微流體裝置、用于試劑的固體支持體和相關方法

微流體裝置、用于試劑的固體支持體和相關方法
【專利摘要】微流體裝置包括多個反應孔和多個固體支持體，并且每一個固體支持體具有附接至其上的試劑。所述試劑通過不穩定的試劑/支持體鍵而附接至固體支持體以便將所述試劑配置以通過裂解操作而從支持體上裂解。
【專利說明】微流體裝置、用于試劑的固體支持體和相關方法
[0001] 相關申請 本申請要求提交于2012年5月25日的美國臨時申請系列號61/651，648的優先權，該 申請的公開內容通過整體引用而并入此處。 發明領域
[0002] 本發明涉及微流體裝置、用于試劑的固體支持體和相關方法。
[0003] 背景 聚合酶鏈反應（PCR)是用于擴增基因組DNA(gDNA)或互補DNA(cDNA)的區段的高靈敏 性方法。PCR具有許多應用，例如：檢測痕量核酸以確定存在致病生物體、基因表達、基因分 型、遺傳工程或修飾和法醫的科學應用。PCR擴增提供在大范圍的分析物濃度中卓越的靶標 鑒定和定量。然而，經PCR同時且定量地分析許多分析物已經被證明是極富挑戰性的。基 于嵌入染料熒光的檢測僅能確定總dsDNA的濃度，因此在單一反應器中并行分析多個模板 不可能使用此檢測方法。熒光探針技術（即，Taqman、分子信標或其他化學法）可用于低水 平的反應多重化，因為每種靶標可使用不同顏色的熒光探針作為信號報告分子來擴增。探 針也是序列特異性的，降低源自引物二聚體形成或非特異性擴增的假陽性。用常規微量滴 定板或微流體實時-PCR(rt-PCR)進行多重化的典型方法是使用少量的反應孔，每孔含有 三種不同顏色的探針。然而，通常認為設計多重化的引物和探針集合是有挑戰性的，因為它 們需要附加水平的小心設計和優化以確保彼此的兼容性。依據此方法的多重化因染料之間 的光譜重疊和儀器而最終限于四色檢測，而一種顏色通常預留為內標染料。
[0004] 多重化PCR的優化挑戰也對新出現的疾病的測定或需要分析新序列的其他時間 敏感性應用的快速重構產生障礙。在多重化PCR中遇到的其他難題包括：產生二聚體的引 物互補性、外來的DNA與擴增子或引物/探針之間的非特異性相互作用，以及其中短序列與 較長序列相比擴增更快的固有偏倚。此外，雖然使用在少量的反應孔中分隔開的多重化反 應可對在諸如GeneXpert(Cepheid)或JBAIDS(IdahoTechnologyInc.)等系統中的少量 靶標（約3-12個）運行良好，但此方法對于顯著較大量的靶標變得不方便。在護理點或制 造點，與這些技術一起使用的盒（cartridge)必須單個地裝載相對大量的液體試劑。諸如 來自LifeTechnologies的OpenArrayReal-TimePCRSystem等技術使用在大約 3000 個 微孔的陣列中干燥的預裝引物/探針序列。此技術不進行樣品清除或制備，并且它需要多 件單獨的儀器以加工、裝載和分析樣品。此外，預裝引物/探針集合必須使用基于印制的技 術來完成，所述技術極大地增加裝置制作所需的時間和花費。
[0005] 發明實施方案概要 在一些實施方案中，微流體裝置包括多個反應孔和多個固體支持體。每一個固體支持 體具有附接至其上的試劑，其中所述試劑通過不穩定的試劑/支持體鍵而附接至固體支持 體以便將所述試劑配置以通過裂解操作而從支持體上裂解。
[0006] 在一些實施方案中，裂解操作包括熱力操作、添加化學品和/或應用光至試劑/支 持體鍵。試劑可包括用于PCR反應的引物。不穩定的試劑/支持體鍵可包括鏈霉親和素-生 物素鍵和/或抗生物素蛋白-生物素鍵。裂解操作可包括熱力操作。在一些實施方案中，將 鏈霉親和素-生物素鍵配置用以當固體支持體在約50-99°C下孵育時從支持體釋放試劑。 固體支持體可為微珠例如磁性微球。在一些實施方案中，固體支持體包含標記。標記可包 含預定支持體形狀、預定支持體大小、支持體的磁性特性和/或光學特性。標記可包括熒光 記。
[0007] 在一些實施方案中，將所述多個孔和所述多個固體支持體調整大小并配置使得僅 單個所述多個固體支持體容納于對應的單個所述多個孔中。所述多個孔可包含固體支持體 容納區域或固體支持體容納區域和反應區，并且可將該固體支持體容納區域配置用以容納 單個所述多個固體支持體。固體支持體容納區域可具有與單個所述多個固體支持體的大小 和/或形狀基本對應的橫截面積。在一些實施方案中，反應可發生或啟始于固體支持體容 納區域中，其可在此情況下充當反應區。反應區可具有比固體支持體容納區域的橫截面積 更大的橫截面積。微流體裝置可包含密封件（彈性膜，例如聚二甲基硅氧烷）或以流體性 隔離各個所述多個孔的不可混溶的流體。微流體裝置可包含在孔中的膜。膜可為提取膜。 在一些實施方案中，膜包含單片氧化鋁膜。在一些實施方案中，通道連接至膜，所述膜配置 用以提供通過膜與所述多個孔的流體連接。在一些實施方案中，將孔配置以容納多個支持 體。在一些實施方案中，圖案化的微柱在膜和通道之間以支撐膜，但允許來自所述多個孔的 經由膜的均勻流體流動。在一些實施方案中，將試劑配置用以從所述多個孔之一中的多個 珠上釋放而實現試劑之間的反應。
[0008] 在一些實施方案中，用于向包含多個反應孔的微流體裝置提供試劑的方法包括提 供在所述多個反應孔中的多個固體支持體，每個固體支持體具有附接至其上的試劑使得該 試劑通過不穩定的試劑/支持體鍵而附接至固體支持體并且將該試劑配置以通過裂解操 作而從支持體裂解。進行裂解操作以釋放試劑到所述多個反應孔內的溶液中。
[0009] 附圖簡述 結合入并組成說明書的一部分的附圖闡釋本發明實施方案，并且和說明一起用以解釋 本發明的原理。
[0010] 圖IA為依據一些實施方案的具有引物附接至其上的珠的示圖。
[0011] 圖IB為依據一些實施方案的具有不同編碼特性的四個珠的示圖。
[0012] 圖2為具有用于保持圖1A-1B的珠/引物的多個孔的微流體裝置的數字圖像。
[0013] 圖3為圖2的微流體裝置的側視截面圖。
[0014] 圖4為展示測得的DNA量（ng/μL)并指示在室溫和95°C下從珠上釋放的引物的 量和不含引物珠的樣品的條線圖。
[0015] 圖5A-?為闡釋依據一些實施方案的配置用以在各自孔中容納各個珠的微流體 的示圖。
[0016] 圖6為展不依據一些實施方案的使用三種不同珠集合對三種不同模板序列的PCR 擴增的數據的線圖。
[0017]圖7為依據一些實施方案的數字熒光顯微術圖像，其展示：來自含有擴增模板分 子的圖2-3裝置的孔的嵌入染料的相對強的信號，和來自圖像中央的空白反應孔的幾乎沒 有的信號。
[0018] 圖8為依據一些實施方案的針對rt-PCR實驗的PCR循環數繪制的圖2-3裝置中 各孔的熒光信號的圖。
[0019] 圖9為依據一些實施方案的微流體裝置示意圖。
[0020] 圖10為圖9的裝置的透視圖，其展示基底的對齊. 圖11為圖9裝置的側視截面圖。
[0021] 圖12為示意圖的頂視圖，其展示了依據一些實施方案的具有光刻膠道以控制流 體流動的微流體裝置。
[0022] 圖13為圖12的裝置的光學顯微術圖像，其展示其中金層被除去的100μmX100 μm的墊。珠孔位于孔中央。
[0023] 圖14為在圖12的裝置中的444個墊上隔離的染料溶液的熒光圖像。未看到橋接 和看到很少的偏離的小液滴。
[0024] 圖15A-15B為帶有440個親水反應區（100μmX100μm孔）的依據一些實施方 案的微流體裝置的熒光圖像，所述反應區使用25μπι高的光刻膠隔離物隔離250pL(圖 15A)和使用7. 5μm隔離物隔離75pL(圖15B)。
[0025] 圖15C為依據一些實施方案的微流體裝置的熒光圖像其包括1500個用9μm隔 離物隔離出22.5pL體積的反應區（50μmX50μm孔） 圖16A-16C為依據一些實施方案的微流體裝置中的數字PCR反應的熒光圖像，其展 示用每個裝置上的1500個反應孔在22. 5pL反應中進行的拷貝擴增，標稱拷貝數/孔為： 0. 7(圖16A)、0. 2(圖16B)和0. 04(圖16C)。為鑒定陽性孔，將20-25個循環的信號合計 以改善信噪比。
[0026] 圖17A為依據一些實施方案的裝載于直徑4. 15μm、深度5. 7μm的孔中的直徑 3. 3μm的經裝載引物珠的SEM圖像。
[0027] 圖17B為依據一些實施方案的裝置的熒光顯微術圖像，其闡釋在孔中超過90%的 珠占用率。
[0028] 圖18A-18D為展不依據一些實施方案的珠的磁性裝載的一系列突光圖像。一團超 過15, 000個珠可被看作各個畫面中的一大塊，而箭頭指示正通過在裝置下面的磁體吸引 該團珠的方向。
[0029] 圖19A-19C為依據一些實施方案的相同12個反應孔的解碼圖像，所述反應孔用不 同熒光濾器組成像以便將所關心的珠用白色正方形突顯。圖19A鑒別出Qdot605和mecA基因的引物（365/10nm激發）；圖19B鑒別出Qdot655和變異鏈球菌（5： 的引物； 而圖19C鑒別出攜帶發現于金黃色葡萄球菌（5：atfrem)gDNA中的nuc基因的引物的無Qdot標記的珠。Qdot605和Qdot655標記的珠發出明亮的熒光。在圖19C中展示用白色 六邊形突顯的空珠孔。圖19D為展示mecA和nuc基因的陽性結果的測定圖像。
[0030] 圖20為在依據一些實施方案的基于大量珠的祀標DNA俘獲后在5 μ L反應中擴 增的圖。
[0031] 圖21A-21C為在30個循環的PCR擴增后的依據一些實施方案的微流體裝置的陣 列的區域的圖像，其展示在針對依據一些實施方案用彩色熒光編碼的三種不同引物集合的 陽性孔中SYBRgreen熒光增強。
[0032] 圖22Α為依據一些實施方案的微流體裝置的示意圖像，其中依據一些實施方案， 不同孔大小優先保留對應大小的珠。
[0033]圖22B-22C為熒光顯微術圖像，其闡釋圖22A的裝置接納珠的圖案。
[0034]發明實施方案的詳述 本發明現可將在下文中參考其中展示本發明的實施方案的附圖和實施例來描述。然 而，本發明可以以許多不同形式來體現并且不應該解釋為限定于本文闡述的實施方案。相 反地，提供這些實施方案使得此公開會是全面的和完整的，并會向本領域技術人員充分地 傳達本發明的范圍。
[0035]同樣的數字始終是指同樣的元件。在圖中，為清楚可放大某些線、層、組分、元件或 特征的厚度。
[0036] 本文使用的術語僅出于描述具體實施方案的目的而并非想要限定本發明。本文所 使用的單數形式"一個" "一種"和"該"也意圖包含復數形式，除非上下文另外明確指出。 可進一步理解的是，術語〃包含〃和/或"包括"當在說明書中使用時，規定所述特征、步驟、 操作、元件和/或組分的存在，但并不排除存在或添加一個或更多個其它特征、步驟、操作、 元件、組分和/或其群組。本文所使用的術語"和/或"包括一個或更多個相關列舉條目 的任何的和全部的組合。本文所使用的短語例如〃在X和Y之間〃和〃約X和Y之間〃應 該理解為包含X和Y。本文所使用的短語例如〃在約X和Y之間〃意指〃在約X和約Y之 間〃。本文所使用的短語例如〃從約X至Y〃意指〃從約X至約Y"。
[0037]除非另外定義，本文所使用的所有術語（包括技術和科學術語）具有與本發明所 屬的領域的普通技術人員通常所理解的同樣的含義。可進一步理解的是，術語例如在常用 詞典中定義的那些術語，應該理解為具有與相關領域和說明書的上下文中它們的含義一致 的含義，并且不應以理想化的或過度正式的意義來理解，除非本文明白地那樣定義。為了簡 短和/或清楚，可不對眾所周知的功能或結構詳細描述。
[0038] 可理解的是，當元件被提及為"在另一元件之上"、"附接至另一元件〃、"連接至 另一元件〃、〃與另一元件遇1^〃、〃接Il另一元件〃等時，它可以是直接在另一元件上、附接 至另一元件、連接至另一元件、與另一元件偶聯或接觸另一元件，或也可存在間插元件。相 反，當元件被提及為例如"官接在另一元件之h."、"官接附接至另一元件"、"官接連接至 另一元件"、"官接與另一元件偶聯"或"官接接觸另一元件〃時，不存在間插元件。本領 域技術人員也可理解的是，提及的有"鄰近"另一特征布置的結構或特征可具有重疊鄰近 特征或位于鄰近特征之下的部分。
[0039] 空間相關術語例如〃在……之下〃、〃在……下面〃、〃下部〃、〃在…之上〃、〃上部 "等等，為方便描述可用于本文中，以描述一個元件或特征與另一元件或特征的如圖中所闡 釋的關系。可理解的是，除了圖中所描述的方向之外，空間相關術語還意圖包含使用或操作 中裝置的不同方向。例如，如果將圖中的裝置倒轉，那么被描述為"皮其他元件或特征王厘 〃或其它元件或特征之的元件將定向"皮其它元件或特征之f。因此，代表性的 術語〃在……之下〃可包括〃在……之上〃和〃在……之下〃兩個方向。裝置可另外定向 (旋轉90度或向其他方向）且本文所使用的空間相關描述符相應地解釋。同樣地，術語〃 朝上地"、〃朝下地"、〃垂直的"、〃水平的〃等等在本文中僅用于解釋目的，除非另外明確 指出。
[0040] 可理解的是，盡管術語〃第一〃、〃第二〃等可在本文中用于描述多個元件，但這些 元件不應該被這些術語所限定。這些術語僅用于將一個元件區別于另一元件。因此，下面 論述的"第一"元件也可稱為"第二"元件而不違背本發明的教義。操作（或步驟）的順 序不限定于權利要求或圖中所提出的次序，除非另外明確指出。
[0041] 術語"寡核苷酸"是指至少約5-約500個核苷酸（例如5、6、7、8、9、10、12、15、18、 20、21、22、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、 300、350、400、450或500個核苷酸）的核苷酸序列。在一些實施方案中，例如，寡核苷酸可 源自約15-約30個核苷酸或約20-約25個核苷酸，該寡核苷酸可用作例如聚合酶鏈反應 (PCR)擴增測定中的引物和/或在雜交測定或微陣列中的探針。本發明的寡核苷酸可為天 然的或合成的，例如，〇嫩、8隱、？嫩、1^隱、修飾過的主鏈等或它們的任意組合，如在本領域中 周知的。
[0042]包括用于擴增和/或檢測的那些在內的探針和引物為任意合適長度的寡核苷酸 (其包括天然存在的寡核苷酸例如DNA和合成的和/或修飾過的寡核苷酸），但通常長度為 5、6或8個核苷酸，多至40、50或60個核苷酸或更多個核苷酸。可將這樣的探針和/或引 物固定于或偶聯至固體支持體(例如：珠、芯片、針或微量滴定板孔）和/或偶聯至或標記上 可檢測的基團(例如：熒光化合物、化學發光化合物、放射性元素或酶)。
[0043] 聚合酶鏈反應（PCR)可依據已知技術來進行。參見例如：美國專利號4, 683, 195、 4, 683, 202、4, 800, 159和4, 965, 188。通常，PCR涉及：首先，將核酸樣品（例如，在熱穩定 DNA聚合酶存在的情況下）與針對待檢測的特定序列的每條鏈的一種寡核苷酸引物在雜交 條件下處理，以便合成與各核酸鏈互補的各引物的延伸產物，所述引物與特定序列的各條 鏈充分互補以與之雜交，使得從各引物合成的延伸產物當與其互補序列分開時可用作用于 合成其他引物延伸產物的模板，并隨后將樣品在變性條件下處理以在待檢測的一個或多個 序列存在時將引物延伸產物同它們的模板分離。循環重復這些步驟直到獲得所需程度的擴 增。擴增序列的檢測可通過向反應產物添加攜帶可檢測的標記的能夠雜交至反應產物上的 寡核苷酸探針（例如，本發明的寡核苷酸探針），并隨后依據已知技術檢測該標記，或通過 在凝膠上直接顯影來進行。擴增序列也可通過將嵌入染料添加至反應混合物中并監測會與 雙鏈DNA的總質量成比例的熒光信號強度來檢測。盡管本發明的實施方案關于PCR反應來 描述，應該理解的是，可使用其它核酸擴增方法，例如逆轉錄PCR(RT-PCR)，所述擴增方法 包括等溫擴增技術例如滾環擴增或環介導的等溫擴增（LAMP)。
[0044]DNA擴增技術例如前述的DNA擴增技術可包括探針、一對探針或兩對探針的使用， 所述探針特異性地結合含有所關心的多態性或突變的DNA，但在相同的雜交條件之下不結 合不含所關心的多態性的DNA，并且所述探針充當用于在擴增反應中擴增DNA或其一部分 的一個或多個引物。這樣的探針在本文中有時稱為擴增探針或引物。
[0045] 術語"試劑"是指為引起化學反應而添加入系統中或加入以查看是否發生反應的 任何物質或化合物，其包括引物、核酸模板和擴增酶。擴增試劑是指除引物、核酸模板和擴 增酶之外通常用于擴增的那些試劑（脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖液等）。通常，將擴增試劑 與其它反應組分一起放置和容納于反應容器（測試管、微孔等）中。
[0046] 本文所使用的術語"磁性"包括鐵磁性、順磁性和超級順磁性性質。
[0047] 通常，用于檢測包含所關心的多態性或突變的DNA的寡核苷酸探針是這樣的寡核 苷酸探針，其結合編碼所述突變或多態性的DNA，但在相同雜交條件下不結合不含所述突變 或多態性的DNA。將寡核苷酸探針標記上合適的可檢測的基團，例如下面闡述的那些。本文 中這樣的探針有時稱為檢測探針或引物。
[0048]可用于實施本發明方法的試劑盒通常會包括：任選與用于實施上述方法的合適說 明書一起包裝的一個或更多個具有附接至其上的試劑的固體支持體和用于實施上述方法 的其他試劑，例如限制酶。試劑盒也可包括容器，其用于容納包括于其中的元件。這樣的容 器包括但不限于：小瓶、安瓿、管、膠囊、瓶、注射器、袋、微流體芯片和盒，包括預裝珠裝置。
[0049] 如圖IA中所闡釋，固體支持體或珠10可具有附接至其上的引物20A、20B。引物 20A、20B可為一對生物素化的引物，而珠10可為鏈霉親和素標記的以便發生生物素化引物 與珠的結合。在一些實施方案中，珠10可包括標記，例如光學標記，所述標記可在分析期間 使用以鑒定錨定到各自的珠IOA上的引物20A、20B。例如，如圖IB中所顯示，不同編碼的珠 10八、1(?、10(：、100可標記用于在分析期間鑒別不同附接的引物集合。多種預編碼方法可用 于在珠10或其他固體支持體上提供標記，包括單獨使用或與其他編碼方法組合使用的預 定的大小、形狀、磁性性質和/或熒光摻雜。定制序列的生物素化的引物和鏈霉親和素標記 的順磁性的磁珠兩者都可容易地從市售供應商購買或在適當裝備的實驗室以合適的質量 制得。
[0050]盡管本發明實施方案在本文中關于珠10(例如磁性微球）來描述，但應該理解的 是，可使用任何合適的固體支持體，無論多孔的、表面多孔的，還是無孔的。支持體可包括 但不限于：諸如多聚體或塑料、玻璃、二氧化硅或金屬或半金屬氧化物（包括但不限于氧化 鋁、氧化鈦、氧化鋯或其他氧化物）等材料制成的磁性或非磁性顆粒或微粒；量子點；光刻 制得的顆粒或結構（離散的或非離散的）；過濾膜或元件；小瓶、微量滴定板、微流體或宏觀 流體反應孔的固體表面；硅酮或其他橡膠；金屬和金屬顆粒；適合于這些目的的天然存在 的支持體或吸收劑。
[0051]盡管本發明實施方案在本文中也關于PCR反應來描述，但應該理解的是，本文所 述的微流體裝置、珠和反應方法可用于多種其他反應，例如，其中試劑從珠上裂解入孔中參 與反應的其他反應。例如，任何核酸轉錄和/或擴增相關的反應是在本發明的范圍之內， 包括但不限于=PCR反應、實時PCR(rt-PCR)、數字PCR(dPCR)、從RNA到cDNA的逆轉錄 (RT)、對來自先前RT步驟的cDNA進行的PCR(RT-PCR)、使用實時或數字定量的RT-PCR、 免疫-PCR(iPCR)及其變體、環介導的等溫擴增（LAMP)、滾環復制和/或非酶核酸擴增方法 (例如，"DNA回路（DNAcircuits)"）。包含于在本發明的范圍內的其他反應包括但不限 于：酶聯免疫吸附測定（ELISA)(其中將熒光底物結合至支持體表面以待在隨后的反應的某 個點裂解)、單分子測定（SiMoA)或數字ELISA(其中將熒光底物結合至支持體表面以待在 隨后的反應某個點裂解)、其中將多個珠用于遞送不同試劑用于組合化學的反應、其中珠遞 送催化劑試劑的反應和/或其中將"點擊"化學試劑以通過隨機珠裝載而確定的化學計量 遞送的反應。
[0052]所有合適的偶聯化學可用于將引物20A、20B結合至珠10。在一些實施方案中，可 使用不穩定的化學鍵例如可使用多種技術裂解的鍵將引物20A、20B附接至珠10。例如，可 將熱能應用于破壞或裂解化學鍵或可將光應用于破壞光可裂解鍵。熱力加熱可通過與熱表 面導熱接觸、焦耳加熱溶液、電阻加熱鄰近珠10的基底、暴露于電磁輻射和/或電磁感應來 完成。在一些實施方案中，化學鍵可使用電離輻射、化學試劑、酶、電化學處理、PH值變化或 其它合適的裂解操作來裂解。例如，PH值變化可由發生于保持珠10的區域表面的電化學反 應引起或條件變化可由引發劑的活化作用直接或間接地引起，所述引發劑自身可通過諸如 熱、光等物理變化、電化學處理、pH值變化等激活。可將引物20A、20B錨定至珠10以便引物 可在PCR之前的儲藏、樣品制備和/或洗滌步驟期間保持錨定。當PCR反應發生時可進行裂 解操作以使引物20A、20B從珠10脫離。根據具體使用的不穩定化學鍵，裂解操作可包括應 用熱、光和/或添加化學品以使引物20A、20B從珠10脫離。當引物20A、20B從珠10脫離 時，引物可容易地參與PCR反應，而當引物20A、20B錨定于珠10時，引物20A、20B通常不在 PCR反應中反應，除非模板DNA在附近。盡管本發明實施方案關于引物20A、20B來描述，但應 該理解的是，任何合適的試劑可用作元件20A、20B并用任何合適的化學鍵結合。例如，可使 用任何試劑、探針或寡核苷酸。除了鏈霉親和素-生物素之外合適的可裂解的鍵包括但不 限于：光可裂解的生物素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素以及captavidin，并且可為市售可得 的，例如，從Ambergen(PCBiotinPhosphoramidite、PCAmino-ModifierPhosphoramidite 和PCSpacerPhosphoramidite)獲得。
[0053] 如圖2-3所闡釋，微流體裝置50可包含多個孔60。可將珠10和附接至其上的引 物20A、20B預裝入孔60中。裝置50可另外包括基底62 (例如，玻璃）和具有用于流體性 連接至孔60的通道66的微流體部分64。如圖3中所闡釋，孔60可在膜68例如單片氧化 鋁膜（AOM)上成型。膜68可用于從樣品中純化DNA。可應用用于樣品清除的其它合適的材 料，所述材料包括能進行固相提取或另一分離方法的無機或多聚體表面或者多聚體膜。可 將膜支撐于連接至通道的圖案化的微柱70的格子或陣列之上，以便將膜充分支持起來但 流體仍可自由且均勻地流經它。因此，珠10上的引物20A、20B可預裝入孔60并且在使用 之前儲存一段時間。孔60可各自包含具有單一引物對的許多拷貝且為方便分析而標記的 珠10。
[0054] 在一些實施方案中，引物20A、20B經鏈霉親和素-生物素鍵而附接至珠10。鏈霉 親和素-生物素鍵是在生物系統中所發現的已知最強的非共價鍵，但它是熱不穩定的。當 生物素化的引物在PCR之前與鏈霉親和素涂覆的微球反應時，引物明顯被俘獲到珠的表面 上。可在合適的緩沖液中進行洗滌或其他的樣品處理步驟而基本上不釋放引物。然而，在加 熱珠10或以其他方式變性鏈霉親和素時，大量的引物從表面釋放并可參加PCR反應。圖4 為使用NanoDrop2000UV-Vis吸光度檢測儀器測量來自以此方式用特異于金黃色葡萄球 菌atfreiAs)祀標DNA的區域的引物標記的珠的混懸液的上清液的圖。如 闡釋的，在從室溫（RT)至<50°C的溫度范圍下，甚至于4°C下存儲若干天后或當于室溫下在 微流體裝置的孔中干燥儲存達超過2個月時，沒有可檢測到的引物釋放。當在95°C下孵育 時，引物被釋放并可輕易地在上清液中檢測到。
[0055] 已觀察到用至今測試的所有生物素化引物集合進行的高水平的珠官能化。當在室 溫下干燥儲存時附接穩定超過60天，而已經測試儲存于溶液中在4°C下>11個月的珠，仍觀 察到PCR反應中的活性。
[0056] 在一些實施方案中，可將珠集合標記上用于如圖IB中所闡釋的PCR反應的多種引 物（例如，正向和反向引物和/或雜交探針）。珠10可通過染料、大小、形狀、磁性特性或其 他可檢測的和/或光學物理特性或特性組合來解碼以便可將帶有預定引物對的各個珠集 合相互區分。如圖5A中闡釋，可提供包含有多個孔110的微反應孔陣列100。每個孔110 包含支持體或珠容納區域112和反應區114。珠和孔的尺寸應該成比例以便遞送合適量的 試劑（引物、探針等）。如果使用，可將珠容納區域112類似調整大小為珠直徑。反應區114 尺寸可從亞微米變化至毫米，體積從亞毫微微升（subfemtoliter)變化至數百微升。珠容 納區域112和珠10大小可如適合于所需反應從亞微米至毫米變化。將珠容納區域112調 整大小并配置以容納單一珠10。因此，可將珠10分別裝載入單個反應孔110。如圖5B中 所展示，將反應溶液120添加入孔110,而可將孔用蓋子130或其它密封件例如不可混溶的 流體或油密封以便將反應孔110相互流體性隔離。如圖5C中所示，可進行裂解操作以將引 物20A、20B從珠10分離。例如，可加熱裝置100以從鏈霉親和素-生物素鍵釋放引物20A、 20B。然而，可根據引物20A、20B和珠10之間的鍵的類型使用包括應用光或化學品在內的 其他裂解操作。如圖中所闡釋，可讀取珠編碼和PCR反應結果以確定：1)孔110中的珠 10(和孔110中的反應中的相應引物）的類型和2)正檢測的各自模板分子的存在和/或 濃度。例如，如果將具體波長的熒光編碼用在珠10上以鑒別相關引物20A、20B，隨后在PCR 之前、期間或結束時在那個波長下讀取熒光編碼信號。可在另一波長下讀取來自用于確定 擴增子的濃度或存在的嵌入染料或探針的信號。可隨后將此信號與編碼信息一起用于確定 各模板分子的存在和/或濃度。
[0057] 因此，在此配置中，無需復雜的確定性裝載或印制技術就可將珠10隨機地分布于 微孔110。在裝載珠10之后和/或進行反應之后可確定在微孔110中的每個珠10的引物 集合和/或探針。因此，可使用相對大量的非常小的反應孔110,其由全部所需珠集合的混 合物隨機裝載。裝置100可使用圖案化至基底中的微孔110集合，該基底配合至密封件或 蓋130或不可混溶的流體例如油、液體多聚體或氟碳化合物液體的覆蓋層，其以其中將各 孔110與其臨孔流體性隔離的方式密封以便各PCR反應充分隔離。在一些實施方案中，裝 置1〇〇(具有基底和孔）和蓋130可由一種剛性的和一種可變形的彈性材料的組合制得以 便可通過施加壓力至裝置100的外表面來產生充分的密封。預編碼方法（單獨或組合使用 的大小、熒光摻雜、形狀、磁性特性等）的應用可實施于非常小的反應體積（例如，在約IcL 至1μ?之間或小于約1μυ，其中僅需要單一珠10以提供需要的引物或其他具體試劑。在 此情況下，可將珠10裝載入微反應孔Iio以便各個孔Iio含有僅僅一個珠10和足以進行 PCR反應的體積。在某些情況下，沒有被珠占據的珠孔體積可為足以發生反應的體積。在此 情況下，珠孔可用來不僅保持珠而且界定反應體積。可將不同集合的引物標記的和/或探 針標記的珠10-起混入單一的溶液中。引物集合（或其他試劑）的身份可隨后依據珠10 的編碼而確定。取樣可要么通過簡單包含入孔110中（通常處于高模板濃度）要么通過直 接雜交至鍵合至珠10的引物集合或其它親和試劑（包括但不限于：抗體或適體）（通常處 于較低模板濃度）來實施。在一些實施方案中，數百至數十億的平行的一元定量PCR反應 可在單一小足跡裝置100中進行。
[0058] 如圖9-11中所示，微流體裝置200包含由形成通道的光刻膠或其他隔離物230分 隔開的兩個基底210、220。隔離物230的高度界定了基底210、220和通道232之間的間隙。 基底210、220包括各自的疏水的區域212、222和親水的區域214、224,其在空間上相互對應 以便當基底210、220處于組合配置（圖10)中時，疏水的區域212、222和親水的區域214、 224相互對齊。基底之一 210包括流體性連接至通道232的孔口 240。基底之一 220另外 包括蝕刻的珠孔260。
[0059] 在此配置中，可將如本文所描述的珠10放置在珠孔260中。可將非水性流體242 和水性溶液244放置在通道232中以形成與各自的珠10之一流體接觸的基本上分隔開的 水性溶液244的反應區246。
[0060] 在一些實施方案中，可將珠10、非水性溶液242和水性溶液244如下裝載入裝置 200。可將多個珠10嵌入孔口 240并裝載入孔260中。例如，珠10可為磁珠，而應用于基 底210、220之一的外部的磁體可用于牽引珠10通過通道232以便珠10落入孔260并原地 停留。可將孔260調整大小并配置用以容納單一珠10。可讓緩沖液涌流過通道232以除去 任何過量的沒有裝載入孔260中的珠10。可隨后將水性流體添加至孔口 240,接著將非水 性流體添加至孔口 240。水性流體可形成鄰近親水的區域214、224的反應區246,所述親水 的區域214、224由非水性流體242分隔開。
[0061] 盡管微流體裝置200前面關于在親水區域214、224中的孔260和反應區246來描 述，但應該理解的是，依據所需反應環境，可將反應區246和孔260替代性地放置在疏水區 域中以便反應發生在非水性流體中。在一些實施方案中，水性流體為包含所需反應的組分 的流體，例如PCR主混合物（mastermix)。基底210、220可由任何合適的材料，例如塑料、 玻璃、或硅或其組合形成。也可使用疏脂圖案化，例如帶有基于氟碳化合物的油相的基于氟 碳化合物的涂層。
[0062] 親水的區域214、224和疏水區域212、214可通過沉積親水的或疏水的層到基底 210、220上來形成，并依據基底210、220的親水的或疏水的特性，可以要求或可以不要求隨 后去除層的一部分。例如，可將金沉積到親水基底，例如硅或玻璃上，并隨后蝕刻以形成基 底的親水區域和金的疏水區域。備選地，可通過對現有表面選擇性修飾，例如等離子體處理 塑料基底的天然表面區域來完成圖案化。
[0063] 如上面所述，可將珠10隨機裝載入孔260,而后續操作可用于確定哪一種珠的類 型與在裝置200上的具體位置相對應。例如，如果珠10包含與附接至珠10的特定引物或 其他試劑相關聯的光學標記，那么可使用光學成像儀例如顯微鏡以光學鑒定哪一個引物與 特定的孔位置相關聯用于后續分析。
[0064] 在一些實施方案中，可將孔260調整大小并配置以基于大小和/或形狀優先保留 特定的珠類型以便，例如，較大的珠可由較大的孔保留，而較小的珠可由較小的孔保留。例 如，如圖22A中所闡釋，展示了具有分別保持3和6Mm直徑的珠的2.IMm珠孔360A和5. 6Mm 珠孔360B的硅酮芯片設計簡圖。在此芯片設計中，較小的硅酮孔擴張以接受稍微較大直徑 的珠，但較小的珠不可保留在較大直徑的珠孔中。外面的輪廓線指示在各珠孔周圍的反應 孔幾何構型。圖22B為展示僅裝載了 3Mm珠的芯片的熒光顯微術圖像。圖22C為展示裝載 了 3和6Mm珠混合物的芯片的圖像，并闡釋基于大小編碼優先裝載珠入具體孔中的能力。 [0065] 此外，在一些實施方案中，可通過在固體反應孔中使用固體支持體將反應隔離成 多個較小的體積例如以減少引物二聚體而充分減少非特異性的"寄生"反應。使用這些原 理將反應分割成多個較小的反應可適用于許多不同反應。通過使用依據一些實施方案的珠 10來多重化，通常并不需要形成乳液（例如與乳液PCR-起使用的）以實現反應分割。乳 液可增加制備的復雜性和/或花費，限制反應體積的范圍和需要具有形成乳液傾向的化學 物類。
[0066] 此外，應該理解的是，可將本文所描述的一些或所有過程例如使用泵、閥、光學成 像裝置等自動化。
[0067] 本發明實施方案現將關于以下非限定實施例來描述。
[0068] 實施例1 在標準200PLPCR-級聚丙烯管中，以1〇μ?總反應體積，用珠集合來進行PCR，所述珠 集合包含針對金黃色葡萄球菌在甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA)中發現的mecA基因 和從IDT(Coralville,IA)購買的變異鏈球菌（SirepiococciAsSMZiafl1S)且鍵合至鏈霉親 和素涂覆的珠（BangsLaboratories,Inc.，產品號PMS3N/10098)的生物素化引物序列。 使用兩種不同濃度的珠：一種含有2. 5Pg珠（約60nM當量的引物濃度）和一種含有5Pg 珠（約120nM引物濃度）。將來自各種類的大約300-400拷貝的純化gDNA添加至對應的 反應管。將含有除引物外的PCR所需的所有試劑的PCR主混合物加入并且讓管熱循環50個 循環。圖6展示了使用AgilentBioanalyzer2100,應用DNA1000試劑盒對上清液進行的 后續分析。各分析物的第一道展示含有2. 5Pg珠的PCR反應的結果，而第二道展示來自含 有5Pg珠的反應的結果。空白也針對各珠濃度跑膠。對于甲氧西林易感性金黃色葡萄球 菌（MSSA)和MRSA空白反應，引物二聚體（通常指示高引物濃度）是明顯的。降低珠的量 至2. 5Pg為這些反應消除二聚體形成。對在2. 5Pg珠濃度下含有針對MSSA和MRSA的模 板DNA以及在5-Pg珠濃度下含有針對變異鏈球菌的模板DNA的管看到了強擴增子帶。二 聚體在含有模板DNA的樣品中在任一珠濃度下都不明顯。這些結果表明了可如何將引物附 接至珠，遞送至反應孔并隨后在裂解操作后參與特異性PCR擴增反應。
[0069] 圖2-3的裝置50用于按已知圖案將珠放置入特定的孔60(S卩，確定性裝載）。相 對于在單一孔中的多重化反應，各反應是一元的，因此嵌入染料可用于檢測，與需要帶有不 同熒光團的多個引物/探針集合的傳統多重化PCR相比極大地降低優化的時間。針對不同 測定而重新配置或并入新的珠集合可簡單地通過替換珠集合或添加更多反應孔至芯片或 裝置50來實現。
[0070] 手工進行轉移液體到裝置50上，然而應該理解的是，液體處理可容易地自動化。 可使用簡單的試劑分配技術將帶有獨特引物的預先標記的珠裝載入單一孔60中。允許溶 液變干，將珠留置在AOM68 (或其他固相提取表面或材料）的表面上。
[0071] 樣品可通過加熱、添加試劑、離心、酶消化或其他方法預處理。將樣品分配入已經 含有預裝引物珠的各個孔60中并將真空施加在廢液池或通道66處以牽引樣品流體通過 AOM68來將分析物俘獲到AOM上。隨后可將洗滌緩沖液分配入反應孔60并且如需要通過 施加到通道66處的真空除去。因為引物錨定于珠，它們不會在這些樣品清除步驟期間被洗 掉。在樣品清除之后，將含有除引物之外PCR所需的所有試劑的PCR主混合物添加到所有 反應孔60中并熱循環裝置50。由于主混合物不含模板特異性引物，相同的主混合物可在所 有反應中使用。在PCR期間用于變性DNA的升高的溫度也變性鏈霉親和素，引起在第一個 rt-PCR循環期間后續釋放生物素化的引物，從而啟動靶標DNA的擴增。釋放的引物自由地 與在反應孔中的靶標DNA相互作用，無論在啟始PCR之前靶標DNA是否直接與在珠上的引 物雜交。除鏈霉親和素-生物素之外的偶聯化學可用于一些實施方案，包括使用可用熱、鍵 的化學誘導變化或光誘導變化而裂解的化學鍵來附接引物至珠。因為引物自由地被釋放入 在反應孔60中所容納的溶液中，所以由固相提取膜68 (例如Α0Μ)所捕獲的非雜交DNA和 雙鏈DNA(dsDNA)容易被檢測到。因此，可對單鏈（ssDNA)和dsDNA二者實施快速的樣品清 除而無需在將樣品DNA直接雜交到結合在珠上的低聚體之前，將dsDNA轉變為ssDNA通常 所需的變性步驟。由于引物被附接至珠上，在一些實施方案中，DNA可用AOM提取而不會將 其洗掉，隨后釋放引物到溶液中允許進行擴增/檢測提取的DNA的PCR。AOM可允許快速的 樣品清除。DNA提取也可通過將靶標ssDNA與偶聯到珠上的引物雜交或將靶標DNA吸附于 珠的表面來實施。
[0072] 盡管上述實施例關于PCR反應來論述，但應該理解的是，相似的程序可用于任何 合適的反應，例如：任何核酸轉錄和/或擴增相關的反應、其中也將熒光底物結合于支持 體表面的酶聯免疫吸附測定（ELISA)、其中也將熒光底物結合于支持體表面的單分子陣列 (SiMoA)、其中使用多個珠以遞送用于組合化學的不同試劑的反應、其中珠遞送催化劑試劑 的反應和/或其中"點擊"化學試劑以通過隨機珠裝載所確定的化學計量遞送的反應。
[0073] 使用rt-PCR芯片例如圖2-3的裝置50來測試系統，圖中微流體部分66由PDMS構 成，而基底62由玻璃構成。將用正向PCR引物標記的珠集合與用反向PCR引物標記的珠集 合按1:1的比率在反應孔1_3(圖7)中混合。將附接有正向和反向引物的珠集合的l-μ?等 分試樣（含有約10呢珠）加入至孔4-6 (圖7)的每孔中。將基因組DNA以10μ?體積添加 至孔1-6,該體積遞送了合計300-400拷貝模板DNA至各孔中。施加真空于廢液池上直至孔 干燥。隨后將含有0.28個單位的PlatinumTaqDNA聚合酶（Invitrogen,Carlsbad,CA)、 IXPlatinumqPCRSupermix-UDG(Invitrogen,Carlsbad,CA)、1%BlockerBSA(Thermo Scientific,Rockford,IL)和IXSYBRGreen的5KL主混合物添加至各孔中。不添加 另外的引物。將PDMS預聚物加入廢液池中以密封它。將裝置50從66°C至95°C熱循環60 個循環，并且在每個循環結束時采集熒光圖像。
[0074] 圖7展示了在第50個擴增循環后rt-PCR芯片的扣除本底的熒光顯微術圖像。將 扣除本底的圖像集合用于推算來自SYBRGreen嵌入染料的平均信號強度。圖8為源自各 孔的擴增曲線的圖。循環閾（Ct)值(其中擴增首次明顯）對于所有反應孔是一致的。此實 驗證明可使用此技術來實施成功的可再現的芯片內rt-PCR。其中在單一反應中將兩種引物 的混合物附接至珠的單一珠集合與其中僅將正向引物附接至一個珠集合且僅將反向引物 附接至另一珠集合的兩個珠集合的混合物之間沒有可辨識的差異。預裝的生物素化的引物 在樣品清除步驟期間保持穩固地附接至珠上，但在PCR期間釋放入溶液中，并證明成功擴 增模板序列。
[0075]實施例2 圖9-11的裝置200使用光刻法由硅基底（基底220)和玻璃基底（基底210)制得。硅 薄片使用磁控溉射用5nm的鈦（Ti)和100nm的金（Au)來涂覆。將金屬化的薄片用正性 光刻膠涂覆并用光刻法圖案化以便露出50MmX50Mm或IOOMmXIOOMm正方形區域的陣列。 Au層通過用王水處理而從露出區域除去，留下一層十分親水的氧化鈦。將基底用1-十八 燒硫醇（octadecanethiol)處理以僅在Au表面形成十分疏水的自組裝單層。（硫醇例如 1-十八烷硫醇與Au,但不與氧化鈦形成強鍵）。
[0076] 通過用含有染料的水性緩沖液覆蓋它來用僅薄片側（即敞開的且無玻璃的）進行 初始測試。讓礦物油輕輕地流過表面，并將大多數水相推下金-烷基硫醇表面。水性緩沖 液的小液滴留在其中Au已經被去除的區域。在薄片上被各個小液滴所覆蓋的區域由圖案 充分界定，但小液滴的高度（并因此，體積）變化極大。
[0077] 制造帶有圖案化的玻璃蓋或基底210的微流體裝置200以更好地控制小液滴的 大小（圖9-11)。硅薄片按如上面所述制作，但Imm寬和9-25Mm高的光刻圖案化邊界用 基于環氧樹脂的負性光刻膠（KMPR1010,MicrochemCorp.，Newton，MA)制得。將玻璃基底 用5nm的Ti和20nm的Au涂層。將Au通過光刻法除去以留出與在硅基底220上的對應 的正方形（區域224)互補的親水的正方形陣列（區域214)(圖9)。通孔或孔口 240是使 用研磨粉噴射打穿玻璃基底210而得。使用Finetech芯片焊接機（FINEPLACER，Berlin， Germany)將玻璃基底210對齊到硅基底上和使用環氧樹脂（LOCTITEHysolE-120HP)永久 粘合。圖10展示了所述對齊的示意圖，而圖11展示了芯片的橫切面的示圖。在玻璃上的 金屬薄膜在這些厚度下幾乎透明，使得有可能對齊和光學探尋疏水區域。在十八烷硫醇飽 和的乙醇中處理達彡12小時后，將芯片用純乙醇漂洗并隨后干燥儲存。
[0078] 備選的用于圖案化基底210、220上的金屬薄膜的方法可用于形成親水的和疏水 的區域，包括用光刻膠對基底圖案化并隨后用發射和/或多種濺射技術例如氬離子濺射來 金屬沉積。出于形成親水和疏水動機的另外的技術對本領域技術人員會是容易地顯而易見 的。
[0079] 將芯片設計為包含負性光刻膠的網格或"道"250以將陣列隔開成分隔區域以便可 更好地調節不可混溶相的流動（圖12-13)。制作與前述相似，而芯片的道和外邊界在光刻 法的相同步驟期間圖案化。將Au從以下區域除去，所述區域中由于烷基硫醇處理在延長處 理后引起從Au上抗蝕涂層剝離，光刻膠被圖案化。如先前所述加入染料溶液以填充芯片。 隨后加入礦物油并使用真空以牽引它通過芯片。如在圖14中可見，小液滴由填充空隙空間 (在基底上由疏水區域所界定）的礦物油隔離。觀察到少許小的偏離的小液滴，但很少至沒 有觀察到在孔之間的橋接。小液滴的大多數顯示相似且規則的形態。
[0080] 具有440個計量IOOMmXIOOMm的反應區的裝置使用25Mm或7. 5Mm高的KMPR邊 界來制作以形成250pL或75pL的反應體積。也制作并測試了摻有1，500個各自在相同 的總面積內的具有22. 5pL體積的反應孔（9Mm高的KMPR的5〇MmX5〇Mm墊）的更高密度 的陣列。圖15A-15C展示了三個填充包含熒光素染料的水性緩沖液的芯片。將水溶液按 2.5-5PL小液滴加入一個通孔，而將真空施加在另一通孔以填充芯片。在用緩沖液填充之 后，將礦物油加入通孔并牽引通過芯片。礦物油浸濕Au/烷基硫醇表面，迫使水溶液從芯片 大部分區域上離開，留下處于界定的親水反應區的隔離開的小液滴。填充/小液滴隔離過 程可為非常快速的，其通常僅需要約2分鐘或更少以界定隔離的反應孔。
[0081] 芯片在rt-PCR和數字PCR實驗中的應用 將使用250nM的自由溶液引物的數字PCR用于驗證在單一靶標分子水平下在22. 5pL反應（每個芯片1，500個）中的芯片性能。圖16A-16C展示了 0. 7、0. 2和0. 04拷貝的模 板DNA/孔（標稱濃度）的結果。在總共1，500個孔中，指示存在至少一個靶標拷貝的陽性 命中分別總計約1100個（73%)、360個（24%)和140個（9%)。在樣品制備期間允許亞微升 體積的移液誤差的情況下，假定孔之間泊松分布，I. 3、0. 27和0. 094拷貝/孔的計算濃度相 當地接近標稱濃度。應該注意到的是，盡管該系統并沒有針對快速熱循環而優化，但對單一 拷貝DNA的檢測在小于20分鐘之內完成。通過增強對多種參數的優化可獲得更短的循環 時間。
[0082] 為了高取樣效率和高珠孔占用率使用磁體來裝載珠的實證 一些芯片設計可使用玻璃和硅組分來將樣品和試劑分配入隔離的反應孔，但這些元件 可用塑料的類似結構和表面化學中復制，例如高容量可制造的單片多聚體裝置。
[0083] 盡管已經觀察到基于重力的裝載導致3. 28-Mffl直徑的磁性引物涂覆的珠對硅和 玻璃芯片設計>55%占用率，但全部珠群體的取樣效率是低的（〈1%)。為實現通過與珠上的 引物雜交來對稀有靶標序列取樣，在此處定義為意指裝載入珠孔中的珠總數除以與樣品孵 育的漿液中的珠總數的取樣效率應該盡可能高。修改珠孔幾何構型并使用合適的封閉緩沖 液顯示出明顯改善使用磁性裝載的珠取樣效率和占用率。對珠進行磁性操作可極大地加速 將珠遞送至珠孔，但可以是成問題的，原因是珠沿著磁場線呈鏈狀對齊，所述鏈在非優化的 幾何構型中導致多重裝載，如其中磁性裝載不成功的新近的文章中所注意到的。[Kan,C. W.等人LabonaChip, 2012，12，5，第 977-985 頁]。
[0084] 將DRIE用于將具有4. 4、5. 7和7.OMm深度、直徑大小范圍從2. 5至5. 4Mm的的珠 孔陣列制作于Si薄片中。將薄片切割為各自具有3-4個陣列的區域。將StartingBlock PBS緩沖液（ThermoScientific)用于封閉陣列并防止珠吸附（目前，因芯片內觀察到的 PCR抑制問題所致而使用0· 5%BSA而非StartingBlock)。將等分試樣的珠（約15, 000) 放置在陣列的一側，并在用顯微鏡觀察珠同時沿著硅的背面平移磁體以拖拽珠到珠孔的陣 列之上。在牽引珠經過相當多孔后，通常將陣列用去離子水洗滌，用約5nm的Au/Pd濺射 涂覆并用SEM成像。大多數蝕刻至4. 4Mm深的陣列在劇烈洗滌后展示弱至中等的對珠的 保留，但是在更柔和地洗滌下保留應該是可接受的。蝕刻至7.0Mm深的陣列當通過SEM檢 查時顯示許多雙重珠裝載的情況。雖然對于3. 5Mm直徑的珠孔觀察到了好的保留，但在取 得可觀的裝載之前需要多次在陣列上通過。蝕刻至5. 7Mm深度和具有4.1Mm直徑的陣列 (圖17A-17B)裝載迅速并顯示好的珠保留。由此幾何構型的珠孔制成的芯片可裝載<15k 珠并通常展示在洗滌后80%至>90%的珠占用率，產生>8-10%的取樣效率。圖18A-18D展 示了在裝載過程中采集的一系列圖像。當在陣列上移動熒光珠的亮團時，珠從亮團上沉積 入孔中。在裝載之后用緩沖液洗滌除去大多數松動的珠，使多數孔裝載單一珠。可通過將 孔深度降低至在4. 5和5. 7Mm之間的值來進一步減少稀有的雙重裝載情況。據觀察>10k 的珠的群體與較小的珠的群體相比可更快地轉移；因此，可隨著珠孔的數量增加而改善取 樣效率。加強優化磁體幾何構型和磁體移動自動化可進一步改善占用率和最小化裝載時 間。在一些實施方案中，珠與孔或容納區域的多種比率可用于改善珠的容納。例如，目前相 信，當珠具有d的直徑時，固體支持體容納區域具有這樣的圓柱形，該圓柱形具有I. 05d至 I. 55d的直徑和1. 2d至I. 8d的深度。當如本文所描述使用磁珠裝載時，此比率可尤其有 益。此外，此比率可用于任何合適的珠的陣列裝載應用或裝置，例如SiMoA。
[0085] 通過降低反應體積來降低二聚體形成 完成針對三種靶標的生物素化的引物集合的測試并研究當將主混合物的總體積分成 較小的隔離開的反應物時對引物二聚體形成的作用。大規模平行空間多重化可需要對所有 引物集合兼容的熱循環程序。雖然在聚丙烯PCR管中以常規體積（5-10μι)在低退火溫度 下進行PCR時通常注意到形成針對nuc、變異鏈球菌和mecA引物集合的明顯的引物二聚體， 但也已觀察到芯片內以較小的體積時降低的引物二聚體的形成。雖然可能這些觀察可以是 因表面相互作用的差異所致，但備選的解釋可為：盡管引物的濃度保持相同，然而在特定反 應中引物分子的總數（以及因此放大非特異性相互作用的可能性）隨著總引物群體的減少 而減少。此外，在合成期間形成的在純化中沒有除去的痕量的畸形引物也可引起非特異性 擴增。分割反應使得這些雜質的在任何特定反應中的出現率非常低，會減少這些非特異性 反應的情況。據預期，用于單一珠反應的極大減少的體積（標準的10μ?反應的數百萬分之 一至數千分之一）將允許使用因在低退火溫度下在一些集合中形成引物二聚體所致而目 前在常規體積的反應中不可兼容的引物集合。減少引物設計制約的能力可極大地改善此技 術的可用性并極大地加速重新配置以包含用于檢測新出現的疾病的新的靶標序列。通常， 二聚體形成為稀有事件，但當它發生時它被擴增并遍及整個反應體積分布。當將特定體積 的PCR主混合物分隔到許多隔離開的孔中時，二聚體形成的稀有情況（或痕量的雜質）被 有效地隔離在許多小反應體積之一中，而大多數反應保持不受影響。
[0086]表1.反應體積和二聚體發生
【權利要求】
1. 一種微流體裝置，其包含： 多個反應孔； 多個固體支持體，每一個固體支持體具有附接至其上的試劑，其中所述試劑通過不穩 定的試劑/支持體鍵而附接至固體支持體以便將所述試劑配置以通過裂解操作而從支持 體上裂解。
2. 權利要求1的微流體裝置，其中所述裂解操作包括：熱力操作、添加化學品、添加 酶、應用電勢和/或應用光和/或電離輻射至試劑/支持體鍵。
3. 權利要求1-2的任一項的微流體裝置，其中所述試劑包含用于核酸轉錄和/或擴增 反應的核酸序列。
4. 權利要求3的微流體裝置，其中所述試劑包含用于PCR反應的DNA引物或探針。
5. 權利要求4的微流體裝置，其中所述不穩定的試劑/支持體鍵包含鏈霉親和素-生 物素鍵和/或抗生物素蛋白-生物素鍵。
6. 權利要求5的微流體裝置，其中所述裂解操作包含熱力操作。
7. 權利要求6的微流體裝置，其中將所述鏈霉親和素-生物素鍵配置用以當在約 50-99 °C下孵育固體支持體時從支持體上釋放試劑。
8. 權利要求1-7任一項的微流體裝置，其中所述固體支持體為微珠。
9. 權利要求1-8任一項的微流體裝置，其中所述微珠為磁性的。
10. 權利要求1-9任一項的微流體裝置，其中所述固體支持體包含配置以鑒別固體支 持體和/或試劑的特性的標記。
11. 權利要求10的微流體裝置，其中所述標記包括預定的支持體形狀、預定的支持體 大小、支持體的磁性性質和/或光學性質。
12. 權利要求10的微流體裝置，其中所述標記包括熒光標記。
13. 權利要求1-12的任一項的微流體裝置，其中將所述多個孔和多個固體支持體調 整大小并配置以便僅將單個的所述多個固體支持體保留在對應的單個的所述多個孔中。
14. 權利要求13的微流體裝置，其中所述多個孔包含固體支持體容納區域和反應區， 并且將所述固體支持體容納區域配置以容納單個所述多個固體支持體。
15. 權利要求14的微流體裝置，其中所述固體支持體容納區域具有與單個所述多個 固體支持體的大小和/或形狀基本上對應的橫截面積并配置所述固體支持體容納區域以 便反應在固體支持體容納區域和/或反應區中發生。
16. 權利要求14的微流體裝置，其中所述多個固體支持體包括第一多個固體支持體 和具有與第一多個固體支持體不同的大小和/或形狀的第二多個固體支持體，并且所述固 體支持體容納區域至少包括配置以優先保留所述第一多個固體支持體的第一多個固體支 持體容納區域和配置以優先保留所述第二多個固體支持體的第二多個固體支持體容納區 域。
17. 權利要求14的微流體裝置，其中所述固體支持體容納區域具有約3. 5-5. OMffl的直 徑和約4. 0-6. OMm的深度。
18. 權利要求17的微流體裝置，其中所述多個固體支持體具有約2. 0-約3. 5Mm的直 徑。
19. 權利要求14的微流體裝置，其中所述多個固體支持體具有直徑d，而所述固體支 持體容納區域擁有具有1. 〇5d-l. 55d的直徑和1. 2d-l. 8d深度的圓柱形。
20. 權利要求16的微流體裝置，其中所述反應區具有大于固體支持體容納區域的橫 截面積的橫截面積。
21. 權利要求14-20任一項的微流體裝置，其中所述微流體裝置包含密封件（彈性膜， 例如聚二甲基硅氧烷）或不可混溶的流體以流體性隔離各個所述多個孔。
22. 權利要求1-21任一項的微流體裝置，其中所述微流體裝置在孔中包括膜。
23. 權利要求22的微流體裝置，其中所述膜包括提取膜。
24. 權利要求23的微流體裝置，其中所述膜包括單片氧化鋁膜。
25. 權利要求22-24任一項的微流體裝置，其另外包括連接至膜的通道，其配置用以 提供通過膜與所述多個孔的流體連接。
26. 權利要求1的微流體裝置，其中將所述孔配置以容納多個支持體。
27. 權利要求22-24任一項的微流體裝置，其另外包括在膜和通道之間圖案化的微柱 以支撐膜但允許來自所述多個孔的經由膜的均勻流體流動。
28. 權利要求1-27任一項的微流體裝置，其中將所述試劑配置以從所述多個孔之一 中的多個珠釋放而實現試劑之間的反應。
29. 權利要求28的微流體裝置，其中將所述試劑配置以從所述多個孔之一中的多個 珠釋放且為設計以實現從較小的化學單位形成較大的分子的"點擊化學"試劑。
30. 權利要求1-20任一項的微流體裝置，其另外包括含有所述多個反應孔的基底，其 中所述基底包括圖案化的親水和疏水區域，并且所述多個反應孔在親水區域或疏水區域之 一上。
31. 權利要求30的微流體裝置，其中所述基底包括第一基底，所述裝置另外包括第二 基底，所述第二基底經間隙與第一基底間隔開并具有面向第一基底上圖案化的交替的親水 和疏水區域且與之對齊的對應的圖案化的交替的親水和疏水區域。
32. 權利要求31的微流體裝置，其中將所述裝置配置以便當將水性流體放置在第一 和第二基底之間的間隙中并隨后將非水性流體放置在第一和第二基底之間的間隙中時，水 性流體形成由在第一和第二基底之間的非水性流體所隔離的小液滴。
33. 權利要求30-32任一項的微流體裝置，其中所述疏水和親水區域包括在第一和第 二基底上的圖案化的金屬層（金或其它合適的金屬）之上的圖案化的自組裝單層。
34. 權利要求30-33任一項的微流體裝置，其中應用至第一和/或第二基底的電勢差 實現電化學反應和/或通過在所述多個反應孔中的電化學反應產生化學物類，所述電化學 反應包括但不限于從固體支持體裂解試劑。
35. 權利要求30-33任一項的微流體裝置，其中施加至第一和/或第二基底上的直流 或交流電流產生誘導化學反應的焦耳加熱，所述化學反應包括但不限于從固體支持體裂解 試劑。
36. -種微流體裝置，其包括： 具有圖案化的親水和疏水區域的第一基底，其中親水區域或疏水區域之一在其中具有 多個孔；和 經間隙與第一基底間隔開的第二基底，所述第二基底具有與所述第一基底的圖案化的 親水和疏水區域對齊的對應的圖案化的親水和疏水區域。
37. 權利要求36的微流體裝置，其另外包括：在所述多個反應孔中的多個固體支持 體，每一個固體支持體具有附接至其上的試劑，其中所述試劑通過不穩定的試劑/支持體 鍵而附接至固體支持體以便將所述試劑配置以通過裂解操作而從支持體上裂解。
38. 權利要求36的微流體裝置，其中第一或第二基底之一另外包括多個固體支持體 容納區域，所述多個固體支持體具有直徑d，而固體支持體容納區域擁有具有1. 05d-l. 55d 的直徑和1. 2d-l. 8d的深度的圓柱形。
39. -種珠陣列裝置，其包括： 具有經調節大小和配置以俘獲多個具有直徑d的固體支持體的多個固體支持體容納 區域的基底，所述固體支持體容納區域擁有具有1. 〇5d-l. 55d的直徑和1. 2d-l. 8d的深度 的圓柱形。
40. -種用于向微流體裝置提供試劑的方法，所述裝置包括多個反應孔，所述方法包 括： 提供在所述多個反應孔中的多個固體支持體，每一個固體支持體具有附接至其上的試 劑以便所述試劑通過不穩定的試劑/支持體鍵而附接至固體支持體并且將所述試劑配置 以通過裂解操作而從支持體上裂解；和 進行裂解操作以釋放試劑至所述多個反應孔中的溶液中。
41. 權利要求40的方法，其中所述多個固體支持體至少包括具有附接至其上的第一 試劑的第一多個固體支持體和具有附接至其上的第二試劑的第二多個固體支持體，其中所 述第一和第二多個固體支持體另外包括配置以鑒別固體支持體和/或試劑的性質的各自 的第一和第二標記。
42. 權利要求41的方法，其另外包括通過鑒定各個所述多個反應孔是否被第一多個 固體支持體或第二多個固體支持體占據來解碼所述裝置。
43. 權利要求42的方法，其中解碼所述裝置包括鑒定所述多個固體支持體的第一和 第二標記。
44. 使用權利要求1-39任一項的微流體裝置中的試劑來實施反應的方法。
【文檔編號】G01N35/08GK104508492SQ201380039315
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2012年5月25日
【發明者】M. 拉姆齊 J., 亨利 W., 奧布拉思 E. 申請人:北卡羅來納-查佩爾山大學