一種便攜快速檢測赭曲霉毒素a的方法
【專利摘要】本發明公開了一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法。首先制備蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA。隨后將生物素-疊氮修飾DNA結合在磁珠表面，并加入不同濃度的赭曲霉毒素A混合。然后加入先前制備好的蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA、CuSO4溶液、抗壞血酸溶液。其中抗壞血酸溶液能還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化生物素-疊氮修飾DNA與蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA發生點擊化學反應。反應結束后取上層清液加入至蔗糖溶液中，蔗糖轉化酶能有效催化溶液中蔗糖轉化為葡萄糖。最后采用血糖儀進行測定。該方法有機地將點擊化學快速反應的優勢與適配體高特異性的特點結合起來，采用簡單便攜的血糖儀進行數據采集，大大降低了操作的復雜性和檢測成本，提高了靈敏度和選擇性。
【專利說明】一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學領域，尤其是涉及一種基于點擊化學反應構建的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法。
【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素A是最普遍的食物污染毒素之一，主要是由一些曲霉菌屬和青霉菌屬真菌產生，而這些真菌易在谷類作物、水果、啤酒和白酒中生長繁殖。在動物體內，赭曲霉毒素A易于被腸道吸收，容易引起腎臟和肝臟的強毒性，而且還具有致癌、致畸、抑制免疫力等作用。國際癌癥研究機構已經將赭曲霉毒素A列為一種潛在的人類致癌物。聯合國糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會(FA0/WH0 JECFA)指出食物間接傳遞給人類的赭曲霉毒素A中，50%是來自于谷類物質。因此很多國家制定了赭曲霉毒素A在谷類物質中的最高限量標準，例如在未加工的谷物中，不能超過5.0 Pg/kg，在加工過的谷類物質中，不得超過3.0 Pg/kg。隨之也涌現出了許多方法對赭曲霉毒素A進行檢測，如可被接受的液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用技術、薄層色譜法，但這些方法所需儀器昂貴，耗時，而且需要專門的培訓人員進行操作，檢測成本高，因此在一定程度上阻礙了它們的應用。目前一些高靈敏的免疫檢測技術也相繼報道，如酶聯免疫檢測法、電化學免疫傳感器、熒光免疫檢測技術等，然而這些方法都需要依賴于抗體、半抗原以及免疫抗原的制備，該制備過程不但復雜、耗時，而且也需要借助于大型儀器進行檢測，不便攜帶。因此一些靈敏度高、操作簡單和成本低的方法需要被開發，例如采用適配體DNA結合技術來降低操作的復雜性。
[0003]點擊化學是美國化學家Sharpless首先提出的一種合成概念。它主要是基于小分子單元依賴自身的性質快速生成新物質而建立的一類反應。其中Cu(I)催化疊氮與端炔基團的環加成反應是點擊化學反應中研究最為廣泛，也最為成熟的反應類型之一。該類反應速度快、立體選擇性好、產率高、副產物少、對環境污染小，并且原料易得，所需要的反應條件簡單、溫和，而且氧氣和水溶劑所帶來的影響較小。
[0004]
【發明內容】
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本發明的目的在于提供一種制備簡單、成本低、便于攜帶、適合現場檢測的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法。該方法有機地將點擊化學快速反應的優勢與適配體的高特異性特點結合起來，采用簡單便攜的血糖儀進行數據采集，大大降低了操作的復雜性和檢測成本，提高了靈敏度和選擇性。
[0005]本發明的目的是這樣實現的:
一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征是:具體步驟如下:
1.按照參考文獻(Xiang, Y.; Lu, Y.; Using personal glucose meters andfunctional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets, NatureChemistry, 2011，3，697-703.)，釆用巰基-端炔修飾DNA、磺基-4_(N_馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯鈉鹽、蔗糖轉化酶和三-(2-甲酰乙基)膦制備蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA ；
2.將5.0 μ? 0.05 μΜ的生物素-疊氮修飾DNA、10 μ?鏈霉素修飾的磁珠一起加入至25 μ? PBS緩沖溶液(由磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制的磷酸鹽緩沖溶液)中，PBS緩沖溶液的濃度為0.01 M，pH為7.3，在室溫下震蕩30分鐘，促使生物素-疊氮修飾DNA結合在磁珠表面；
3.在步驟2反應結束后的PBS緩沖溶液中加入5.0 μ? NaCl和不同濃度的赭曲霉毒素Α，赭曲霉毒素A的濃度范圍為0.2 ng/mL~50 ng/mL，在室溫下震蕩15分鐘；反應結束后，采用磁鐵進行第一次分離，棄去第一次上層清液，得到下層磁珠，并用PBS緩沖溶液清洗磁珠兩次，清洗結束后在磁珠中加入50 μ? PBS緩沖溶液混勻，得到含有結合在磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液；
4.取20μ?步驟3中反應所得的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μ?步驟
I中所得的蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA溶液、5.0 μ? 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μ? 1.0 mM抗壞血酸溶液，在室溫下培育10分鐘，讓抗壞血酸還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA與磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A發生點擊化學反應，得到蔗糖轉化酶修飾磁珠溶液；
5.步驟4反應結束后，對步驟4中所得到的蔗糖轉化酶修飾磁珠溶液采用磁鐵進行第二次分離，得到第二次上層清液；取10 μ?第二次上層清液，加入至2.5 μ? 2.0 M蔗糖溶液，在室溫下反應20分鐘，取3.0 μ?溶液至血糖儀試紙上，采用血糖儀進行測量，繪制所測數據在不同赭曲霉毒素A濃度條件下的變化趨勢圖，根據該圖就能檢測赭曲霉毒素A的濃度。
[0006]其中:
步驟I中所述的巰基-端炔修飾DNA的`序列從5’到3’端為:5’ -炔基-AAA AAA AAAAAA-巰基-3’。
[0007]步驟2中所述的生物素-疊氮修飾DNA的序列從5’到3’端為:5’ -生物素-GATCGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-疊氮-3，。
[0008]當溶液存在赭曲霉毒素A時,赭曲霉毒素A能與生物素-疊氮修飾DNA進行結合，引起DNA鏈構象發生變化，促使疊氮基團緊靠磁珠表面，并產生空間位阻效應，導致生物素-疊氮修飾DNA不能與蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA發生點擊化學反應，致使蔗糖轉化酶不能有效地結合在磁珠表面，而是處于上層清液中。因此，取第二次上層清液進行檢測時，蔗糖轉化酶能有效催化步驟5溶液中的蔗糖轉化為葡萄糖。采用血糖儀測定該反應溶液時，數值較高。并且隨著赭曲霉毒素A濃度增加，血糖儀數值逐漸增大，達到檢測赭曲霉毒素A的目的。
[0009]本發明在0.2 ng/mL~5.0 ng/mL的濃度范圍內對赭曲霉毒素A的檢測呈現良好的線性響應，檢測限約為73 pg/mL，遠低于赭曲霉毒素A在谷類物質中的最高限量標準。此外，血糖儀試紙上的圓斑顏色隨著赭曲霉毒素A濃度的增加逐漸由黃色變為綠色，而且能直接用肉眼觀測到該過程。
[0010]本發明的顯著優點在于:
(I)本發明結合點擊化學反應速度快的優勢以及適配體特異性高的特點，大大降低了操作的復雜性，提高了靈敏度和選擇性。[0011 ] ( 2 )本發明的操作過程都是在室溫下進行，反應條件溫和，容易控制。
[0012](3)本發明采用簡單、小巧的血糖儀進行數據采集，降低了檢測成本，而且便于攜帶，適合現場適時檢測。
[0013](4)本發明在用于赭曲霉毒素A的檢測過程中，能直接用肉眼觀測到試紙上的圓斑顏色隨著赭曲霉毒素A濃度的增加逐漸由黃色變為綠色的過程，顯示出高效、簡單的優勢。
[0014]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1為本發明的便攜快速檢測赭曲霉毒素A方法的原理示意圖；
圖2為本發明所述方法在含有和不含赭曲霉毒素A的數值變化示意圖，其中a為含有赭曲霉毒素A, b為不含赭曲霉毒素A。插入圖為相應的試紙圓斑顏色變化,其中a顯示出綠色，b顯示出黃色。
[0015]圖3為本發明所述方法在赭曲霉毒素A濃度為0.2 ng/mL~50 ng/mL范圍內的變化趨勢示意圖。其中I和Itl分別表示體系在含有和不含赭曲霉毒素A條件下的數值。
[0016]圖4為本發明所述方法在不同毒素條件下的變化示意圖。其中AFB1為黃曲霉毒素B1, AFM1為黃曲霉毒素M1, F-2為玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A濃度為1.0 ng/mL,其它毒素濃度為5.0 ng/mL ο
[0017]【具體實施方式】:
下面結合實施例并對照附圖對本發明作進一步詳細說明。
`[0018]為了更好地理解本發明的內容，下面通過具體的實施例來進一步說明本發明的技術方案，具體包括合成、性質測定等。這些實施方式只是對本發明的說明，并不限制本發明。
[0019]實施例1:
一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，具體步驟如下:
1.制備蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA:首先將30 μ? 0.3 mM巰基-端炔修飾DNA (巰基-端炔修飾DNA序列從5’到3’端為:5’ -炔基-AAA AAA AAA AAA-巰基-3’)、2.0 μ?30 mM三-(2-甲酰乙基)膦(TCEP)和2.0 μ? 1.0 M PBS緩沖溶液(由磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制的磷酸鹽緩沖溶液，PH為5.5)均勻混合，室溫培育1.0小時，活化巰基-端炔修飾DNA。結束后采用分子量為IOK的超濾離心管進行分離清洗5次。其次加入1.0 mg磺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)至400 μ?20 mg/mL的蔗糖轉化酶溶液中，混合均勻，室溫震蕩1.0小時，用以活化蔗糖轉化酶。震蕩結束后離心除去多余不溶解的Sulfo-SMCC，上層清液采用分子量為100K的超濾離心管進行離心清洗5次。最后將活化后的巰基-端炔修飾DNA與蔗糖轉化酶溶液混合并室溫培育48小時，反應結束后，采用分子量為100K的超濾離心管進行離心清洗5次，取出超濾離心管中所得的蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA溶液，溶解在500 μ?的0.01 M PBS緩沖溶液(pH為
7.3)中以備后續實驗使用。
[0020]2.將5.0 μ? 0.05 μΜ的生物素-疊氮修飾DNA (生物素-疊氮修飾DNA序列從5’ 到 3’ 端為:5’ -生物素-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-疊氮-3’)、10 μ?鏈霉素修飾的磁珠加入至25 μ? PBS緩沖溶液中，PBS緩沖溶液的濃度為0.01M，pH為7.3，在室溫下震蕩30分鐘，促使生物素-疊氮修飾DNA結合在磁珠表面。
[0021]3.在步驟2反應結束后的PBS緩沖溶液中加入5.0 μ? NaCl和不同濃度的赭曲霉毒素 A (具體濃度分別為 0.2 ng/mL、0.5 ng/mL> 1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL),在室溫下震蕩15分鐘；反應結束后,米用磁鐵進行第一次分離,棄去第一次上層清液，得到下層磁珠，并用PBS緩沖溶液清洗磁珠兩次，清洗結束后在磁珠中加入50 μ?PBS緩沖溶液混勻，得到含有結合在磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液；
4.取20μ?步驟3反應所得疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μ?步驟I中所得的蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA溶液、5.0 μ? 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μ? 1.0 mM抗壞血酸溶液，在室溫下培育10分鐘，讓抗壞血酸還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA與磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A發生點擊化學反應，得到蔗糖轉化酶修飾磁珠溶液；
5.步驟4反應結束后，對步驟4中所得的蔗糖轉化酶修飾磁珠溶液采用磁鐵進行第二次分離，得到第二次上層清液；取10 KL第二次上層清液，加入至2.5 μ? 2.0 M蔗糖溶液，在室溫下反應20分鐘，取3.0 PL溶液至血糖儀試紙上，采用血糖儀進行測量。繪制所測數值在不同赭曲霉毒素A濃度條件下的變化趨勢圖，根據該圖就能檢測赭曲霉毒素A的濃度。
[0022]實施例2:
一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A方法的特異性，具體步驟如下:
在與實施例1同樣的實驗條件下，用四種其它毒素來代替赭曲霉毒素A作用后分別測定四種其它毒素的血糖儀響應值，并與赭曲霉毒素A的響應值進行對比，即可考察本發明所述方法的特異性。這四種毒素分別為黃曲霉毒素B1 (AFB1X黃曲霉毒素M1 (AFM1)、玉米赤霉烯酮(F-2)，使用濃度均為5.0 ng/mL。
[0023]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。`
【權利要求】
1.一種便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征在于:具體步驟如下: (1)、按照參考文獻(Xiang, Y.; Lu, Y.; Using personal glucose meters andfunctional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets, NatureChemistry, 2011, 3，697-703.)，采用巰基-端炔修飾DNA、磺基-4_(N_馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯鈉鹽、蔗糖轉化酶和三-(2-甲酰乙基)膦制備蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA ； (2)、將5.0μ? 0.05 μΜ的生物素-疊氮修飾DNA、10 μ?鏈霉素修飾的磁珠一起加入至25 μ? PBS緩沖溶液中，PBS緩沖溶液的濃度為0.01 M，pH為7.3，在室溫下震蕩30分鐘，促使生物素-疊氮修飾DNA結合在磁珠表面； (3)、在步驟(2)反應結束后的PBS緩沖溶液中加入5.0 μ? NaCl和不同濃度的赭曲霉毒素Α,赭曲霉毒素A的濃度范圍為0.2 ng/mL~50 ng/mL,在室溫下震蕩15分鐘；反應結束后，采用磁鐵進行第一次分離，棄去第一次上層清液，得到下層磁珠，并用PBS緩沖溶液清洗磁珠兩次，清洗結束后在磁珠中加入50 μ? PBS緩沖溶液混勻，得到含有結合在磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液； (4)、取20PL步驟(3)反應所得疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A溶液，加入2.5 μ?步驟(I)所得蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA溶液、5.0 μ? 0.1 mM CuSO4溶液、5.0 μ? 1.0 mM抗壞血酸溶液，在室溫下培育10分鐘，讓抗壞血酸還原Cu(II)得到Cu(I)化合物，催化蔗糖轉化酶-端炔修飾DNA與磁珠表面的疊氮修飾DNA-赭曲霉毒素A發生點擊化學反應，得到蔗糖轉化酶修飾磁珠溶液； (5)、步驟(4)反應結束后，對步驟(4)中所得到的蔗糖轉化酶修飾磁珠溶液采用磁鐵進行第二次分離，得到第二次上層清液；取10 KL第二次上層清液，加入至2.5 μ? 2.0 M蔗糖溶液，在室溫下反應20分鐘，取3.0 μ?溶液至血糖儀試紙上，采用血糖儀進行測量，繪制所測數值在不同赭曲霉毒素A濃度條件下的變化趨勢圖，根據該圖就能檢測赭曲霉毒素A的濃度。
2.根據權利要求1所述的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征在于:步驟(1)中所述的巰基-端炔修飾DNA序列從5’到3’端為:5’ -炔基-AAA AAA AAA AAA-巰基-3，。
3.根據權利要求1所述的便攜快速檢測赭曲霉毒素A的方法，特征在于:步驟(2)中所述的生物素-疊氮修飾DNA序列從5’到3’端為:5’ -生物素-GAT CGG GTG TGG GTG GCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-疊氮-3’。
【文檔編號】G01N21/78GK103808716SQ201410005333
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月7日 優先權日:2014年1月7日
【發明者】邱素艷, 羅林廣, 張金艷, 周瑤敏, 李瑞麗 申請人:江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所