Pc-o 42:4-一種用于內臟脂肪過多的生物標志物的制作方法
【專利摘要】本發明總體上涉及生物標志物領域。具體而言，本發明涉及生物標志物如PC-O 42:4，其可例如用于檢測和/或定量內臟脂肪過多和/或內臟脂肪過多的變化。該生物標志物也可以用于診斷受試者生活方式的改變對內臟脂肪過多的影響。
【專利說明】PC-ο42:4 一一種用于內臟脂肪過多的生物標志物
[0001] 本發明總體上涉及生物標志物領域。具體而言，本發明涉及生物標志物如1-0-烷 基-2-酰基甘油磷酸膽堿（PC-0)42:4,其可例如用于檢測和/或定量內臟脂肪過多(visceraladiposity)和/或內臟脂肪過多的變化。這種生物標志物也可用于診斷受試者 生活方式的改變對內臟脂肪過多的影響。
[0002] 過重和肥胖蔓延的持續攀升，尤其在兒童中的持續攀升使得解讀它們相關的基因 組和代謝組表型變成最大的公共健康挑戰之一。雖然營養不良和肥胖，如由身體質量指數 (BMI)定義的營養不良和肥胖，對預期壽命具有實質的警示，但是顯然BMI在評估身體組成 方面具有相當大的局限性并且對于評估疾病風險缺乏靈敏性（Dulloo,A.G.等人（2010) Int.J.Obes. (Lond) 34Suppl2,S4-17。Dullo等人最近綜述了與身體組成表型相關的健康 風險的概念的最新進展，包括（i)將BMI分割成脂肪質量（FM)指數（FM/H2)和無脂肪質量 (FFM)指數（FFM/H2)，（ii)將FFM分割成器官質量和骨骼肌質量，（iii)將FM分割成有害 脂肪和保護性脂肪，和（iv)在構成瘦體重質量的器官/組織的內部或者周圍的脂肪組織擴 展和異位脂肪沉著之間的相互作用（Dulloo，A.G.等人（2010)Int.J.Obes. (Lond) 34Suppl 2,S4-17)。
[0003] 在過去的數十年間，使用本領域技術的許多研究已經鑒定了與脂肪貯存和肥胖相 關的基因和轉錄因子（Viguerie，N.等人（2005)Diabetologia48,123-131 ;Viguerie， Ν·等人（2005)Biochimie87，117-123;Sorensen，T.I.等人（2006)PLoS.Clin.Trials1， el2 ;Klannemark，M.等人（1998)Diabetologia41,1516-1522 ;Clement，K.等人（2007) J.Intern.Med. 262,422-430)，與基因可遺傳性相關的基因和轉錄因子（Teran-Garcia， Μ·等人（2007)Appl.PhysiolNutr.Metab32,89-114)，并且已經提出人腸道微生物群對 肥胖發生率的影響（Backhed，F.等人（2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A104,979-984; Ley,R.等人（2006)Nature444,1022-1023 ;Turnbaugh，P.等人（2006)Nature444， 1027-1031)。
[0004] 但是，在相似的致肥環境和致糖尿病環境下，許多個體仍保持代謝健康和抵抗肥 胖相關的心血管疾病（CVD)風險。除了意識到與肥胖相關的疾病風險可能不是一律相同的 之外（Wildman，R.P.等人（2008)Arch.Intern.Med. 168,1617-1624)，越來越多數量的具有 正常體重的個體（身體質量指數，BMK25)表現出以前認為是過重和肥胖狀態特有的心代 謝異常。最近的證據表明了區域特異的（regio-specific)身體組成如何可能決定針對代謝 疾病的個體素質，其中身體脂肪和特別地內臟脂肪分布與心代謝疾病、糖尿病、高血壓、非 酒精的脂肪肝疾病和致死性的增加的風險相關。
[0005] 臨床上使用腰和臀測量監測內臟脂肪過多（例如，男人>0.9 ;和女人>0.85)，但是 這具有類似的局限性，尤其是在肥胖群體中。金標準成像技術，包括磁共振成像（MRI)和計 算機斷層掃描（CT)，現在對內臟脂肪庫產生了區域特異的和高精確的定量。但是，由于缺乏 非侵入性的、快速和可靠的生物標志物能用于流行病學研究和由于常規分析方法不適用于 代謝的整體分析的局限性，評估與內臟脂肪相關的代謝仍然特別具有挑戰性。
[0006] 過多的脂肪貯存在軀干部或男性樣的區域可能在代謝上比脂肪貯存在女性樣的 區域（gynoidarea)更不健康，其中胰島素抗性作為一個關鍵的原因機制。因此，患者層次 化對于個性化營養和治療管理是必須的，但是當受試者具有相似的腰臀比和獲得成像設施 受限時，這個應用受到了挑戰。因此，迫切需要允許以簡單和可靠的方式評估內臟脂肪的存 在、與內臟脂肪相關的代謝和/或其中的變化的生物標志物。
[0007] 本發明人致力于這種需要。
[0008] 因此，本發明的目的是改良現有技術并提供滿足本發明目的的和/或允許克服至 少一個當前現有技術的缺點的生物標志物。
[0009] 為了鑒定合適的生物標志物，發明人使用了代謝組學方法。
[0010] 當前認為代謝組學是表征代謝表型的一個已很好建立的體系方法，其包含多種因 素如環境、藥物、膳食、生活方式、遺傳學和微生物組因素的影響。不像表明生理學變化的潛 在可能性的基因表達和蛋白質組學數據，細胞、組織和器官內的代謝物和它們的動力學濃 度變化代表生理學調節進程的真正終點。
[0011] 近年來，基于代謝組學和脂類組學的發現加速了我們對疾病進程的理解，并且將 為防止和營養管理與代謝綜合征相關的亞臨床疾病提供新的途經。
[0012] 本發明人旨在提供區域特異的身體組成的綜合的代謝表型：內臟脂肪過多。這允 許鑒定內臟脂肪過多特異的生物標志物。
[0013] 在本研究中，于40個健康肥胖女人的組中使用多個代謝終點的測量值和使用雙 能X線吸收測量法（DXA)體內定量身體組成和使用計算機斷層掃描（CT)的腹部脂肪分布 研究了與內臟脂肪過多相關的代謝。
[0014] 使用質子核磁共振（1HNMR)光譜學和等離子體的靶向LC-MS/MS譜和隨時間的進 行而收集的24小時尿樣本，發明人在具有不同內臟脂肪沉著模式的這組充分定義的肥胖 組中鑒定了內臟脂肪分布的新的代謝生物標志物。
[0015] 由此，發明人已經鑒定了新的生物標志物PC-O42:4.
[0016]PC-O是1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸膽堿。
[0017] 對各脂質種類注解如下：[脂質類型][碳原子總數]:[雙鍵總數]。例如，PC34:1 反映包含34個碳原子和1個雙鍵的磷脂酰膽堿種類。
[0018]PC-O42:4因此是I-O-燒基醜基甘油憐酸膽喊42:4.
[0019] 發明人還發現PC-O42:4可以用作生物標志物來檢測和/或定量內臟脂肪過多和 /或內臟脂肪過多的變化。這種診斷方法在人或動物體的體外實施。
[0020] 生物標志物的這種檢測和/或定量可以在體液中實施。體液可以是例如血液，血 漿，血清或尿。
[0021] 一般地，于事先獲自待測試的受試者的體液樣本實施生物標志物的檢測和/或定 量步驟。
[0022] 內臟脂肪也已知稱為腹部脂肪，器官脂肪或腹內脂肪，并且定位于腹腔內部器官 之間中。
[0023] 內臟脂肪可以包含幾種脂肪庫（adiposedepot)，包括腸系膜庫、附睪白色脂肪組 織（EWAT)和腎周庫，以及心外膜脂肪組織和圍繞肝和胃的脂肪。一般地，腹中的脂肪主要 是內臟脂肪，通常導致出名的"啤酒肚"。
[0024] 過多的內臟脂肪導致中心肥胖，其隨后例如與心血管疾病、2型糖尿病、胰島素抗 性或炎性疾病相關。這些是與過多的內臟脂肪相關的疾病的例子。
[0025] 本發明也涉及在受試者中診斷內臟脂肪過多的方法，包括確定事先獲自待測試的 受試者的體液樣本中的1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸膽堿（PC_0)42:4水平，和將受試者的PC-O42:4水平與預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于對照群體同樣的體液中 的平均PC-O42:4水平，并且其中與預定的參考值比較樣本中降低的PC-O42:4水平指示 增加的內臟脂肪過多。
[0026] 內臟脂肪過多可以包括腸系膜脂肪、附睪白色脂肪組織和/或腎周脂肪，以及心 外膜脂肪組織和圍繞肝和胃的脂肪。
[0027] 體液可以是例如血液、血清、血漿或尿。
[0028] 血清和/或血漿具有的優勢是待測試的生物標志物的信噪比尤其高。
[0029] 尿具有的優勢是能夠非侵入地獲得體液樣本。
[0030] 不管所選擇的體液是何種，本發明的方法具有的優勢是自受試者獲得此類體液是 一個已經很好建立了的操作程序。
[0031] 然后在身體外于體液樣本中實施實際的診斷方法。
[0032] 能夠使用本領域已知的任一手段檢測和定量樣本中的PC-O42:4水平。例如，可 以使用質譜，如UPLC-ESI-MS/MS。也可以使用其它方法，如其它光譜法，色譜法，標記技術， 或定量化學方法。
[0033] 理想的是，通過相同的方法測定樣本中的PC-O42:4水平和參考值。
[0034] 預定的參考值可以基于對照群體的受試體液中的平均PC-O42:4水平。對照群體 可以是至少3個，優選地至少10個，更優選地至少50個具有相似遺傳背景、年齡和平均健 康狀態的一組人。
[0035] 對照群體也可以是同一人，由此預定的參考值事先獲自同一受試者。這允許例如 直接比較當前生活方式和之前的生活方式對內臟脂肪過多的影響，并可以直接評估改善。[0036] 測定內臟脂肪的脂肪過多允許得出存在內臟脂肪的脂肪過多和獲得相關疾病的 危險的結論。
[0037] 本發明的主題也涉及在受試者中診斷內臟脂肪過多的變化的方法，包括確定事先 獲自待測試的受試者的體液樣本中的PC-O 42:4水平，和將受試者的PC-O 42:4水平與 預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的 PC-O 42:4水平，并且其中與預定的參考值比較樣本中降低的PC-O 42:4水平指示增加的 內臟脂肪過多。
[0038] 這個方法允許隨著時間來跟蹤內臟脂肪的增多或減少，并且因此允許得出進展為 與內臟脂肪過多相關疾病的風險是上升或下降。
[0039] 這具有例如遠在能夠確定內臟脂肪實際增加或降低之前可立即獲得結果的優點。 這對于激發旨在降低內臟脂肪的人特別好。顯然地，減少內臟脂肪是一項艱難的任務，它通 常需要加強鍛煉。Ohkawara等人建議，對于有效的內臟脂肪減少，需要每周有氧鍛煉至少 10個任務的代謝當量（MET)-小時（Ohkawara，K.等人，（2007)，International journal of obesity (2005)31 (12):1786 - 1797)〇
[0040] 本發明也涉及在受試者中診斷生活方式的變化對內臟脂肪過多的影響的方法， 包括確定事先獲自待測試的受試者的體液樣本中的PC-O42:4水平，和將受試者的PC-O 42:4水平與預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于之前獲自同一受試者的同樣的 體液中的PC-O42:4水平，并且其中與預定的參考值比較樣本中降低的PC-O42:4水平指 示生活方式的變化對內臟脂肪過多的正影響。
[0041] 這個方法具有的效果是它允許監測生活方式變化對內臟脂肪質量的影響和對有 相關疾病危險的影響。
[0042] 生活方式的變化可以是任何變化，如新的工作，不同的壓力水平，新的關系，身體 活動的增加或減少，和/或總體健康的變化。
[0043] 例如，生活方式的變化可以是膳食的變化。
[0044] 膳食的變化可以是碳水化合物、脂類和/或蛋白質含量的增加或減少。它可以是 例如變化為不同地區的膳食，如地中海膳食。它也可以是總熱量攝入的變化。
[0045] 因此，本發明的方法可以用來測試新的營養方案、營養產品和/或藥物的有效性。
[0046] 營養產品可以是例如聲稱對身體脂肪、重量管理和/或內臟脂肪具有影響的產 品。
[0047] 一般地，營養產品可以是食物產品，飲料，寵物食物產品，食物補充物，營養保健品 (nutraceuticals)，食物添加劑或配方營養品。
[0048] 例如，膳食的變化可以是使用至少一種以前沒有消費或者以不同量消費的營養產 品。
[0049] 由此，本發明的方法可以用來測試新的營養方案和/或營養產品的有效性。
[0050]PC-O42:4可以用作用于本發明目的的唯一標志物。
[0051] 雖然PC-O42:4作為唯一的標志物是有效地作為用于本發明診斷方法的工具，但 是如果診斷基于多于一種標志物時，所述診斷的質量和/或預測能力會提高。
[0052] 因此，用于在受試者中診斷內臟脂肪過多和/或相關疾病風險的一種或多種其它 標志物可以與PC-O42:4組合使用。
[0053] 發明人吃驚地發現其它生物標志物也能夠用于檢測診斷內臟脂肪過多和/或相 關疾病風險。
[0054]由此發明人鑒定了PC-O44:6,PC-O44:4,PC-O42:4,PC-O40:4,和 / 或PC-O 40:3降低的體液濃度；和/或酪氨酸和/或谷氨酰胺增加的體液濃度允許診斷內臟脂肪量 的增加和/或增加的進展為與過量內臟脂肪相關的疾病的風險。
[0055]相反地，PC-O44:6,PC-O44:4,PC-O42:4,PC-O40:4,和 / 或PC-O40:3 增加的 體液濃度；和/或酪氨酸和/或谷氨酰胺降低的體液濃度允許診斷內臟脂肪量的降低和/ 或降低的進展為與過量內臟脂肪相關的疾病的風險。
[0056] 本發明的方法因此可以進一步包括如下步驟：測定體液樣本中至少一種其它生物 標志物的水平，所述其它生物標志物選自谷氨酰胺，和/或酪氨酸，PC-044:4,PC-O44:6， PC-O40:4,和/或PC-O40:3,和將受試者的至少一種谷氨酰胺，和/或酪氨酸，PC-O44:4， PC-O44:6,PC-O40:4,和/或PC-O40:3的水平與預定的參考值比較，其中所述預定的 參考值基于正常健康對照群體的體液樣本中的平均谷氨酰胺，酪氨酸，PC-O44:4,PC-O 44:6，PC-0 40:4,和/或PC-O40:3水平，或者基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的 谷氨酰胺，酪氨酸，PC-O44:4，PC-0 44:6，PC-0 40:4,和/或PC-O40:3水平，并且其中與 預定的參考值比較體液樣本中增加的谷氨酰胺和/或酪氨酸水平和/或降低的PC-O44:6， PC-O44:4,PC-O42:4,PC-O40:4,和/或PC-O40:3水平指示增加的內臟脂肪過多。
[0057] 本發明的方法可以包括評估至少2種，至少3種，至少4種，至少5種，至少6種， 或至少7種生物標志物。
[0058]例如，PC-O42:4 可以與PC-O44:4-起評估。
[0059]PC-O42:4 也可以與PC-O44:6 -起評估。
[0060]PC-O42:4 也可以與PC-O40:4 -起評估。
[0061]PC-O42:4 也可以與PC-O40:3-起評估。
[0062]PC-O42:4 也可以與PC-O44:4 和PC-O44:6 -起評估。
[0063]PC-O 42:4 也可以與 PC-O 44:4,PC-O 44:6,和PC-O40:4-起評估。
[0064]PC-O 42:4 也可以與 PC-O 44:4,PC-O 44:6,和PC-O40:3-起評估。
[0065]PC-O 42:4 也可以與 PC-O 44:4,PC-O 44:6,PC-O40:3,和PC-O40:4-起評估。
[0066]PC-O 42:4 也可以與 PC-O 44:4,PC-O 44:6,PC-O40:3,PC-O40:4,和谷氨酰胺 一起評估。
[0067]PC-O42:4 也可以與PC-O44:4,PC-O44:6,PC-O40:3,PC-O40:4,谷氨酰胺和 酪氨酸一起評估。
[0068] 評估多于一種生物標志物的優勢在于：評估越多的生物標志物，診斷將變得越可 靠。如果例如多于1，2, 3,4, 5,6,或7種生物標志物顯示如上所述的濃度升高或降低，則內 臟肥胖的存在或缺乏和內臟肥胖的程度以及相關疾病風險的預測能力更強。
[0069] 據此，發明人鑒定了能用于預測內臟脂肪過多和進展為相關疾病的風險的其它生 物標志物。
[0070] 例如，發現了與事先獲得的相應參考值比較，體液中濃度增加的苯丙氨酸，亮 氨酸，異亮氨酸，棕櫚酰肉堿（C16)，癸酰肉堿（C10)，辛酰肉堿（C8:l)溶血磷脂酰膽堿 (LPC)24:0,磷脂酰膽堿（PC)PC30:0,和/或PC34:4或體液中濃度降低的PC-O34:1， PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6,PC-O42:2，PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O 44:5,PC42:0,和/或PC42:2指示增加的內臟脂肪過多和增加的相關疾病風險。
[0071]PC是磷脂酰膽堿。LPC是溶血磷脂酰膽堿。C是酰基肉堿。
[0072] 相反地，與事先獲得的相應參考值比較，體液中濃度降低的苯丙氨酸，亮氨酸，異 亮氨酸，ClO(癸酰肉堿），C16 (棕櫚酰肉堿），C8:1 (辛酰-肉堿）LPC24:0,PC30:0,和/ 或PC34:4 或體液中濃度增加的PC-O34:1，PC-O34:2,PC-036:2,PC-O36:3,PC-O40:6， PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5,PC42:0,和 / 或PC42:2 指示降低的內臟 脂肪過多和降低的相關疾病風險。
[0073]因此，本發明的方法還可以包括如下步驟：確定體液樣本中至少一種其它生物 標志物的水平，所述其它生物標志物選自苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，ClO(癸酰肉堿）， C16(棕櫚酰肉堿），C8:l(辛酰-肉堿），LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O 34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6,PC-042:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5， PC42:0,和/或PC42:2,和將受試者的至少一種苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，C10，C16， C8:l，肉堿，LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3， PC-040:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5,PC42:0,和 / 或PC42:2 水平 與預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于正常健康對照群體體液樣本中的平均苯 丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，CIO,C16，C8:1，肉堿，LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O 44:5,PC42:0,和/或PC42:2水平，或者基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的 苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，ClO(癸酰肉堿），C16(棕櫚酰肉堿），C8:l(辛酰-肉堿）， LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6， PC-042:2，PC-0 42:3，PC-0 44:3，PC-0 44:5，PC42:0,和 / 或PC42:2 水平，且其中與預定 的參考值比較，體液中增加的苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，C10,C16,C8:1，肉堿，LPC24:0， PC30:0,和/或PC34:4水平和/或體液樣本中降低的PC-O34:l，PC-0 34:2，PC-0 36:2， PC-O36:3,PC-O40:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5,PC42:0,和 / 或PC 42:2水平指示增加的內臟脂肪過多。
[0074] 增加的內臟脂肪過多增加了進展為與過量內臟脂肪相關的疾病的風險。
[0075] 因此，在本發明的方法中，內臟脂肪過多的程度可以用作進展為與過量內臟脂肪 相關的疾病的可能性的指示。
[0076] 同樣地，內臟脂肪過多的變化可以用作進展為與過量內臟脂肪相關的疾病的上升 或下降的可能性的指示。
[0077] 與內臟脂肪過多相關的疾病是例如心代謝疾病。
[0078] 因此，本發明的方法可以用來確定進展為心代謝疾病的風險。
[0079] 另外，與內臟脂肪過多相關的疾病是例如代謝失調。典型的代謝失調是隨后的肥 胖，胰島素抗性，2型糖尿病，代謝綜合征，血管疾病（高血壓，冠心病），代謝肝疾病中的脂 肪肝炎，脂肪代謝障礙，肺功能障礙，炎性疾病和其它肥胖相關疾病。
[0080] 能夠對任何受試者實施本發明的方法。
[0081] 有利地，可以對有進展為內臟脂肪過多和/或與內臟脂肪過多相關的疾病的風險 的受試者實施本發明的方法。
[0082] 例如，可以對正常的、過重的或肥胖的受試者實施本發明的方法。
[0083] "過重"是對成年人定義為具有25至30之間的BMI。"身體質量指數"或"BMI"意 指kg體重除以以米為單位的身高平方之比。"肥胖"是貯存在動物的脂肪組織，特別是在人 和其它哺乳動物的脂肪組織中的天然能量儲備增加至與某些健康狀況或增加的致死性相 關的點的狀況。"肥胖的"是對成年人定義為具有大于30的BMI。
[0084] 對于PC-O42:4和任選地對于其它生物標志物，參考值優選地使用用來表征獲自 試驗受試者的PC-O42:4和任選地其它生物標志物水平的相同單位測定。因此，如果PC-O 42:4和任選地其它生物標志物的水平是如PC-O42:4以μmol/1(μM)所示單位的絕對 值，則參考值也是基于一般群體或基于所選擇的受試者對照群體中個體的PC-O42:4以 μmol/1 (μΜ)所示單位。
[0085] 進一步地，參考值能夠是單個的截止值，如中位值或均值。獲得的體液樣本中PC-O 42:4和任選地其它生物標志物中的參考值如平均水平、中位值水平或"截止"水平可以通 過測試一般群體或所選擇的群體中大的個體樣本和使用統計學模型來建立，如用于選擇陽 性標準的預測值方法，或定義最適特異性（最高的真陰性率）和靈敏性（最高的真陽性率） 的接收者操作特性曲線，如Knapp，R.G.和Miller，M.C. (1992)ClinicalEpidemiologyand Biostatistics·William和Wilkins,HarualPublishingCo.Malvern,Pa.所述，其在此弓I 用作為參考。
[0086] 熟練的技術人員知道如何指定正確的參考值，因為例如所述正確的參考值隨著性 另IJ、種族、遺傳繼承、健康狀況或年齡而不同。
[0087] 作為例子，例如發明人已經在肥胖成年人受試者和在正常成年人受試者的體液如 血漿中確定了典型的參考值。
[0088] 因此，對于肥胖受試者，預定的平均參考值可以是
[0089] 對酪氨酸約68. 71μM體液，
[0090] 對谷氨酰胺約662. 67μM體液，
[0091] 對PC-O 44:6 約 1. 47μM體液，
[0092] 對PC-O 44:4 約 0· 84μM體液，
[0093] 對PC-O 42:4 約 1. 27μM體液，
[0094] 對PC-O 40:4 約 2. 65μM體液，
[0095] 對PC-O 40:3 約 1. 37μM體液，
[0096] 對苯丙氨酸約52. 97μM體液，
[0097] 對亮氨酸+異亮氨酸約193. 56μM體液，
[0098] 對ClO約 0· 19μM體液，
[0099] 對(：16約0.06以]\1體液，
[0100] 對C8:1 約 0· 03μM體液，
[0101] 對LPC24:0 約 0· 25μM體液，
[0102] 對PC30:0 約 4. 18μM體液，
[0103] 對PC34:4 約LΙΙμΜ體液，
[0104] 對PC-O34:1 約 9. 84μM體液，
[0105] 對PC-O34:2 約 11. 49μM體液，
[0106] 對PC-O36:2 約 11. 79μM體液，
[0107] 對PC-O 36:3 約 7. 20μM體液，
[0108] 對PC-O 40:6 約 3. 68μM體液，
[0109] 對PC-O 42:2 約 0· 56μM體液，
[0110] 對PC-O 42:3 約 0· 89μM體液，
[0111] 對PC-O 44:3 約 0· 21μM體液，
[0112] 對PC-O 44:5 約 2. 17μM體液，
[0113] 對PC42:0 約 0· 56μM體液，
[0114] 對PC42:2 約 0· 22μM體液。
[0115] 在正常受試者中，預定的平均參考值可以是
[0116] 對酪氨酸約75. 00μM體液，
[0117] 對谷氨酰胺約748. 27μM體液，
[0118] 對PC-O 44:6 約 L21μM體液，
[0119] 對PC-O 44:4 約 0· 50μM體液，
[0120] 對PC-O 42:4 約 L12μM體液，
[0121] 對PC-O 40:4 約 3. 24μM體液，
[0122] 對PC-O40:3 約 2· 10μM體液，
[0123] 對苯丙氨酸約49. 17μM體液，
[0124] 對亮氨酸+異亮氨酸約197. 52μM體液，
[0125] 對ClO約 0· 29μM體液，
[0126] 對(：16約0.09以]\1體液，
[0127] 對C8:1 約 0· 04μM體液，
[0128] 對LPC24:0 約 0· 77μM體液，
[0129] 對PC30:0 約 4. 10μM體液，
[0130] 對PC34:4 約L 42μM體液，
[0131] 對PC-O34:1 約 8. 20μM體液，
[0132] 對PC-O34:2 約 9. 26μM體液，
[0133] 對PC-O36:2 約 12. 67μM體液，
[0134] 對PC-O36:3 約 5. 83μM體液，
[0135] 對PC-O40:6 約 4. 45μM體液，
[0136] 對PC-O42:2 約 0· 82μM體液，
[0137] 對PC-O42:3 約 L08μM體液，
[0138] 對PC-O44:3 約 0· 22μM體液，
[0139] 對PC-O44:5 約 L82μM體液，
[0140] 對PC42:0 約 0· 65μM體液，
[0141] 對PC42:2 約 0· 35μM體液。
[0142] 用本發明的方法待測試的受試者可以例如是人或動物，特別地是哺乳動物。通常 的動物可以例如是陪伴動物，如貓或狗或農場動物。
[0143] 本領域技術人員理解他們能夠自由地組合文中所述的本發明的所有特征，且不偏 離所公開的本發明的范圍。具體而言，本發明的方法所述的特征可以應用至其它方法和應 用至本發明的用途且反之亦然。
[0144] 本發明的其他優點和特征從下列實施例和附圖中是顯而易見的。
[0145] 表1顯示招募的群組的臨床特征，基于通過計算機斷層掃描測定的腹膜內的/腹 部的脂肪比之Iogltl值評估的他們的內臟脂肪含量分級為四個四分位。值表示為平均值 (土SD)。ALAT=丙氨酸轉氨酶，ASAT=天冬氨酸轉氨酶，BMI=身體質量指數，GGT=γ-谷 氨酰轉肽酶，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，HOM-IR=胰島素抗性的內環境穩定模型評 估，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，MAP=平均動脈血壓，NEFAs=非酯化脂肪酸，TG=甘油 三酯。
[0146] 表2顯示基于通過計算機斷層掃描測定的腹膜內的/腹部的脂肪比之Iogltl值評 估的他們的內臟脂肪含量，對四個四分位的每一個四分位以平均值（土SD)表示的代謝物 濃度。
[0147] 圖1顯示使用隨機森林分析，統計學重構1HNMR血漿譜，以鑒定與內臟脂肪過多 相關的代謝模式（用方框鑒定）。GPCs=甘油磷脂，PUFAs=多不飽和脂肪酸，UFAs=不飽 和脂肪酸。
[0148] 圖2顯示代謝物在如通過隨機森林分析預測內臟脂肪的脂肪過多中的重要性和 確實性。在η= 10000個隨機森林生成之后精度上合并的平均降低。較高的可變重要性對 應于精度上合并的平均降低的較高值。
[0149] 圖3-1，3-2和3-3顯示對每一所選代謝物，高和低內臟脂肪受試者之間的代謝物 差異。基于通過計算機斷層掃描測定的腹膜內脂肪容量之Iogltl值評估的他們的內臟脂肪 含量，對每一四分位繪制數據，1 =四分位1，2 =四分位2, 3 =四分位3,4 =四分位4。 實施例
[0150] 受試者和實驗設計
[0151]臨床試驗是在CentreHospitalierUniversitaireVaudois(CHUV，Lausanne，瑞 士）對40個健康的肥胖白種女人進行的觀察研究。位于CHUV的獨立的倫理委員會批準了 該研究方案。參加者的BMI在28和40之間，年齡在25歲和45歲之間，且不顯示代謝疾病 特征（糖尿病2型，心血管疾病或代謝綜合征）。獲得的生物樣本（血漿和24小時尿樣本） 在代謝組學分析之前貯存在一 80°C。
[0152] 身體組成評估
[0153] 進行全身掃描，以確定腹部脂肪分布和總的身體組成。在GELunariDXA系統 (軟件版本：enCOREversion12. 10. 113)上進行全身掃描，其中掃描模式通過該設備自動 確定。對于DXA測量，所有受試者穿醫院服裝并摘下所有金屬物。使用GELunar校準儀 (calibrationphantom)每日校準iDXA單元。經過訓練的操作者進行所有的掃描，按照操 作者手冊來安置患者和獲得數據。在一小時的約定期間，對每一受試者進行兩次全身掃描， 在兩次掃描之間重新安置患者。使用enCORE軟件（版本14. 00. 207)分析掃描。通過enCORE 軟件（自動R0I)對全身，臂，腿，軀干部，男性樣的區域和女性樣的區域自動確定R〇Is。有 經驗的DXA操作者也證實并且當指出時重新安置ROI位置（專家R0I)。除了iDXA掃描之 夕卜，還進行腰和臀測定。
[0154]在 64 多檢測項CT掃描儀（VCTLightspeed，GEMedical Systems，Milwaukee， USA)上實施CT測定。受試者以他們的臂高于他們的頭和腿的仰臥位用墊子墊高地 躺著。在L4-L5椎骨水平獲得腹部的單個掃描（10mm)，并分析脂肪組織的橫截面積 (cross-sectional area),表示為平方厘米。使用下列的獲得參數：具z軸劑量調節的 120Kv，100-200mA，和視場500mm。使用標準的核心重構5mm切片厚度的軸橫斷成像。定量 方法使用半交互式的市售運算法則在Advantage Window工作區（GEMedical Systems) 上分割皮下的和腹內脂肪。
[0155] 臨床化學
[0156] 使用常規的實驗室方法測定血漿總的、HDL和LDL膽固醇，甘油三酯，尿酸，肌酸 酐，鈉和鉀濃度41^1^5纟1'，661'，葡萄糖，非酯化脂肪酸，胰島素和平均動脈血壓（嫩?）。根 據之前描述的公式（Mathews等人，1985):胰島素（μU/mL)X葡萄糖（mmol/L)/22. 5,將胰 島素抗性狀態評估為胰島素抗性的內環境穩定模型評估（HOM-IR)。
[0157] 樣本制備和1H-NMR光譜分析
[0158] 將肝素血漿樣本（400 μ L)與200 μ L氘化磷酸鹽緩沖液（KH2PO4終濃度為0. 2M) 導入5mm NMR管。氣用作鎖物質。在配備有倒置的5mm低溫探頭的Bruker Avance III 600MHz光譜儀上以300K(Bruker Biospin，Rheinstetten，德國）測定代謝譜。對 每一血漿樣本，獲得具有水壓制的標準1H-NMR-維脈沖序列（RD= 4s)，具有水壓制 的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)自旋回波序列（RD= 4s)，和編輯了擴散的序列 (diffusion-editedsequence)(RD= 4s)。對每個一維實驗，使用98K數據點收集32個掃 描。在傅立葉轉換之前使用T0PSPIN(版本2. 1，Bruker，德國）軟件包加工1H-NMR譜。對 獲得的NMR譜手工定相和基線校正，并且對于血漿譜，參照α-葡萄糖異頭質子在δ5. 2396 的化學位移。通過匹配我們在機構內研發的純化合物的NMR數據庫和使用文獻數據 (Fan,Τ.W. (1996)ProgressinNuclearMagneticResonanceSpectroscopy28, 161-219 ； Nicholson,J.K.等人（1995)Anal.Chem. 67, 793-811)，實現對特定代謝物的 1H-NMR 共振的分配。通過 2D1H-1HCorrelationSpectroscopY(COSY) (Hurd,R.E. (1990) J. Magn. Reson.87,422-428)>1H-1H TOtal Correlation SpectroscopY(TOCSY) (Bax, A. &Davis (1985) J.Magn.Reson. 65, 355-360)和1H-13C Heteronuclear Single Quantum Correlation (HSQC)(Bodenhausen, G. &Ruben(1980)Chemical Physics Letters 69, 185-189) NMR技術證實代謝物身份。
[0159] 用于Biocrates Life Sciences AbsoluteIDQTM試劑盒分析的樣本制備
[0160] 如之前公開的那樣（:R6misch-Margl，W.，C.Prehn,R.Bogumil,C.R0hring, K.Suhre，J.Adamski，用于高通量靶向代謝組學的組織樣本制備和代謝物提取的方法， Metabonomics, 2011。首先在網上公開），將BiocratesLifeSciencesAbsoluteIDQTM 試劑盒用于EDTA血漿樣本。按照生產商的說明書進行孔板制備以及樣本施加和提取。 將10μ1終體積的血漿加樣至提供的96孔板，其中含有同位素標記的內標。在Dionex Ultimate3000超高壓液體色譜（UHPLC)系統（DionexAG,Olten,瑞士）上實施液相色 譜，其中所述色譜系統與安裝有TurboV離子源以電噴霧離子化（ESI)模式運行的3200Q TRAP質譜儀（ABSciex;FosterCity,CA,USA)偶聯。使用梯度流速 0-2. 4 分鐘：30μ1/ 分鐘，2. 4-2. 8分鐘：200μ1/分鐘，2. 9-3分鐘：30μ1/分鐘，通過直接輸注，注射樣本提 取物（20μ1)兩次（以正和負ESI模式）。MS源參數設置為：脫溶劑溫度（TEM) : 200°C，高 電壓：-4500V(ESI-)，5500V(ESI+)，氣簾（CUR)和霧化器（GS1 和GS2)氣體；氮氣；20, 40， 和50psi;分別地，氮氣碰撞氣壓：5mTorr。以計劃的反應監測模式（SRM)進行MS/MS獲取， 其中對于該測定試驗中篩選的163種代謝物具有優化的去簇電位值（potentialvalues)。 將原始數據文件（Analyst軟件，版本I. 5.I;ABSciex,FosterCity,CA,USA)輸入提供 的分析軟件MetlQ，以計算代謝物濃度。可從BiocratesLifeSciences,Austria(http:// biocrates,com)獲得所有能夠檢測到的代謝物的列表。
[0161] 多變量數據分析（MVA)
[0162] 使用機構內研發的排除了δ4. 68-5. 10之間的水殘留信號的MATLAB常規，在 δ0. 2-10. 0的范圍，將血漿NMR譜轉換為22Κ數據點。在化學計量分析之前，將化學位移強 度歸一化為特定范圍內的所有強度的總和。使用軟件包SMCA-P+(版本12. 0.LUmetrics AB，Ume&，瑞典）和機構內研發的MATLABCTheMathWorksInc.，Natick，MA，USA)慣常 程序進行化學計量分析。為了檢測代謝譜之間相似性的存在，使用主要組分分析（PCA) (Wold，S.等人（1987)Chemom.Intell.Lab.Syst. 2, 37-52)，隱變量投影（Projectionto LatentStructures;PLS) (Wold，S.等人（1987)PLSMeeting，Frankfurt)和隱變量正交 投影（OrthogonalProjectiontoLatentStructures;0_PLS)(Trygg，J.&Wold(2003) J.Chemom.17,53-64)。使用7層交叉檢驗評估該模型的有效性（Cloarec，0·等人（2005)Anal. Chem.77, 517-526)。從7層交叉檢驗循環中預測的樣本建立O-PLS-DA模型的分類準 確性。
[0163]通過隨機森林法（RandomForests)，使用 'randomForest' 包（A.Liaw和 ^町61^1"(2002)，通過隨機森林法分類和回歸，1?他￥8 2(3)，18-22)，在1?環境中運行〇? DevelopmentCoreTeam(2011).用于統計學地計算機運行的語言和環境R(R:Alanguage andenvironmentforstatisticalcomputing),RFoundationforStatistical Computing),Vienna,Austria.ISBN3-900051-07-0,URLhttp://www.R-project.org/.), 分析靶向MS數據。用于驗證的單變量顯著性檢驗也在R中進行。
[0164] 由于內臟脂肪過多的非正規分布，使用下列參數用于隨后的代謝組學分析：內臟 脂肪含量的log轉換值，腹膜內的/皮下的脂肪比（比率1)的log轉換值，或腹膜內的/ 腹部的脂肪比（比率2)的log轉換值。
[0165] 表1中示出了群組的人體可測量性狀和生物化學特性，基于使用CT測量的腹膜內 的/腹部的脂肪比（比率2)的Iogltl值分類在四個四分位中（Ql-4，n= 10)。禁食后的葡 萄糖（p〈0. 10)和胰島素（p〈0. 05)，以及HOM-IR(p〈0. 05)在具有最高的內臟脂肪過多的受 試者中（Q4)，與（Ql)相比較而言更高。腹膜內的/皮下的脂肪比或腹膜內的/腹部的脂肪 比的Log轉換值優選地用來根據受試者的內臟脂肪過多來對他們分類，因為這些參數顯示 為獨立于BMI，Hipp，腰，ALAT，MAP，和量熱指數，對于腹膜內的脂肪容積的Log轉換值而言 情況并非如此。有趣的是，在群組中，組之間的HDL，LDL，和總的膽固醇沒有統計學差異。
[0166] 為了鑒定內臟脂肪沉著的表型特征物，使用1H-NMR和靶向LC-MS/MS代謝組學方 法分析血漿樣本。對禁食后的血漿樣本進行分析。收集的樣本的OPLS分析顯示血漿脂質 和內臟脂肪沉著之間某些細微但顯著的相關（R2X:〇. 68 ;R2Y:0. 506 ;Q2Y:0. 167)。也應用隨 機森林分析來證實特定的血漿脂質和內臟脂肪狀態之間的該統計相關（圖1)，其表明甘油 磷脂和脂肪酸飽和模式的變化標出的特定的血漿脂質重新建模。
[0167] 因此，應用靶向LC-MS/MS代謝組學來提供163種代謝物的結構信息和定量測定 值，所述163種代謝物包括氨基酸，糖類，酰基肉堿，鞘脂，和甘油磷脂。使用OPLS分析，確 定內臟脂肪的脂肪過多的代謝標簽是可能的（R2X:0. 29 ;R2Y:0. 68 ;Q2Y:0. 32)。
[0168] 為了選擇更堅實的標志物，使用了"out-of-bag"數據的％平均降低精度作為變量 的重要性特征。在這個方式中，確定根據受試者的內臟脂肪狀態而更好地區分他們的變量 是可能的（Ql相對于Q4比較）。Ql，Q4均使用腹膜內脂肪容積比率1和比率2的log轉 換值之一來評估。通過單獨地考慮每一訪問，也檢驗了該模型用于評估天之間的代謝變化 (數據未顯示）。最終，保留26種代謝物為具有根據受試者內臟脂肪的脂肪過多分類他們 的重要性（圖2, 3-1，3-2, 3-3)。內臟脂肪過多與增加濃度的循環氨基酸相關，所述氨基酸 包括谷氨酰胺，亮氨酸/異亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。這些模式與較高濃度的酰基肉堿相 關，所述酰基肉堿包括棕櫚酰肉堿（C16)，癸酰肉堿（ClO)，辛酰肉堿（C8:l)，和溶血磷脂酰 膽堿LPC24:0和二酰基磷脂，包括PC30:0,PC34:4。此外，內臟脂肪過多通過消耗酰基 醋PC-O36:3,PC-O40:3,PC-O40:4,PC-O40:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O42:4,PC-O 44:3,PC-O44:4,PC-O44:6,和兩種二酰基磷酸膽堿（PC42:0和PC42:2)而明顯。為了 評估所述標簽的每一組分的單個區分能力，在內臟脂肪的脂肪過多組之間實施了Wilcoxon 秩和檢驗（在表2中根據檢驗的描述符，S卩比率2的IoglO值，列出了所有的代謝物）。
[0169] 圖2總結了使用內臟脂肪含量的IoglO值，比率1的IoglO值或比率2的IoglO 值，所選擇的生物標志物和在內臟脂肪過多的分類中它們的權重。在交叉驗證模式中這些 標志物顯示對內臟脂肪具有靈敏性和0. 90的特異性（Sencv，Specv)。
[0170]表 1:
[0171]
【權利要求】
1.生物標志物，其中所述生物標志物是PC-0 42:4。 2. PC-0 42:4的用途，用作生物標志物來檢測和/或定量內臟脂肪過多和/或內臟脂肪 過多的變化。
3.在受試者中診斷內臟脂肪過多的方法，包括 -在事先獲自待測試的受試者的體液樣本中確定PC-0 42:4水平，和 -將受試者的PC-0 42:4水平與預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于對照 群體同樣的體液中的平均PC-0 42:4水平，并且其中與預定的參考值比較樣本中降低的 PC-0 42:4水平指示增加的內臟脂肪過多。
4. 在受試者中診斷內臟脂肪過多的變化的方法，包括 -確定事先獲自待測試的受試者的體液樣本中的PC-0 42:4水平，和 -將受試者的PC-0 42:4水平與預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于之前 獲自同一受試者的同樣的體液中的PC-0 42:4水平，并且其中與預定的參考值比較樣本中 降低的PC-0 42:4水平指示增加的內臟脂肪過多。
5. 在受試者中診斷生活方式的變化對內臟脂肪過多的影響的方法，包括 -確定事先獲自待測試的受試者的體液樣本中的PC-0 42:4水平，和 -將受試者的PC-0 42:4水平與預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于之前 獲自同一受試者的同樣的體液中的PC-0 42:4水平，并且其中與預定的參考值比較樣本中 增加的PC-0 42:4水平指示生活方式的變化對內臟脂肪過多的積極影響。
6. 根據權利要求5的方法，其中所述生活方式的變化是膳食的變化。
7. 根據權利要求6的方法，其中所述膳食的變化是使用至少一種以前沒有消費或者以 不同量消費的營養產品。
8. 根據權利要求6或7的方法，用來測試新的營養方案的有效性。
9. 根據權利要求3至8中任一項所述的方法，還包括步驟 -確定體液樣本中至少一種其它生物標志物的水平，所述其它生物標志物選自谷氨酰 胺，酪氨酸，？〇044:4，？〇0 44:6，卩(：-0 40:4，和？(：-0 40:3，和 -將受試者的谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:4,PC-0 44:6,PC-0 40:4,和PC-0 40:3之 至少之一的水平與預定的參考值比較，其中所述預定的參考值基于正常健康對照群體的體 液樣本中的平均谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:4，PC-044:6，PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3水 平，或者基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:4,PC-0 44:6，PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3水平，并且其中與預定的參考值比較體液樣本中增加的 谷氨酰胺和/或酪氨酸水平和/或降低的PC-0 44:6,PC-0 44:4,PC-0 42:4,PC-0 40:4， 和/或PC-0 40:3水平指示增加的內臟脂肪過多。
10. 根據權利要求3至9中任一項所述的方法，其中所述生物標志物的水平是通過 iH-NMR和/或質譜測定樣本和參照物而確定的。
11. 根據權利要求3至10中任一項所述的方法，其中所述體液是血漿或血清。
12. 根據權利要求3至11中任一項所述的方法，其中所述內臟脂肪過多的程度對于進 展為與過量內臟脂肪相關的疾病的可能性是指示性的。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述與過量內臟脂肪相關的疾病是心代謝疾病 和/或代謝失調。
14. 根據權利要求3至13中任一項所述的方法，其在正常、過重或肥胖受試者中實施。
15. 根據權利要求3至14中任一項所述的方法，其中所述受試者是人或陪伴動物，如貓 或狗。
【文檔編號】G01N33/92GK104380114SQ201380031038
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年6月10日 優先權日:2012年6月12日
【發明者】F-P·馬丁, I·蒙托柳魯拉, P·A·蓋, S·A·D·萊茲 申請人:雀巢產品技術援助有限公司