一種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法，利用該方法能快速實現對腫瘤微環境中多組分原位成像、各組分的定量計算及腫瘤轉移單元的定量計數；本發明方法克服了傳統和現代方法中存在的不足，檢測速度快，穩定性好，不需要人工計算，避免個體判斷誤差；可有效方便地對多組分構成的轉移單元進行快速定量計算，有利于推動腫瘤個體化治療的發展。
【專利說明】一種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于組織免疫熒光及圖像空間關系解析領域，具體涉及一種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法，適用于人腫瘤組織微環境中由腫瘤細胞、巨噬細胞和腫瘤新生血管(血管內皮細胞)三種組分構成的腫瘤轉移單元的計數，還涉及檢測其他重要微環境組分共同構成的單元的定量計算。
【背景技術】
[0002]癌癥是全球首位致死病因，在過去20年中，其發生率和死亡率居高不下，嚴重威脅我國居民健康(Jemal A, Bray F，Center MM, et al.Global cancer statistics.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2011，61:69-90.)。癌癥的發生及發展是一個多因素、多階段、逐步發展的過程，其所處的組織環境對其進展影響巨大(Polyak K, HavivI，Campbell IG.Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.Trendsin Genetics.2009, 25:30-38.)。腫瘤微環境是由多種成分構成的，因缺乏有效的技術，當前對腫瘤微環境的研究仍然以組織原位單一成分或離體蛋白質芯片研究為主，主要包括間質支架的主要成分膠原，腫瘤免疫調節的關鍵成分巨噬細胞以及腫瘤新生血管等，無法原位闡明上述多種成分對腫瘤侵襲轉移及患者預后的影響。另外，研究顯示腫瘤侵襲轉移的過程中需要依賴巨噬細胞和腫瘤新生血管的共同參與，兩者缺一不可。因此，由腫瘤細胞、巨噬細胞和腫瘤新生血管共同構成的腫瘤轉移單元是腫瘤侵襲轉移的必備條件。并且，單一的巨噬細胞及腫瘤新生血管定量分析顯示其與腫瘤分級并無統計學關聯，而腫瘤轉移單元每增加10個,遠處轉移的風險便會提高2倍(Robinson BD, Sica GL, Liu YF, etal.Tumor Microenvironment of Metastasis in Human Breast Carcinoma:A PotentialPrognostic Marker Linked to Hematogenous Dissemination.Clinical CancerResearch.2009, 15:2433-2441.)。然而，目前并沒有可靠的方法學研究能預測腫瘤侵襲轉移的風險，因此腫瘤轉移單元的計數有可能成為良好的預測患者侵襲轉移風險的指標。
[0003]另外，目前有關腫瘤轉移單元的計算是采用免疫組織化學多色染色方法，不同顏色之間的分辨率低，誤差大，并且采用的是人工計數方法，個體差異大，尤其是在腫瘤轉移單元數量龐大時，人工計算幾乎不可能完成，這嚴重阻礙了其在醫學臨床應用中的發展。
[0004]近年來發展起來的量子點多色成像技術，以其具有以下優勢:1)連續而寬的激發光譜，物理尺寸和組份比例可調性；2)可同時進行多色標記，檢測靈敏度高；3)抗光漂白能力強；4)熒光強度高而穩定；5)生物相容性好，抗組織自發熒光干擾能力強；6)摩爾熒光量子產率高，突破了傳統熒光材料探針局限，已在腫瘤的分子成像中取得重要進展(ChenC，Peng J, Sun SR, et al.Tapping the potentials of quantum dots into clinicalapplication for personalized oncology:current status and future perspectives.Nanomedicine, 2012, 7 (3):411-428.),為進一步實現由腫瘤微環境中多組分構成的單元計算奠定基礎。
【發明內容】
[0005]針對現有技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法，方法易行，操作簡便。該方法不僅可對由腫瘤細胞、巨噬細胞以及腫瘤新生血管構成的腫瘤轉移單元進行快速計算，更重要地是其具有普適性，也能定量計算由其他與腫瘤轉移相關的重要成分構成的單元，為腫瘤侵襲轉移機制研究提供了很好的技術支持，有望預測患者預后及指導個體化治療。
[0006]為了實現上述目的，本發明要用以下技術措施:
[0007]—種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法，其步驟如下:
[0008]I)腫瘤組織量子點雙染，并進行光譜圖像的采集及信號分離；
[0009]2)以綠色細胞為中心，以N微米為半徑向周圍拓展，在該范圍內出現紅色信號，則計為1，否則為0，最終輸出此張圖片的腫瘤轉移單元數量，具體方法如下:
[0010]a)圖像預處理:提取腫瘤組織量子點雙染圖像RGB顏色通道中的綠色通道，通過3*3模板中值濾波平滑噪聲；采用閾值法將其轉換成二值化圖，通過形態學開重建操作消除突刺，切斷細小搭接部分以提高小區域輪廓光滑度。空洞填充，去除小面積雜質區域后所得圖像為綠色細胞初始分割圖；采用面積閾值M將綠色細胞初始分割圖像劃分為單個細胞圖像和粘連細胞圖像；
[0011]b)標記提取:提取粘連細胞圖像與原綠色通道圖像疊加，對圖像求反操作后擴展局部最小區域，通過形態學閉重建和空洞填充操作后將其作為細胞的內部標記，將粘連區域外作為綠色細胞信號外部標記；
[0012]所述的局部最小區域為亮度值相同且其周圍的亮度值都比它大的區域；
[0013]c)采用分水嶺算法對粘連細胞分離，得到綠色細胞信號分割圖，統計綠色細胞信號總數；
[0014]d)對每一個綠色細胞，提取與其邊界距離小于或等于N微米的擴展區域，如果該區域內有紅色信號點則該綠色細胞滿足條件，統計所有滿足條件細胞數；
[0015]其中:N=a+b+c;M=pi*b~2 ；
[0016]a為腫瘤細胞的平均半徑，b為綠色熒光細胞的平均半徑，c為紅色熒光細胞的平均半徑。
[0017]本發明所述的算法，如未特別說明，均為本領域技術人員公知常用算法。
[0018]本發明所述的腫瘤轉移單元是由腫瘤細胞及其他兩種細胞一起構成的一個整體，并且在空間分布上，必須滿足三者共同出現在一個以這三種細胞平均直徑之和為直徑的圓中。在實際工作中，并不局限于這些特定細胞，其他與腫瘤侵襲轉移相關的細胞與腫瘤細胞一起也可定義為一種新的腫瘤轉移單元，本發明的計數方法具備普適性。
[0019]本發明與現有技術相比具有以下優點和效果:
[0020]1、可在同一張腫瘤組織切片上實現原位實時多組分同時成像，并將腫瘤微環境的關鍵成分腫瘤細胞、巨噬細胞和腫瘤新生血管作為一個整體來分析，充分考慮了三種成分的空間分布特征；
[0021]2、利用計算機程序進行計算，檢測速度快，穩定性好，不需要人工計算，避免個體判斷誤差；[0022]3、操作步驟簡單；
[0023]4、普適性好；
[0024]5、本發明提供的一種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法可實現對腫瘤進展過程中由腫瘤微環境關鍵成分腫瘤細胞、巨噬細胞和腫瘤新生血管構成的腫瘤轉移單元快速準確計算，并可拓展用于由其他腫瘤微環境成分構成的單元計算，有利于推動腫瘤個體化治療的發展。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為本發明的技術流程圖。
[0026]①在安裝有多光譜分析儀的熒光顯微鏡下采集腫瘤組織量子點成像圖片；②利用光譜分析軟件對兩種信號進行分離；③計算腫瘤轉移單元的數量，輸出腫瘤轉移單元個數(每個框就代表1個轉移單元)。【放大倍數:200X (a，b，c).圖像由CRi Nuance多光譜細胞成像系統(Cambridge Research&Instrumentation, Inc., Woburn, MA, USA)米集和信號分離】圖2為3例胃癌患者的組織切片量子點成像和腫瘤轉移單元分析示意圖及輸出的結果。
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。
[0028]實施例1:
[0029]A.腫瘤組織石蠟切片:福爾馬林固定后石蠟包埋的腫瘤組織切片，厚度4 μ m，固定于經多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上；
[0030]B.腫瘤組織切片的準備:將組織切片置于烤箱60°C烘烤2小時，接著二甲苯脫蠟3次(不同的脫蠟缸)，每次5分鐘，脫蠟后將組織切片依次放入無水乙醇5分鐘、95%酒精2分鐘、90%酒精2分鐘和85%酒精2分鐘，流水沖洗3分鐘；
[0031]C.組織切片的抗原修復:用檸檬酸三鈉29.41g，雙蒸水1000ml配制檸檬酸三鈉緩沖液，檸檬酸10.5g，雙蒸水500ml配制檸檬酸緩沖液，分別取檸檬酸三鈉緩沖液20.25ml、檸檬酸緩沖液4.75ml加入225ml雙蒸水配制成檸檬酸抗原修復液(0.01M/L，pH6.0，250ml)ο將組織切片置入含上述抗原修復液的修復盒中進行微波修復，中高火修復5分鐘后轉至中火修復20分鐘，然后待玻片自然冷卻；
[0032]D.清洗組織切片:先用流水沖洗3分鐘，然后用三羥基氨基甲烷(Tris) 6.05g，氯化鈉38.0g，雙蒸水5000ml，配制0.01M/L、pH7.2-7.4的TBS作為洗滌液，洗滌3次，每次3分鐘；
[0033]E.封閉組織切片:將上述組織切片放入孵育盒中，用2%wt/vol牛血清白蛋白封閉(用上述TBS配置)30分鐘，37 0C ；
[0034]F.一抗孵育:甩掉上述封閉液后，滴加鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體(稀釋比:1/100)和山羊抗人⑶105多克隆抗體(腫瘤新生血管標志物，稀釋比:1/300)混合物(用上述封閉液稀釋)，濕盒孵育，4°C冰箱過夜；
[0035]G.沖洗組織切片，沖洗液為含0.5%vol/vol吐溫#20的TBS，TBS按上述步驟D的配方制備，洗滌3次，每次3分鐘；[0036]H.再次封閉組織切片，同步驟E ；
[0037]1.二抗孵育:甩掉上述封閉液后，滴加QDs525_F (ab) 2和QDs655_F (ab)2混合物(稀釋液同步驟F)，濕盒孵育，37°C，2h ；
[0038]J.沖洗切片；沖洗液與上述步驟G所用相同，TBS按上述步驟D的配方制備，洗滌3次，每次3分鐘；
[0039]K.封片觀察:用甘油90ml和TBSlOml配成90%緩沖甘油，緩沖甘油封片，用熒光顯微鏡觀察圖像。
[0040]實施例2:
[0041]圖像采集及腫瘤轉移單元的計數，具體如下:
[0042]I)CRi Nuance多光譜細胞成像系統(Cambridge Research&Instrumentation, Inc.，Woburn，MA，USA)，用紫外光激發，采集腫瘤組織量子點雙染圖像(圖1b);在腫瘤組織區域分離出綠色巨噬細胞信號和紅色腫瘤新生血管信號(圖1c)；
[0043]2)腫瘤轉移單元計數，以綠色信號為中心，以30微米為半徑向周圍拓展，在該范圍內出現紅色信號，則計為1，否則為0，最終輸出此張圖片的腫瘤轉移單元數量，具體如下:
[0044]a)圖像預處理:由于腫瘤組織量子點雙染圖像受噪聲影響存在大量的偽極小值點而容易導致分水嶺嚴重的過分割現象，在分割執行前對圖像執行降噪等預處理。提取腫瘤組織量子點雙染圖像RGB顏色通道中的綠色通道，通過3*3模板中值濾波平滑噪聲。采用自適應大津閾值法將其轉換成二值化圖，通過形態學開重建操作消除突刺，切斷細小搭接部分以提高小區域輪廓光滑度。空洞填充，去除小面積雜質區域后所得圖像為綠色巨噬細胞初始分割圖；由于綠色巨噬細胞存在部分粘連現象，采用面積閾值300 (巨噬細胞直徑大小一般為10-30微米，取中位數20計算面積pi*r~2)將綠色巨噬細胞信號初始分割圖劃分為單個細胞圖像和粘連細胞圖像；
[0045]b)標記提取:準確提取與綠色巨噬細胞信號區域密切相關的標記是控制分水嶺算法過分割的關鍵問題，由于綠色巨噬細胞信號內部強度均勻且亮度較周圍區域明顯，采用擴展局部最小區域提取內部標記。提取粘連細胞圖像與原綠色通道圖像疊加，對圖像求反操作后采用強度閾值30擴展局部最小區域(局部最小區域即亮度值相同且其周圍的亮度值都比它大)，通過形態學閉重建和空洞填充操作后將其作為細胞的內部標記(每一個內部標記對應著一個鋸齒細胞)，將粘連區域外作為綠色巨噬細胞信號外部標記；
[0046]c)采用分水嶺算法(一種基于拓撲理論的數學形態學的分割方法，其基本思想是把圖像看作是測地學上的拓撲地貌，圖像中每一點像素的灰度值表示該點的海拔高度，每一個局部極小值及其影響區域稱為集水盆，而集水盆的邊界則形成分水嶺。分水嶺的概念和形成可以通過模擬浸入過程來說明。在每一個局部極小值表面，刺穿一個小孔，然后把整個模型慢慢浸入水中，隨著浸入的加深，每一個局部極小值的影響域慢慢向外擴展，在兩個集水盆匯合處構筑大壩，即形成分水嶺)對粘連細胞分離。綜合后得到綠色細胞信號分割圖，統計綠色細胞信號總數；
[0047]d)對每一個綠色細胞，提取與其邊界距離小于或等于30微米的擴展區域，如果該區域內有紅色信號點則該綠色細胞滿足條件，統計所有滿足條件細胞數。
[0048]采用上述相同的計算方法，分別對5張按照上述方法采集的圖片進行腫瘤轉移單元的計算，進行疊加后即為該患者的腫瘤轉移單元總數。
[0049]本發明所述的腫瘤轉移單元是由胃癌細胞、巨噬細胞和腫瘤新生血管共同構成的，三種細胞的平均半徑均為10微米，并且在空間分布上，必須滿足上述計算條件。在實際工作中，并不局限于這些特定細胞，其他與腫瘤侵襲轉移相關的細胞與腫瘤細胞一起也可定義為一種新的單元，本發明的計數方法具備普適性。
[0050]實施例3:
[0051]腫瘤轉移單元計數的有效性:
[0052] 申請人:對30例胃癌患者的腫瘤轉移單元計數研究，高分化管狀腺癌10例，低分化管狀腺癌10例，印戒細胞癌10例,其臨床基本參數沒有差異,但是單個巨噬細胞、新生血管及腫瘤轉移單元計數在三組間均有統計學差異，證實腫瘤轉移單元計算及分析的有效性。
[0053]
表1.30例胃癌患者的臨床病理特征
【權利要求】
1.一種基于量子點光譜分析及圖像解析的腫瘤轉移單元計數方法，其步驟如下: 1)腫瘤組織量子點雙染，并進行光譜圖像的采集及信號分離； 2)以綠色細胞為中心，以N微米為半徑向周圍拓展，在該范圍內出現紅色信號，則計為1，否則為O，最終輸出此張圖片的腫瘤轉移單元數量，具體方法如下: a)圖像預處理:提取腫瘤組織量子點雙染圖像RGB顏色通道中的綠色通道，通過3*3模板中值濾波平滑噪聲；采用閾值法將其轉換成二值化圖，通過形態學開重建操作消除突刺，切斷細小搭接部分以提高小區域輪廓光滑度；空洞填充，去除小面積雜質區域后所得圖像為綠色細胞初始分割圖；采用面積閾值M將綠色細胞初始分割圖像劃分為單個細胞圖像和粘連細胞圖像； b)標記提取:提取粘連細胞圖像與原綠色通道圖像疊加，對圖像求反操作后擴展局部最小區域，通過形態學閉重建和空洞填充操作后將其作為細胞的內部標記，將粘連區域外作為綠色細胞信號外部標記； 所述的局部最小區域為亮度值相同且其周圍的亮度值都比它大的區域； c)采用分水嶺算法對粘連細胞分離，得到綠色細胞信號分割圖，統計綠色細胞信號總數； d)對每一個綠色細胞，提取與其邊界距離小于或等于N微米的擴展區域，如果該區域內有紅色信號點則該綠色細胞滿足條件，統計所有滿足條件細胞數；
其中:N=a+b+c ;M=pi*b~2 ； a為腫瘤細胞的平均半徑，b為綠色熒光細胞的平均半徑，c為紅色熒光細胞的平均半徑。
【文檔編號】G01N21/64GK103760140SQ201410006423
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月7日 優先權日:2014年1月7日
【發明者】方敏, 李雁, 屈愛平, 劉娟, 袁靜萍 申請人:李雁