定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒及檢測方法。該試劑盒內有預包被抗細胞間粘附分子-1單克隆抗體的96孔板，以及瓶裝的以下試劑：磷酸鹽漂洗液，封閉液，樣品稀釋液，細胞間粘附分子-1標準液，辣根過氧化物酶標記的抗細胞間粘附分子-1多克隆抗體IgG，發光底物魯米那發光液和質控血清。本發明檢測的人血清可溶性細胞間粘附分子-1的測定結果精確、客觀、方法簡便，易于推廣應用。可反映自身免疫性甲狀腺患者體內的自身免疫狀態，可作為自身免疫性甲狀腺疾病的診斷的一個參考指標，這對于了解其自身免疫活動程度，預測格雷夫斯眼病的發生和格雷夫斯甲亢的復發，確定合理的療程和停藥時機等方面具有重要意義。
【專利說明】定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于化學發光免疫測定法，具體是一種以多孔酶標板做載體制備固相抗體，用于定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1 (SlCAM-1)的化學發光免疫分析(CLIA)試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)是一組發病機制復雜的器官特異性自身免疫疾病，包括格雷夫斯病(Graves’ disease, GD)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’ s thyroiditis, HT)等。人血清細胞間粘附分子-1 (ICAM-1)是一種細胞表面單鏈糖蛋白，在細胞膜上分為細胞外區段、疏水的跨膜區段和短的細胞內區段。細胞外區段有5個細胞外免疫球蛋白樣結構區，其中第一個免疫球蛋白樣結構區與淋巴細胞功能相關抗原 _1 (lymphocyte function-associated antigen-1 LFA-1)配基相結合，LFA-1 在所有白細胞上均有表達，第三個結構樣區與補體受體3 (又稱Mac-Ι)相結合。它的分子量為80 — 115kD，位于染色體19。ICAM-1的功能是通過與LFA-1和Mac-1結合而實現的。ICAM-1分布廣泛，如:血管內皮細胞、胸腺上皮細胞、多種腫瘤細胞以及人類甲狀腺上皮細胞等均表達，并且在白細胞介素I (IL-1)、腫瘤壞死因子α (TNF-α )、干擾素Y (INF-Y )刺激下表達明顯增加。可溶性細胞間粘附分子_1 (soluble intercellular adhesionmolecule-1 sICAM-1)為細胞表面ICAM-1脫落入血所形成。ICAM-1的功能是參與抗原識另O、補體結合、細胞粘附功能，其表達是導致GD發生的重要因素之一，并且其血清水平對于判斷GD的發生、停藥時機的確定和復發具有重要意義。
[0003]近年來的研究表明，細胞間粘附分子-1的表達與自身免疫甲狀腺病免疫病理過程密切相關。⑶和橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺組織內浸潤淋巴細胞、內皮細胞的ICAM-1和sICAM-1表達異常活躍。另外，發現伴有突眼的⑶患者血清sICAM-1水平異常增高，這是因為⑶患者眼球后組織強烈表達sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多與眶周炎癥浸潤程度密切相關。此外，研究還發現，在藥物的治療過程中，甲狀腺功能和臨床癥狀的好轉與血清sICAM-1水平的下降并不同步，往往甲狀腺功能的恢復在很大程度上要早于sICAM-1的恢復。綜上所述，可溶性細胞間粘附分子-1的濃度變化可能對于判斷GD的自身免疫紊亂水平、停藥與否和是否復發等具有重要意義。
[0004]目前，沒有國產的sICAM-1化學發光檢測技術。國外僅有美國R&D公司生產的人血清sICAM-1酶聯免疫分析試劑盒，陽性檢出率較低，方法煩瑣，流程長，而且價格十分昂貴，至今在國內未能推廣。
[0005]
【發明內容】
本發明是為了克服進口試劑盒存在的問題，解決進一步推廣應用的需求，而提供一種靈敏度高、特異性好、操作簡便、一次可測定大量樣品的定量人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析檢測試劑盒及檢測方法。[0006]本發明是基于免疫反應和化學發光反應，能夠檢測人血清中sICAM-1的含量，其測定原理是用抗ICAM-1單克隆抗體包被多孔酶標板，用含1.0%-5.0%牛血清白蛋白的磷酸鹽漂洗液(PBST)封閉，然后分別加入待測血清樣品和標準液，其中sICAM-1與包被在固相載體上的單抗特異性結合，未結合成分經漂洗去除，再加入辣根過氧化物酶標記的抗ICAM-1多克隆抗體IgG (即酶標二抗)，進行二次抗原抗體反應，經漂洗去除未結合成分后，加發光底物魯米那發光液，最后在化學發光儀上測定發光值，通過標準曲線計算待測樣品中的sICAM-1濃度。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案實現的。
[0008]一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒,該試劑盒內包括有預包被抗細胞間粘附分子-1單克隆抗體的96孔板，以及瓶裝的以下試劑:磷酸鹽漂洗液，封閉液，樣品稀釋液，細胞間粘附分子-1標準液，辣根過氧化物酶標記的抗細胞間粘附分子-1多克隆抗體IgG，發光底物魯米那發光液和質控血清。
[0009]所述定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，所述預包被抗細胞間粘附分子-1單克隆抗體的96孔板，其是經以下重量份數比的原料制成pH9.6的碳酸鹽緩沖液包被所述單克隆抗體的，碳酸鈉0.78-0.80份、碳酸氫鈉1.45-1.49份、去尚子水500份。
[0010]所述定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其磷酸鹽漂洗液是按以下重量份數比的原料制成PH7.4的液體，磷酸二氫鉀0.3-0.5份、磷酸氫二鈉3.5-4.0份、氯化鈉7.8-8.2份、氯化鉀0.1-0.3份、吐溫-20 0.3-0.6份和去離子水1000份。
[0011]所述定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其封閉液是含1.0-5.0%牛血清白蛋白的磷酸鹽漂洗液。
[0012]所述定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其樣品稀釋液是按以下重量份數比的原料制成PH7.4液體，磷酸二氫鉀0.3-0.5份、磷酸氫二鈉3.5-4.0份、氯化鈉7.8-8.2份、氯化鉀0.1-0.3份、吐溫-20 0.3-0.6份、牛血清白蛋白10-15份、去尚子水1000份。
[0013]所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其細胞間粘附分子-1標準液是購買的美國R&D公司生產的純品細胞間粘附分子-1，用樣品稀釋液稀釋而成，稀釋濃度分別是200ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, 5ng/ml,2ng/ml。
[0014]所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析的檢測方法，該試劑盒是按以下步驟檢測的:
①取出96孔酶標板，待測血清用樣品稀釋液稀釋10倍，每孔加稀釋后的待測血清100 μ I ;標準曲線各孔分別加濃度為 200ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, 5ng/ml, 2ng/ml的標準液ΙΟΟμ 1，37°C溫育I小時；
②甩掉反應液，每孔用200-300μ I磷酸鹽漂洗液洗3次，拍干；
③每孔加辣根過氧化物酶標記的抗ICAM-1多克隆抗體IgGlOOy1，37°C溫育I小時；
④甩掉反應液，每孔用200-300μ I磷酸鹽漂洗液洗6次，拍干；
⑤每孔加發光底物魯米那發光液100μ1，37°C溫育5分鐘；⑥混勻后30分鐘內在化學發光儀上測定發光值；
⑦在計算機中分別輸入測定的標準液和待測樣品的發光值，根據Microsoftexcel軟件繪制的線性標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中sICAM-1的濃度值。
[0015]本發明的優點；
1、本發明試劑盒以抗細胞間粘附分子-1單克隆抗體做包被抗體，檢測的人血清sICAM-lj^⑶患者陽性檢出率高。
[0016]2、本發明試劑盒實現了人血清sICAM-1的定量測定，測定結果精確、客觀。
[0017]3、本發明試劑盒檢測靈敏、穩定、方法簡便，對AITD特別是GD的自身免疫紊亂水平、停藥與否和是否復發等具有重要意義。本發明試劑盒價格低廉，易于推廣應用，解決了廣大臨床醫師的迫切需求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是檢測人血清sICAM-1標準曲線圖；
圖2是抗ICAM-1單抗與sICAM-1、VCAM-1劑量一反應曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖 及實施例對本發明進行詳細的說明。
[0020]主要試劑及原料 :
1.抗ICAM-1單克隆抗體(自行制備)
2.碳酸鹽緩沖液(自行制備)
3.磷酸鹽漂洗液(PBST)(自行制備)
4.封閉液(自行制備)
5.1CAM-1標準品(美國R&D公司生產)
6.樣品稀釋液(自行制備)
7.辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗ICAM-1多克隆抗體IgG(即酶標二抗)(自行制備)
8.發光底物魯米那發光液(北京科躍中楷生物技術有限公司，250ml/瓶)
9.質控血清(自行制備)
一、抗ICAM-1單克隆抗體的制備
1.將IOygICAM-1蛋白與佐劑混合腹腔注射BALB / C小鼠三次，每次間隔3周，取小鼠內眥靜脈血測免疫效價；
2.取效價高的小鼠尾靜脈注射加強免疫一次，三天后取小鼠脾細胞，與骨髓瘤細胞在PEG1650 ( polyethylene glycol,聚乙二醇1650)作用下進行細胞融合。一周后取細胞生長孔上清經ELISA測抗體分泌情況，將陽性分泌孔擴大培養并進行亞克隆。三次亞克隆后，將單克隆孔細胞擴大培養，進行雜交瘤細胞及單克隆抗體的鑒定；
3.采用動物體內誘生的方法大量制備單克隆抗體，最后用ProteinG純化腹水得到抗ICAM-1的單克隆抗體。
[0021]二、96孔酶標板包被抗體的制備
1.將抗ICAM-1單克隆抗體用包被碳酸鹽緩沖液(0.79克碳酸鈉、1.47克碳酸氫鈉、500 毫升去離子水，ρΗ9.6)稀釋至 100ng/100 μ 1-2 μ g/100 μ I ； 2.每孔加稀釋后的抗體液ΙΟΟμ1，4°C過夜包被；
3.甩掉包被液，用磷酸鹽漂洗液(PBST)(0.3克磷酸二氫鉀、3.6克磷酸氫二鈉、8.0克氯化鈉、0.2克氯化鉀、0.5毫升吐溫-20、1000毫升去離子水，pH7.4)漂洗3次，每次每孔加漂洗液200-300 μ 1，再用含1.0-5.0% BSA的PBST封閉液封閉，每孔加封閉液100 μ 1，25-37°C溫育I小時；
4.甩掉封閉液，再用漂洗液漂洗3次，拍干后備用。
三、標準曲線的建立
購買的美國R&D公司生產的純品細胞間粘附分子-1用樣品稀釋液稀釋而成，確定標準曲線各點濃度分別為 200ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, 5ng/ml, 2ng/ml。
[0022]以ICAM-1標準品濃度為橫坐標(普通坐標)，以其對應的發光度值為縱坐標(普通坐標)，在線性坐標軸上做圖建立標準曲線。結果見圖1所示。
[0023]四、質控血清的制備
取30例以上GD患者血清，混勻，用所述定量檢測可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒反復多次測定，定值后分裝、冷凍干燥，_30°C避光保存，即為質控血清。
[0024]五、HRP標記的抗ICAM-1多克隆抗體IgG的制備 1.HRP 5mg溶于Iml滅菌水中。
[0025]2.0.5ml過碘酸鈉加入Iml的HRP中，這時HRP水的顏色由黃變藍青色，室溫攪拌25分鐘，對PH4.4的醋酸鈉透析。
[0026]3.取IgG Iml在PH9.5的碳酸鹽緩沖液中透析過夜。
[0027]4.取透析好的HRP放在小燒杯中，用0.2M碳酸鹽緩沖液調PH9.5-9.6，加入透析好的IgG，4°C攪拌2小時。
[0028]5.取0.4ml硼氫化鈉加入到攪拌好的HRP+IgG中，4°C靜置2小時，還原成穩定的酶標抗體。
[0029]6.將靜置好的HRP和IgG對IL的PBS透析過夜。
[0030]7.上G200凝膠柱，收集第一峰即為標記好的抗ICAM-1多克隆抗體IgG。
[0031]六、用試劑盒檢測人血清sICAM-1的操作步驟:
1.取出96孔酶標板，待測血清用磷酸鹽樣品稀釋液(0.3克磷酸二氫鉀、3.6克磷酸氫二鈉、8.0克氯化鈉、0.2克氯化鉀、0.5毫升吐溫_20、10克BSA、1000毫升去離子水，PH7.4)稀釋10倍，每孔加稀釋后的待測血清100μ I ;標準曲線各孔分別加各濃度(200ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, lOng/ml, 5ng/ml, 2ng/ml)標準液 100 μ I, 37°C溫育 I 小時。
2.甩掉反應液，每孔用200-300μ I磷酸鹽漂洗液洗3次，拍干。
[0032]3.每孔加辣根過氧化物酶標記的抗ICAM-1多克隆抗體IgG 100 μ 1，37°C溫育I小時。
[0033]4.甩掉反應液，每孔用200-300 μ I磷酸鹽漂洗液洗6次，拍干。
[0034]5.每孔加發光底物魯米那發光液100 μ 1，37°C溫育5分鐘。
[0035]6.混勻后30分鐘內在化學發光儀上測定發光值。
[0036]7.在計算機中分別輸入測定的標準液和待測樣品的發光值，根據Microsoftexcel軟件繪制的線性標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中sICAM-1的濃度值。
[0037]七、試劑盒性能指標1.靈敏度
重復測定20孔零標準品，計算出試劑盒檢測靈敏度為13.8ng/ml。
[0038]2.特異性
用ICAM-1標準品與十倍于ICAM-1標準線各點濃度的VCAM-1 (與ICAM-1結構近似)標準品分別做線，ICAM-1的劑量一反應曲線顯示:隨ICAM-1濃度增加，發光值逐漸升高且成直線關系，說明ICAM-1單抗與ICAM-1特異性結合；VCAM-1的劑量一反應曲線顯示:隨VCAM-1濃度增加，發光值無明顯變化且均為本底水平，說明ICAM-1單抗與VCAM-1無特異性結合。結果見圖2所示。
[0039]3.精密度
(I)批內變異:一次實驗中分別測定同一陽性質控血清和陰性質控血清各6樣，計算批內變異(CV%)分別為3.36%和3.25%。
[0040](2)批間變異:同一陽性質控血清和陰性質控血清，連續測定6次，計算批間CV%值分別為7.87%和8.62%。
[0041]4.準確度
3份sICAM-1基質濃度均為10.28ng/ml的樣本分別加入100ng/ml、50ng/ml、5ng/mlICAM-1后，用本試劑盒實測濃度為90.3ng/ml、49.9ng/ml、4.84ng/ml，計算回收率分別為
90.3%,99.8%,96.7%，平均回收率 95.6%。
[0042]七、本試劑盒臨床檢測結果
本試劑盒檢測正常人sICAM-1濃度(i 土s)為158±59ng/ml，正常值范圍(i ±2s)為(40 ng/ml _276ng/ml)，正常人超過 276 ng/ml 的有 3 例，陽性率為 2.3%(3/132);GD患者sICAM-1濃度(I 土s)為459±142ng/ml，超過276 ng/ml的有87例，陽性率為
91.6%(87/95) ；HT 患者 siCAM-1 濃度 G 士s)為 382± 110ng/ml，超過 276 ng/ml 的有 61例，陽性率為84.7%(61/72)。⑶患者和HT患者sICAM-Ι濃度和陽性率均顯著高于正常人。結果見表1所示。
[0043]表1定量人血清sICAM-1 CLIA臨床檢測結果
【權利要求】
1.一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于:該試劑盒內包括有預包被抗細胞間粘附分子-1單克隆抗體的96孔板，以及瓶裝的以下試劑:磷酸鹽漂洗液，封閉液，樣品稀釋液，細胞間粘附分子-1標準液，辣根過氧化物酶標記的抗細胞間粘附分子-1多克隆抗體IgG為第二抗體，發光底物魯米那發光液和質控血清。
2.如權利要求1所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于:所述預包被抗細胞間粘附分子-1單克隆抗體的96孔板，其是經以下重量份數比的原料制成PH9.6的碳酸鹽緩沖液包被所述單克隆抗體的，碳酸鈉0.78-0.80份、碳酸氫鈉1.45-1.49份、去離子水500份。
3.如權利要求1所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于:所述的磷酸鹽漂洗液是按以下重量份數比的原料制成PH7.4的液體，磷酸二氫鉀0.3-0.5份、磷酸氫二鈉3.5-4.0份、氯化鈉7.8-8.2份、氯化鉀0.1-0.3份、吐溫-20 0.3-0.6份和去離子水1000份配制成。
4.如權利要求1或3所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于:封閉液是含1.0-5.0%牛血清白蛋白的磷酸鹽漂洗液。
5.如權利要求1所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于:樣品稀釋液是按以下重量份數比的原料制成PH7.4液體，磷酸二氫鉀0.3-0.5份、磷酸氫二鈉3.5-4.0份、氯化鈉7.8-8.2份、氯化鉀0.1-0.3份、吐溫-200.3-0.6份、牛血清白蛋白10-15份、去離子水1000份。
6.如權利要求1或5所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于:細胞間`粘附分子-1標準液是純品細胞間粘附分子-1用上述樣品稀釋液稀釋而成，稀釋濃度分別是200ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, 5ng/ml,2ng/ml。
7.如權利要求1所述一種定量檢測人血清可溶性細胞間粘附分子-1的化學發光免疫分析的檢測方法，其特征在于:該方法是按以下步驟進行的， ①取出已預包被抗細胞間粘附分子-1單克隆抗體的96孔板，待測血清用樣品稀釋液稀釋10倍，每孔加稀釋后的待測血清100μ I ;各標準曲線孔分別加濃度為200ng/ml，100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, 5ng/ml, 2ng/ml 的標準液 100 μ 1,37°C溫育 I 小時； ②甩掉反應液，每孔用200-300μ I磷酸鹽漂洗液洗3次，拍干； ③每孔加辣根過氧化物酶標記的抗細胞間粘附分子-1多克隆抗體IgG100μ1，37?溫育I小時； ④甩掉反應液，每孔用200-300μ I磷酸鹽漂洗液洗6次，拍干； ⑤每孔加發光底物魯米那發光液100μ1，37°C溫育5分鐘； ⑥混勻后30分鐘內在化學發光儀上測定發光值； ⑦在計算機中分別輸入測定的標準液和待測樣品的發光值，根據Microsoftexcel軟件繪制的線性標準曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中可溶性細胞間粘附分子-1的濃度值。
【文檔編號】G01N33/68GK103698537SQ201410005110
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】柴錦燕, 李寧, 方佩華, 白慶雙, 高碩 , 譚建 申請人:天津醫科大學總醫院