用于分析核酸序列的組件和方法
【專利摘要】本發明涉及借助所謂的合成測序法分析核酸序列的組件和方法。根據本發明，檢測在核苷酸與待測序的核酸序列結合的過程中釋放的化學物質群。借助于噴霧裝置將試劑施加至檢測所釋放的物質群的傳感器。這樣做的優勢在于，不會發生橫向流動。假陰性和假陽性結果的比例得以顯著降低。此外，少量的試劑就足以浸潤所述傳感器。就流動室而言不必要充填輸送管道和排放管道。
【專利說明】用于分析核酸序列的組件和方法
[0001]本發明涉及通過所謂的合成測序法(sequencing-by-synthesis)分析核酸序列的組件和方法。
[0002]在“下一代測序技術”(NGS) ( “next generat1n sequencing”)的領域中主要追求兩個目的。第一，應顯著縮短分析的持續時間。這應使分析人類基因組的價格低于1000美元。第二，應保持所獲得的數據的質量或者進而在進行快速分析的同時進一步改進數據的質量。
[0003]所述NGS方法包括合成測序(sequencing-by-synthesis),例如焦磷酸測序(pyrosequencing)和“離子半導體測序”(“ 1n semiconductor sequencing，，)。
[0004]焦磷酸測序的基礎是在DNA鏈中納入核苷酸。提供作為結合至微球(或“微珠”)的單鏈形式的待測序的DNA并將其用作模板。一個接一個地加入四種類型的核苷酸。當添加匹配模板的核苷酸時，通過DNA聚合酶會釋放焦磷酸(鹽)(pyrophosphate)。這導致了由酶級聯而觸發的閃光，其可以光學的方式被檢測到。為了能平行分析，將微球布置在陣列中的微凹部(micro-depress1ns)或“微孔”中。然后分析各個孔的光學信號。
[0005]離子半導體測序法也是基于核苷酸的納入。質子的釋放表明DNA矩陣(matrix)鏈中成功地納入了核苷酸。為此，具體地，使用化學敏感場效應晶體管(chemicallysensitive field effect transistors) (chemFETs)(其也被稱為離子選擇性場效應晶體管(1n-selective field effect transistors) (ISFETs))來測量 pH 值。
[0006]US 2009/0026082 Al則結合了這兩種方法。在該過程中，將具有DNA單鏈的微球布置在凹部。借助于由chemFET測得的pH值來檢測各個核酸的裝配(installat1n)。
[0007]所述測序技術需要大量的不同試劑，其被相繼輸送至相應的分析單元。這些試劑特別包括四種類型的核苷酸中的一種或核苷三磷酸(NTP)。試劑的進料通常在流動室(flow cells)中進行。此處發生的試劑在傳感器陣列上方的橫向流動對焦磷酸(鹽)(pyrophosphate)物質群或所釋放的質子是不利的。這些物質可以在流動方向上從第一凹部流向第二凹部并在那里導致假陽性的結果。此外，由于橫向的流動，在第一凹部形成了測試組分的濃度的降低，這導致了假陰性的結果。質子擴散遠離chemFET也會導致極低的pH值變化并且會不利地導致假陰性的結果。此外，不利的是，由于極小的測量效果，使得對均聚物的分辨率不足。此處的均聚物指的是類型相同的幾個核苷酸附著在一起。
[0008]上述測序技術的另一缺點是試劑的高使用率。這是因為必須將每種新的試劑充滿包括所有輸送管道和排放管道的流動室的整個體積。此外，陣列上方的液體層的厚度必須為約100 μ m以使新的試劑能夠被輸送至陣列中所有的凹部。
[0009]本發明的目的是提供克服上述缺點的用于分析核酸序列的組件和方法。
[0010]與組件相關的這一目的是通過權利要求1所述的組件來實現的。與方法相關的目的是通過具有權利要求10的特征的方法來實現的。從屬權利要求涉及本發明的優選的實施方式。
[0011 ] 根據本發明的組件被設計用來通過所謂的合成測序法分析核酸序列。在通過合成的核酸序列的測序中，檢測在核苷酸與待測序的核酸序列結合的過程中釋放的化學物質群。為此，該組件包括用于檢測所釋放的物質群的傳感器。最后，該組件包括用于將試劑施加至該傳感器的噴霧裝置(spraying device)。
[0012]在本發明的通過合成測序法分析核酸序列的方法中，將至少一種試劑施加至該傳感器。以將試劑噴霧到所述傳感器上的方式來施加試劑。
[0013]在該組件和該方法中，有利的是不會發生橫向流動。因此，有利的是減少了假陰性和假陽性的結果。因此，獲得了更大的測量效果從而改善了均聚物的分析。此外，少量的試劑就足以完全浸潤傳感器。傳感器上試劑的液體層的厚度優選為I μ Π1。另外，對于流動室來說無需充填輸送管道和排放管道。這也有利地減少了試劑的使用。
[0014]在本發明優選的發展和構造中，組件包括被設置成可相對于所述噴霧裝置旋轉的傳感器支架。將傳感器牢靠地連接在所述傳感器支架上。有利的是，甚至通過旋轉傳感器支架來實現傳感器的浸潤。此外，通過高速的旋轉可將過量的試劑，特別是清洗液運送至傳感器支架的外邊緣。優選地，在施加含核苷酸的試劑期間不旋轉或僅是緩慢地旋轉所述傳感器支架。由此，有利地防止了橫向流動。有利的是，在傳感器支架中可內置電子裝置，其接收來自于所述傳感器的電子的傳感信號并將它們傳遞至外部的測量值記錄系統。
[0015]所述傳感器被適當地集成進芯片中。
[0016]在本發明另一有利的實施方式和發展中，傳感器為離子選擇性場效應晶體管(ISFET)。由此，在合成期間可以檢測所釋放的質子。在進行分析之前，將待測序的核酸序列連同引物一起施加至ISFET。此外，將用于核酸合成的酶加入待測序的核酸序列中。在核酸序列為DNA的情況下，例如添加DNA聚合酶。在其它核酸序列的情況下，添加相應的合成酶。可替代地或額外地，可使用測量化學發光光信號(chemiluminescence light signal)的傳感器。優選地，所述傳感器測量由以焦磷酸(鹽)的釋放為基礎的酶級聯產生的光信號。
[0017]在本發明又一有利的實施方式和發展中，組件包括兩個傳感器。因此，有利的是可同時進行多個測量，從而可實施眾多序列的快速、平行的檢測。有利地，在一個操作中同時對兩個傳感器進行試劑的噴霧。優選將傳感器布置在傳感器陣列中。
[0018]在本發明另一有利的實施方式和發展中，在每兩個傳感器之間布置疏水的邊界層。該疏水邊界層用作傳感器上試劑的隔離。由此，有利地防止了相鄰排列的傳感器上的試劑的交錯(running together)。此外,有利地避免了將待測序的核酸布置在微孔中。
[0019]在本發明又一有利的實施方式和發展中，疏水邊界層包括金屬，特別是金。
[0020]在本發明另一有利的實施方式和發展中，疏水邊界層為用于離子選擇性場效應晶體管的參比電極(reference electrode)。有利的是，隨后布置所述參比電極使其在空間上接近傳感器。因此，在傳感器和參比電極之間僅產生小的電阻，從而有利地降低了信號噪曰?
[0021]在本發明又一有利的實施方式和發展中，噴霧裝置為超聲波霧化器(ultrasonicatomizer)。有利的是，由此可實現小于Iym的霧滴尺寸(droplet sizes)。
[0022]在本發明另一有利的實施方式和發展中，試劑是含核苷酸的溶液、清洗液或保護液。有利的是，在用于分析核酸序列的方法中首先將含核苷酸的溶液，特別是dNTP溶液施加至傳感器。該溶液僅含一種類型的核苷酸。在施加含核苷酸的溶液期間可緩慢地旋轉傳感器支架。有利地是，施加核苷酸溶液的方式使得在每個傳感器上形成與其相鄰的傳感器局部分離的液體體積，并且所述液體體積在傳感器和參比電極的邊緣之間形成電化學接觸。如果待測序的核酸序列納入所述核苷酸，那么之后就產生了質子。這些質子僅在各自的傳感器中產生信號。從而有利地防止質子從第一傳感器向第二傳感器轉移(carry-over)。在接受信號之后，優選顯著增加旋轉速度并將通常體積大于核苷酸溶液的清洗液噴霧至傳感器并離心(spun off)。清洗液通常為能完全除去第一溶液中存在的核苷酸的類型。旋轉傳感器支架直至清洗液幾乎全干。隨后，將作為試劑的另一含核苷酸的溶液噴霧至傳感器。所述含核苷酸的溶液也只包含一種類型的核苷酸。隨后，再次通過清洗液除去含核苷酸的溶液。
[0023]可替代地，傳感器可設有保護液。所述液體包括水溶性成膜劑(water-solublefilm-forming agent),其有利地防止了所釋放的物質群在測序期間的橫向擴散。
[0024]在本發明另一有利的實施方式和發展中，將所述試劑作為氣溶膠噴霧在傳感器上。
[0025]通過參考在附圖中示出的示例性的實施方式將對本發明進行更詳細的描述。
[0026]圖1示出了使用ISFET傳感器和參比電極來分析核酸序列的組件的示意圖。
[0027]圖2示出了用于分析核酸序列的方法的示意圖。
[0028]圖3示出了使用ISFET傳感器和使用疏水邊界結構作為參比電極來分析核酸序列的組件的示意圖。
[0029]圖1示出了用于核酸合成的組件的示意圖。該組件包括超聲波霧化裝置1、微陣列芯片2、傳感器支架9和用于旋轉的電動機10。微陣列芯片2包括離子選擇性場效應晶體管(ISFETs)3、參比電極4和信號處理單元5。使用第一裝置6將所述微陣列芯片2固定至傳感器支架9。所述第一裝置優選為夾緊裝置(clamping device)。可替代地,可以通過負壓將所述微陣列芯片2固定至傳感器支架9。陣列的面積通常為Icm2，其中陣列優選包括多達1，000, 000個傳感器。傳感器支架9包括電源8和針對ISFETs 3的數據處理單元7。通過超聲波霧化裝置I將第一試劑11噴霧在微陣列芯片2上。所述第一試劑通常為清洗液。
[0030]由于使用相對大體積的清洗液，因此可替代的是以噴射的形式從噴嘴中噴霧所述清洗液。將第一試劑11噴霧至微陣列芯片2的同時旋轉電動機10。由于旋轉,第一試劑11均勻地分布在微陣列芯片2上。隨后增加轉速以將第一試劑11徑向甩出。通過改變旋轉速度可以設置所限定的干燥狀態。
[0031]圖2示意性地示出了用于操作分析核酸序列用的組件的方法。該組件對應于圖1所示的布置。所述微陣列芯片2還包括主動的ISFETs (active 1n-selective field effecttransistors) 18 和被動的(passive) ISFETs 19。主動的 ISFETs 18 包括含用于 DNA 合成的引物的DNA序列14。此外，使DNA聚合酶結合至待查的DNA序列14。所述微陣列芯片2優選包括主動的ISFETsl8。
[0032]在使用第一試劑11清洗微陣列芯片2并且接下來干燥所述微陣列芯片2之后，在下一步驟中將第二試劑13 (保護液)施加至微陣列芯片2。保護液通常為洗滌緩沖液，其含有增加粘度的物質，特別是成膜劑，例如聚乙烯卩比咯燒酮(polyvinylpyrrolidone)。設置電動機10的轉速使得含第二試劑13的第一層21優選具有I μ m的厚度。
[0033]如圖2中的A部分所示，將第三試劑12施加至含第二試劑13的第一層21。第三試劑12包括第一核苷酸類型(通常為腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鳥嘌呤，各自作為脫氧核苷三磷酸(dNTP))。此時，第三試劑12基本上垂直地細密分布在第一層21上。設置電動機10的轉速使得含第三試劑12的第二層20優選具有I μ m的厚度。
[0034]在施加第三試劑12之后將電動機10減速。第三試劑12在垂直于層平面的方向上均勻地擴散進第一層21中。由第二試劑13和第三試劑12形成了混合層15。這在圖2中的B部分被不出。
[0035]第三試劑12中的核苷酸可以與待查的DNA序列14連接。這在圖2中的C部分被示出。通過與引物14相匹配的核苷酸的連接(attachment)，質子被釋放。借助于ISFET傳感器可以測量質子的濃度。所測量的變量即為PH值。由于橫向的擴散被成膜劑所限制，從而在很大程度上防止了所釋放質子的轉移。在核苷酸順利地連接于引物14的情況下產生了信號16。
[0036]在信號處理之后，顯著增加旋轉速度并且再次施加作為第一試劑11的清洗液。由此，微陣列芯片2得以被液體或試劑清洗。可替代的是，通過超聲波霧化裝置I噴霧潮濕的空氣來清洗傳感器。
[0037]在接下來的步驟中，施加作為保護液的第二試劑13并且施加含第二核苷酸類型的第三試劑12。由于液體的垂直施加以及相關的橫向擴散的預防，因此不會發生轉移。
[0038]圖3示出了可替代的用于分析核酸序列的組件的示意圖。該組件包括用于霧化試劑的噴嘴裝置100、微陣列芯片2和用于旋轉的電動機10、信號處理單元5、電源8和數據處理單元7。微陣列芯片2包括場效應晶體管3。通過疏水邊界層17將各個ISFETs 3彼此分離開來。所述疏水邊界層17含金。因此它可以用作各個ISFETs 3的參比電極。微陣列芯片2還包括主動的ISFETsl8和被動的ISFETsl9。將含核苷酸的第三試劑12霧化在微陣列芯片2上。通過緩慢地旋轉傳感器支架9使得第三試劑分布在微陣列芯片2上。疏水邊界層17防止了多個ISFETs上的第三試劑12流淌到一起。所形成的霧滴具有約I μ m3的尺寸。
[0039]在待查的DNA14順利納入第三試劑12中的核苷酸的情況下，借由所釋放的質子產生信號16。在順利地處理完信號16之后，將作為清洗液的第一試劑11噴霧在微陣列芯片2上。通過高速旋轉，微陣列芯片2得以被第三試劑3清洗。在清洗完成之后(這可由pH信號來確定)，噴霧含另一核苷酸類型的第四試劑。以這種方式，使得快速的流程執行因短時噴霧(在秒的范圍內)而成為可能。
【權利要求】
1.一種借助所謂的合成測序法分析核酸序列的組件，其中能夠檢測在核苷酸與待測序的核酸序列(14)結合的過程中釋放的化學物質群，所述組件包括: -用于檢測所釋放的物質群的傳感器(3)和 -用于將試劑(11，12，13)施加至所述傳感器(3)的噴霧裝置(1，100)。
2.如權利要求1所述的組件，包括能夠相對于所述噴霧裝置(1，100)旋轉的傳感器支架(9)。
3.如前述權利要求中任一項所述的組件，其中將所述傳感器(3)集成進芯片(2)中。
4.如前述權利要求中任一項所述的組件，其中所述傳感器(3)為離子選擇性場效應晶體管(ISFETs) (3)。
5.如前述權利要求中任一項所述的組件，包括至少兩個傳感器(3)。
6.如權利要求5所述的組件，其中在兩個傳感器(3)之間布置疏水邊界層(17)。
7.如權利要求6所述的組件，其中所述疏水邊界層(17)包括金屬，特別是金。
8.如權利要求6或7所述的組件，其中所述疏水邊界層(17)為所述離子選擇性場效應晶體管(ISFETs) (3)的參比電極。
9.如前述權利要求中任一項所述的組件，其中所述噴霧裝置為超聲波霧化裝置(I)。
10.一種借助所謂的合成測序法分析核酸序列的方法，其中將至少一種試劑(11，12，13)施加至傳感器(3)，其特征在于，將所述試劑(11，12，13)噴霧在所述傳感器(3)上。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述試劑為含核苷酸的溶液、清洗液或保護液。
12.如權利要求10或11所述的方法，其中傳感器支架(9)相對于噴霧裝置(1，100)旋轉。
13.如權利要求10?12中任一項所述的方法，其中將所述試劑(11，12，13)作為氣溶膠噴霧在所述傳感器(3)上。
【文檔編號】G01N27/414GK104379767SQ201380032302
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年6月13日 優先權日:2012年6月18日
【發明者】W.岡布雷赫特, O.海登 申請人:西門子公司