸鹽緩沖液(pH 3~10)中，混合搖勻后置于45 °C溫浴，20分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。如圖1所示，熒光強度在pH為7.0時達到最大值。
[0031]實例3:將0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為I mol/L的過氧化氫和50 μ?濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅加入到3.65 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，混合搖勻后置于不同溫度(20~55 °C)溫浴，20分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。如圖2所示，熒光強度在45 1:時達到最大值。
[0032]實例4:
將0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為I mol/L的過氧化氫和50ML不同濃度的實例I制備的納米氧化銅(O~80 mg/L)加入到3.65 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，混合搖勻后置于45 °C溫浴，20分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。如圖3所示，熒光強度隨混合液中納米氧化銅濃度增大而增大并在濃度為0.4^0.8 mg/L時達到最大。
[0033]實例5:
將0.8 mL不同濃度的對苯二甲酸(O~22.5 mmol/L), 0.5 mL濃度為I mol/L的過氧化氫和50 PL濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅加入到3.65 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，混合搖勻后置于45 °C溫浴，20分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。如圖4所示，熒光強度隨混合液中對苯二甲酸濃度增大而增大，在終濃度為3.0 mmol/L時,熒光強度達到穩定值。
[0034]實例6:
在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和0.5 mL濃度為4 mmol/L的葡萄糖溶液而形成混合液，將上述混合液置于37 °C溫浴，不同時間(0-100分鐘)后向其中加入3.525 mL濃度為200mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 μ?濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅，45°C溫浴，20分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。如圖5所示，熒光強度在前20分鐘增長迅速，20到70分鐘時增長緩慢， 在反應70分鐘后信號減小。
[0035]實例7:
在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和0.5 mL濃度為4 mmol/L的葡萄糖溶液而形成混合液，將上述混合液置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中加入3.525 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 PL濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅，45°C溫浴，不同時間(20-140分鐘)后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。如圖6所示，熒光強度隨熒光反應時間的延長而增大，并在120分鐘后達到穩定值。
[0036]實例8:
在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和0.5 mL不同濃度的葡萄糖溶液而形成不同的葡萄糖溶液濃度的混合液，將上述不同的葡萄糖溶液濃度的混合液分別置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中加入3.525 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75mmol/L的對苯二甲酸和50 μ?濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅，45°C溫浴，120分鐘后分別測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。以熒光強度對葡萄糖濃度作圖得到標準曲線。如圖7所示，熒光強度與葡萄糖濃度在:T120 Mmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為1.94 Mmol/L。
[0037]實例9: 在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和0.5 mL濃度為I mol/L的葡萄糖溶液而形成混合液，將上述混合液置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中加入3.525 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 PL濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅，45°C溫浴，120分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。重復6次，檢測結果的相對標準偏差為1.54%。
[0038]實例10:
在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和0.5 mL不同物質(40 mmol/L的乳糖或10 mmol/L麥芽糖或10 mmol/L果糖)代替葡萄糖溶液而形成的不同物質混合液，將上述所形成的不同物質混合液分別置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中3.525 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 PL濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅，45°C溫浴，120分鐘后分別測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315 nm)。如圖8所示,與I mmol/L的葡萄糖產生的信號相比,40 mmol/L的乳糖或10mmol/L麥芽糖或10 mmol/L果糖產生的信號均可忽略不計。
[0039]實例11:
在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和0.5 mL稀釋40倍的血清而形成混合液，將上述混合液置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中加入3.525 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 PL濃度為40 mg/L的實例I制備的納米氧化銅，45°C溫浴，120分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度(激發波長為315nm)。經實施例8所得葡萄糖標準曲線計算得出血清樣品中葡萄糖含量，此數值與葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶-TMB比色法得到的數據一致。樣品的測定回收率為90.7%~105.8%，相對標準偏差為0.5^3.6%，由此可見本方法可靠適用。
[0040]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是首先將葡萄糖、葡萄糖氧化酶和磷酸鹽緩沖液三者混合溫浴進行葡萄氧化酶酶促反應，然后向其中加入磷酸鹽緩沖液，對苯二甲酸和納米氧化銅繼續溫浴進行熒光反應，用熒光分光光度計測定上述混合液反應產物的熒光強度。
2.根據權利要求1所述的納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是熒光反應產物的最大激發波長和發射波長分別為315 nm和421 nm。
3.根據權利要求1所述的納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是葡萄糖氧化酶酶促反應體系PH值為7.0，葡萄糖氧化酶濃度為15 U/mL。
4.根據權利要求1所述的納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是葡萄糖氧化酶酶促反應溫度為37 °C，反應時間為20分鐘。
5.根據權利要求1所述的納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是熒光反應體系的PH值為7.0，納米氧化銅濃度為0.4 mg/L，對苯二甲酸濃度為3.0 mmol /I,η
6.根據權利要求1所述的納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是熒光反應溫度為45 °C，反應時間為120分鐘。
7.一種利用納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定葡萄糖的熒光分析方法，其特征是在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液和0.5 mL不同濃度的葡萄糖溶液而形成不同葡萄糖濃度的混合液，將上述不同葡萄糖濃度的混合液分別置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中3.525 mL濃度為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50μ?濃度為40 mg/L的納米氧化`銅，45°C溫浴，120分鐘后分別測定其在421 nm處的熒光強度，激發波長為315 nm,以熒光強度對葡萄糖濃度作圖得到標準曲線以用于測定葡萄糖。
8.根據權利要求1或2或3或4或5或6或7所述的熒光分析方法，其特征是所述的納米氧化銅由如下步驟制得:1)取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2)快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10ml,加完后繼續攪拌5分鐘，得到褐色氧化銅沉淀；3)將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。
9.一種利用納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定血清葡萄糖含量的熒光分析方法，其特征是它由以下步驟組成:(I)在EP管中分別加入稀釋后的血清、葡萄糖氧化酶和磷酸鹽緩沖液混合溫浴；(2)向上述EP管中加入磷酸鹽緩沖液，對苯二甲酸和納米氧化銅繼續溫浴；(3)將反應產物置于熒光分光光度計中檢測熒光強度，根據葡萄糖標準曲線測定血糖濃度。
10.根據權利要求9所述的利用納米氧化銅為模擬過氧化物酶測定血清葡萄糖的熒光分析方法，其特征是在EP管中分別加入62.5 PL濃度為150 U/mL的葡萄糖氧化酶、62.5 μ?濃度為200 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液和0.5 mL稀釋40倍的血清而形成混合液，將上述混合液置于37 °C溫浴，20分鐘后向其中3.525 mL濃度為200 mmol/L、pH 7.0的的磷酸鹽緩沖液，0.8 mL濃度為18.75 mmol/L的對苯二甲酸和50 μ?濃度為40 mg/L的納米氧化銅，45°C溫浴，120分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度，激發波長為315 nm，所述的納米氧化銅由如下步驟制得:1)取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2)快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液.10 ml,加完后繼續攪拌5分鐘，得到褐色氧化銅沉淀；3)將反應得到的黑色氧化銅沉淀離心， 用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。
【文檔編號】G01N21/64GK103728287SQ201410012042
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月10日 優先權日:2014年1月10日
【發明者】陳偉, 胡愛玲, 何少斌, 鄧豪華, 李光文 申請人:福建醫科大學