基于納米多孔金片電極的電化學免疫傳感器對巰基乙酸的檢測的制作方法
【專利摘要】本發明利用電化學生物傳感器的高靈敏度和生物放大技術構建了一種基于納米多孔金片電極以及HRP標記CRP抗體修飾的納米金粒子復合物的高靈敏電化學免疫傳感器對微量有害物質進行檢測。首先制備納米多孔金片電極，然后在電極表面層層依次修飾目標檢測物（巰基乙酸）、抗體、抗原-金納米粒子復合物，最后進行電化學檢測。金納米粒子作為支撐材料大大增加了固定的標記抗體的數量，提高了分析檢測的靈敏度。
【專利說明】基于納米多孔金片電極的電化學免疫傳感器對巰基乙酸的檢測
【技術領域】
[0001]電化學生物傳感器對于物質的檢測具有較高的靈敏度，利用電化學檢測技術與生物檢測放大技術相結合制備高靈敏度傳感器，實現對目標檢測的高靈敏度檢測。
【背景技術】
[0002]電極是電化學生物傳感器的核心部件之一，其發展對各種電化學生物傳感器的發展起到了關鍵的作用。自1975年化學修飾電極問世以來，已成為整個化學界矚目的非常活躍的電化學研究新領域，推動了電化學及電分析化學研究的發展，是近代電分析化學領域中一個重要的研究方向。電極材料是電化學研究的極為重要的因素，電極的性能，尤其是電極的表面性能關系到電化學的效率。1973年Lane和Hubbard開辟了改變電極表面結構以控制電化學反應過程的新概念，指示了化學修飾電極的萌芽。1975年,Miller和Murray分別報道了電極表面進行化學修飾的研究，標志著化學修飾電極正式問世。化學修飾電極是利用化學和物理的方法，通過吸附、共價鍵合、聚合等手段有目的的將具有特定功能性(如催化、配合、電色、光電)分子、離子、聚合物固定在電極表面，從而改變或改善了電極原有的性質。化學修飾電極實現了電極的功能設計，在電極上可進行某些預定的、有選擇性的反應，并加快了電子轉移速度。
[0003]納米多孔材料是兼具功能和結構雙重屬性的一類特殊工程材料。它保留了金屬的可焊性、導電性、延展性以及結構強度高、耐高溫等特性，而且具備穩定的孔隙結構和由此帶來的流體滲透率高、比表面積大等獨特性能。金屬納米多孔材料由于其表面和結構特性，可廣泛用于離子交換、催化、分離、生物分子的隔離和凈化、傳感器等領域。多孔金這種納米材料不僅具有其它多孔金屬所具有的特性:如導電性、大的比表面積，除此外它還保留了金特有的性質，應用極其廣泛。
[0004]生物傳感器是一種將酶、抗體等對生物體功能有響應的最小單體引入電極，以此來對目標檢測物進行分析檢測的檢測器，具有專一、快速、靈敏、準確等優點，已廣泛應用于臨床檢測、環境檢測和生化分析等領域。其中電流型酶傳感器研究最多的一種類型。Arnold等將谷氨酸氧化酶固載于Nafion修飾的鉬電極上，制成了對谷氨酸敏感的生物傳感器，檢測限為0.3 μ mol/L,線性范圍高達800 μ mol/L。選擇性明顯提高，有效消除了來自抗壞血酸、尿酸和乙酰氨基酚等雜質的干擾。
【發明內容】
[0005]本發明在結合了前人工作的基礎上提出了一種新穎的電化學檢測特定有機污染物的方法，構建了一種全新的依據夾心式免疫反應結合納米多孔金片修飾的電極。利用目標檢測物的連接作用和辣根過氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化鄰苯二胺伏安酶聯免疫體系，來實現對目標檢測物的定性定量監測分析。此種檢測方法對于目標檢測物(巰基乙酸)的檢測范圍在0.0lngmL-1到0.SngmI/1,檢測限更是低至0.00685ng/mL。這相對于陳小軍等人的工作(Anal.Chem.，2008, 80(6):2133-2140)來講，其檢測靈敏度至少提高了十倍以上。
[0006]本發明所提供的方法包括以下步驟:
[0007]( I)制備還原性金納米粒子。
[0008]所述的方法，其所述的還原劑為檸檬酸三納。
[0009](2)將所制備的金納米粒子溶液調節至堿性；直接將經HRP標記CRP抗體溶液加入至金納米粒子溶液中，反應結束后將產品離心分離并用PBS緩沖溶液清洗。
[0010]所述的方法，其所述的將納米粒子調節為堿性的調節劑為NaOH溶液，最終溶液pH=9.00
[0011](3)將白金片在硝酸溶液中浸泡，然后用三次水除去可能會影響檢測結果的雜質離子，再用拋光粉拋光玻碳電極后將其用蒸餾水洗凈，最后通過物理吸附作用且經紅外燈照射后，納米多孔金片就被修飾到玻碳電極上。
[0012]所述的方法，其所述的白金片為金銀質量比為1:1的合金，厚度IOOnm左右。
[0013](4)將制備的電極浸入至巰基乙酸溶液當中，通過化學反應巰基乙酸會固載至電極表面，反應結束后清洗電極；在電極上滴加CRP抗體溶液，反應結束后清洗電極；用BSA溶液封閉電極，反應結束清洗電極；將電極浸入至CRP溶液中，反應結束后清洗電極；將步驟(a)中產物滴加在電極表面，反應結束后在電極表面得到雙抗體夾心免疫復合物。
[0014]所述的方法，其所述的接在電極表面的目標檢測物具有同時具有巰基的羧酸或者具有巰基的酯類化合物，本方法采用巰基乙酸為例。
[0015]所述的方法，其所述的巰基乙酸中的活性基團巰基的作用與電極表面作用形成化學鍵，巰基乙酸固載至電極表面之后會影響電流值，據此實現對目標檢測物的檢測。
[0016]所述的方法，其所述的CRP抗體、CRP、HRP標記CRP抗體修飾納米金粒子對電極層層修飾，形成的復合結構會影響電流值，據此實現對目標檢測物的檢測。
[0017]所述的方法，其所述的結合在CRP抗體的HRP催化H2O2氧化0PD，其氧化產物在BR緩沖溶液中還原的方式得到電化學峰電流與CRP的濃度成線性關系，而目標檢測物與CRP成等量關系，據此實現對目標檢測物的檢測。
[0018](5)將經修飾之后的電極浸入至OPD和H2O2的混合溶液當中，反應結束后在BR緩沖溶液用電化學工作站測定DPV曲線。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]附圖1為發明設計過程原理圖。1、制備納米多孔金電極；2、巰基乙酸固定在電極表面；3、抗體與巰基乙酸結合固定在電極表面；4、利用封板劑封閉金電極表面未參加反應的活性基團；5、抗原與抗體結合固定在電極表面；6、標記的過的結合在金納米粒子上的抗體與抗原結合固定在電極表面；7、電化學檢測。
[0020]附圖2為電極不同修飾階段峰電流的變化。a、空白電極；b、電極-巰基乙酸；C、電極-巰基乙酸-抗體；d、電極-巰基乙酸-抗體-抗原；e、電極-巰基乙酸-抗體-抗原-抗體。
[0021]附圖3為不同濃度檢測物最終的檢測結果。
[0022]附圖4為依據檢測結果得到的線性工作曲線。線性回歸方程為Δ ip=0.04064+5.37562CT (ng/mL) (R=0.99976)，使用 3 σ 法得到的檢測限為 0.00685ng/mL
【具體實施方式】
[0023]以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。
[0024]實施例1
[0025]納米多孔金片電極電化學免疫傳感器檢測巰基乙酸(見圖1)
[0026]一、金納米粒子-抗體(標記)復合物的制備。
[0027](I)金納米粒子的制備
[0028]納米金粒子的合成是通過檸檬酸三鈉還原四氯金酸制備而成。具體制備方法如下:首先配制0.01%的三水合氯化金溶液和1%的檸檬酸三鈉溶液，并用0.22 μ m的多孔濾膜分別過濾除去雜質。取過濾后的5mL0.2%撤11(:14至2501^容量瓶，加二次水稀釋至IOOmL,攪拌加熱至沸，然后快速加入2.5mLl%檸檬酸三鈉。反應十五分鐘后停止加熱，繼續攪拌溶液冷卻至室溫。將制備好的金膠溶液保存于4°C備用。
[0029](2)金納米粒子-抗體(標記)復合物的制備。
[0030]首先，用0.1MNaOH溶液將金膠溶液的pH調節至9.0左右，然后向500 μ LpH9.0的金膠溶液中直接加入20 μ LHRP標記CRP抗體，室溫攪拌反應15分鐘。反應完畢后，將溶液在10000轉每分的轉速下離 心20分鐘并使用PBS緩沖溶液(ρΗ7.4)離心清洗兩次。清洗后得到的納米金粒子CRP抗體結合物分散到100 μ LPBS緩沖溶液中(ρΗ7.4)，儲存在4°C備用。
[0031]二、納米多孔金片電極的制備
[0032]首先，將9-carat 白金片(Au/Ag, 5050:, wt%,厚 IOOnm)在 I:1 的硝酸中浸泡 Ih,在三次水中浸泡掉可能干擾電化學分析的N03_和Ag+。玻碳電極依次使用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的a -Al2O3拋光粉拋光，依次用乙醇和二次蒸餾水超聲清洗，再用蒸餾水沖洗。最后通過物理吸附作用將納米多孔金片結合到玻碳電極表面，紅外燈照射Ih后，納米多孔金片就被修飾到玻碳電極上。
[0033]三、電極的層層修飾
[0034]首先，使用二次水和PBS仔細清洗納米多孔金片電極后，將電極浸入到4mM巰基乙酸溶液中反應2小時，反應完畢用丙酮完全沖洗掉物理吸附的巰基乙酸。第二步，再在電極表面滴加10 μ L50 μ g/mL的CRP抗體，室溫反應過夜，反應完畢用PBS緩沖溶液仔細洗掉未結合的抗體。第三步，將上步電極浸泡在500 μ L3%BSA溶液中反應3小時封閉電極，反應結束后用PBS緩沖溶液清洗電極。第四步，將上步電極浸泡在500 μ L不同濃度的CRP溶液中37 °C恒溫孵育60分鐘，反應結束后用PBS緩沖溶液清洗電極。最后，在電極表面滴加HRP標記的CRP抗體反應60分鐘(對照)或者HRP標記CRP抗體修飾的納米金粒子反應90分鐘，雙抗體夾心式免疫復合物形成。
[0035]四、電化學檢測
[0036]在IOmL的比色管中依次加入lmL5.0 X KT2MOPD溶液，2mL4.0 X KT3MH2O2溶液，2mL0.1MHAc-NaAc緩沖溶液(pH4.8 )，4mL甲醇，用二次水稀釋至刻度混勻。將修飾了雙抗體夾心式免疫復合物的電極浸入到300 μ L上述底液，在37°C恒溫催化OPD和H2O2反應。反應I小時后，在反應池中加入ImL0.2MBR緩沖溶液(pH7.0)。通氮除氧后，在-1.2到0.2V的電位范圍內測定DPV曲線，振幅為25mV，電位增量為12mV，脈沖頻率為5Hz。
【權利要求】
1.基于納米多孔金片電極的電化學免疫傳感器對巰基乙酸的檢測的方法。步驟包括: (a)HRP標記CRP抗體修飾納米金粒子的制備:首先制備還原性金納米粒子，然后將所制備的金納米粒子溶液調節至堿性，直接將經HRP標記CRP抗體溶液加入至金納米粒子溶液中，反應結束后將產品離心分離并用PBS緩沖溶液清洗； (b)制備納米多孔金片電極:將白金片在硝酸溶液中浸泡，然后用三次水除去可能會影響檢測結果的雜質離子，使用拋光粉拋光玻碳電極后將其用蒸餾水洗凈，最后通過物理吸附作用且經紅外燈照射后，納米多孔金片就被修飾到玻碳電極上； (C)將步驟(b)中制備的電極浸入至巰基乙酸溶液當中，通過化學反應巰基乙酸會固載至電極表面，反應結束后清洗電極，在電極上滴加CRP抗體溶液，反應結束后清洗電極，用BSA溶液封閉電極，反應結束清洗電極，將電極浸入至CRP溶液中，反應結束后清洗電極，將步驟(a)中產物滴加在電極表面，反應結束后在電極表面得到雙抗體夾心免疫復合物； Cd)將步驟(c)中電極浸入至OPD和H2O2的混合溶液當中，反應結束后在BR緩沖溶液用電化學工作站測定DPV曲線。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(a)中還原性金納米粒子的制備還原劑可采用檸檬酸三鈉等。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(a)中金納米粒子溶液為堿性，pH=9.0，調節劑可采用NaOH溶液。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(b)中所采用的白金片為金銀質量比為1:1的合金，厚度IOOnm左右。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(c)中所接在電極表面的目標檢測物具有同時具有巰基的羧酸或者具有巰基的酯類化合物，本方法采用巰基乙酸為例。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:利用步驟(c)中巰基乙酸中的活性基團巰基的作用與電極表面作用形成化學鍵，巰基乙酸固載至電極表面之后會影響電流值，據此實現對目標檢測物的檢測。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:利用步驟(c)中利用CRP抗體、CRP、HRP標記CRP抗體修飾納米金粒子對電極層層修飾,形成的復合結構會影響電流值,據此實現對目標檢測物的檢測。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:利用步驟(c)中利用結合在CRP抗體的HRP催化H2O2氧化0PD，其氧化產物在BR緩沖溶液中還原的方式得到電化學峰電流與CRP的濃度成線性關系，而目標檢測物與CRP成等量關系，據此實現對目標檢測物的檢測。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:工作電極為納米多孔金片電極。
【文檔編號】G01N33/551GK103698509SQ201410008134
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月8日 優先權日:2014年1月8日
【發明者】丁彩鳳, 張偉, 宋維嶺, 張書圣 申請人:青島科技大學