抗FcRn抗體的制作方法

抗FcRn抗體的制作方法
【專利摘要】本公開內容涉及特異于FcRn的抗體、包含所述抗體的制劑、所述抗體和制劑用于治療的用途、用于表達和任選地配制所述抗體的方法、編碼所述抗體的DNA和包含所述DNA的宿主。
【專利說明】抗FcRn抗體
[0001] 本公開內容涉及特異于FcRn的抗體、包含所述抗體的制劑、所述抗體和制劑在治 療中的用途、用于表達和任選地配制所述抗體的方法、編碼所述抗體的DNA和包含所述DNA 的宿主。
[0002]FcRn是膜蛋白FcRnα鏈和β2微球蛋白（β2M)的非共價復合物。在成年哺乳動 物中，FcRn通過作為結合和再利用IgG同種型抗體的受體而在維持血清抗體水平中起著關 鍵性的作用。IgG分子被內皮細胞吞噬，而如果它們與FcRn結合，則被轉胞吞至例如循環系 統而再利用。相反，不與FcRn結合的IgG分子進入細胞并被靶向至溶酶體途徑，在那里它 們被降解。其中His435被突變成丙氨酸的變體IgGl導致FcRn結合的選擇性丟失和顯著 減小的血清半衰期（Firan等人，2001，InternationalImmunology13:993)。
[0003] 假設FcRn是用于某些至少部分由自身抗體導致的自身免疫性疾病的潛在治療 靶。目前用于某些這樣的病癥的治療包括血漿去除術。有時將血漿去除術與免疫抑制療法 一起使用以長期處理疾病。血漿交換為除去有害的自身抗體提供了最快的短期解決方案。 然而，仍然期望抑制免疫系統的自身抗體產生，例如通過使用藥物例如潑尼松、環磷酰胺、 環孢菌素、嗎替麥考酚酯、利妥昔單抗或其混合物。
[0004] 可用血漿去除術治療的疾病的實例包括：格-巴二氏綜合征；慢性炎癥性脫髓 鞘性多發性神經病；肺出血腎炎綜合征；高粘稠度綜合征；冷球蛋白血癥；副蛋白血癥； WaMenstrdm巨球蛋白血癥；重癥肌無力；血栓性血小板減少性紫癜（TTP)/溶血性尿 毒癥綜合征；韋格納氏肉芽腫；朗-伊二氏綜合征；抗磷脂抗體綜合征（APS或APLS);顯微 鏡下多血管炎；移植的腎中復發性的局灶性和節段性腎小球硬化癥；HELLP綜合征；PANDAS 綜合征；雷夫敘姆病；貝赫切特綜合征；HIV相關神經病；嬰兒和新生兒中的格雷夫斯病； 尋常天皰瘡；多發性硬化；橫紋肌溶解和同種免疫疾病。
[0005] 血漿去除術有時作為救援療法用于含Fc治療劑的去除，例如在緊急情況下用以 減少嚴重副作用。
[0006] 盡管血漿去除術在某些醫療條件下是有用的，但是存在與治療相關的潛在風險和 并發癥。相當大的靜脈內導管的插入可導致出血、肺穿孔（取決于導管插入的位置），并且 如果導管留置太久，其可導致感染和/或靜脈損傷從而為重復該程序提供有限的機會。
[0007] 該程序還具有與其相關的并發癥，例如當患者的血液在體外經過血漿去除術儀器 時，血液具有凝塊的趨向。為了減小該趨向，在一個通用的方案中，在血液流經回路時注入 檸檬酸鹽。檸檬酸鹽與血液中的鈣結合，而鈣對于血液凝結是必需的。檸檬酸鹽在防止血 液凝結上非常有效；然而，其使用可導致威脅生命的低鈣水平。這可通過使用沃斯特克征或 特魯索氏征來檢測。為了預防該并發癥，在患者經歷血漿去除術時將鈣靜脈內注入；此外， 還可提供經口的鈣補充。
[0008] 該程序的其它并發癥包括：低血壓；潛在的暴露于血液制品；具有輸血反應或輸 血傳播疾病的風險；患者免疫系統的抑制和來自針頭位直的出血或血腫。
[0009] 此外，提供血漿去除術的設備有限并且該程序非常昂貴。
[0010] 可替代血漿去除術的是靜脈滴注免疫球蛋白（IVIG)，其為包含從超過一千名血液 供體的血漿提取的匯合的多克隆IgG的血液制品。治療是靜脈內施用的并且持續2周至3 個月。
[0011]IVIG治療的并發癥包括頭痛、皮炎、來自治療產品的污染的病毒感染例如HIV或 肝炎、肺水腫、過敏反應、急性腎衰竭、靜脈血栓形成和無菌性腦膜炎。
[0012] 因此，對于具有較低侵襲性并且使患者暴露于較少的醫學并發癥的用于自身免疫 性疾病的療法，存在重要的未滿足的需求。
[0013] 因此，對于具有較低侵襲性并且使患者暴露于較少的醫學并發癥的用于免疫疾病 和/或自身免疫性疾病的療法，存在重要的未滿足的需求。
[0014] 因此，阻斷或減少IgG與FcRn的結合的試劑可用于這樣的自身免疫性和炎癥性疾 病的治療或預防。此前已在W02009/131702、W02007/087289和W02006/118772中描述了 抗-FcRn抗體。
[0015] 然而，仍然存在對改進的抗-FcRn抗體的需求。
[0016] 發明概述
[0017]因此在一個方面，提供了抗-FcRn抗體或其結合片段，所述抗體或其結合片段包 含具有可變區的重鏈或重鏈片段，其中所述可變區包含獨立地選自SEQIDN0:1、SEQID NO: 2和SEQIDNO: 3的一個、兩個或三個CDR，例如其中CDRHl是SEQIDNO: 1，CDRH2是 SEQIDNO:2 以及CDRH3 是SEQIDNO:3。
[0018] 在另一個方面，提供了包含如上文定義的序列或序列的組合例如同源配對可變區 的抗體或片段。
[0019] 本公開內容的抗體阻斷IgG與FcRn的結合，并被認為可用于減弱FcRn的一個或 多個生物學功能，包括減小循環抗體的半衰期。這可以是有利的，因為其使得患者更快速地 清除抗體例如自身抗體。
[0020] 重要地，本發明的抗體能夠在pH6和pH7. 4下以相當的和高的結合親和力結合人 FcRn。因此有利地，即使在內涵體內抗體也能夠持續結合FcRn，從而最大化地阻斷FcRn與 IgG的結合，參見圖10對機制的舉例說明。
[0021] 在一個實施方案中，根據本公開內容的抗體或結合片段包含具有可變區的輕鏈或 輕鏈片段，所述可變區例如包含獨立地選自SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6的一 個、兩個或三個⑶R，特別地其中⑶RLI是SEQIDNO:4,⑶RL2是SEQIDNO:5以及⑶R L3 是SEQIDNO:6。
[0022] 在一個實施方案中，根據本公開內容的抗體或結合片段包含SEQIDN0:1至6 的CDR序列，例如其中CDRHl是SEQIDNO: 1，CDRH2 是SEQIDNO: 2,CDRH3 是SEQID NO:3,CDRLl是SEQIDNO:4,CDRL2 是SEQIDNO:5 以及CDRL3 是SEQIDNO:6。
[0023] 本公開內容還擴展至編碼如本文中公開的抗體或片段的多核苷酸例如DNA。
[0024] 還提供了包含所述多核苷酸的宿主細胞。
[0025] 在本文中將表達抗體或片段的方法提供為將抗體或片段偶聯至聚合物例如PEG 的方法。
[0026] 本公開內容還涉及包含所述抗體和片段的藥物組合物。
[0027] 在一個實施方案中，提供了治療方法，包括施用治療有效量的如本文中描述的抗 體、片段或組合物。
[0028] 本公開內容還延伸至用于治療，特別地用于免疫和/或自身免疫性疾病的治療的 根據本公開內容的抗體、片段或組合物。
[0029] 因此，本公開內容提供了用于去除病原性IgG的抗體、其片段和方法，所述去除通 過加速機體分解代謝IgG的天然機制來實現。
[0030] 本質上，根據本公開內容的抗體和片段阻斷在機體內再利用IgG的系統。
[0031] 本療法可能為其中使用血漿去除術療法或IVIg療法的某些疾病提供替換或補 充，這對于患者來說是有利的。
[0032] 附圖概述
[0033] 圖1顯示某些氨基酸和多核苷酸序列。
[0034] 圖2顯示某些序列的比對。
[0035] 圖3顯示根據本公開內容的Fab'片段及其PEG化形式在人MDCKII上的結合的 比較。
[0036] 圖4顯示根據本公開內容的Fab'片段及其PEG化形式抑制MDCKII細胞上的IgG 再利用。
[0037] 圖5顯示根據本公開內容的PEG化Fab'片段抑制MDCKII細胞中頂端至基底外 側的IgG轉胞吞作用。
[0038] 圖6顯示根據本公開內容的Fab'片段及其PEG化形式的食蟹猴MDCKII結合的 比較。
[0039] 圖7顯示根據本公開內容的PEG化Fab'片段抑制MDCKII細胞（其人和食蟹猴 形式）上的IgG再利用。
[0040] 圖8顯示根據本公開內容的PEG化Fab'分子的單次劑量在食蟹猴中對血漿IgG 水平的作用。
[0041] 圖9顯示根據本公開內容的PEG化Fab'分子的四次每周劑量對血漿IgG水平的 作用。
[0042] 圖10顯示被阻斷蛋白抑制的FcRn的抗體再利用功能的圖示。
[0043] 圖11顯示使用純化的YIIgG抗體的基于流式細胞術的人IgG阻斷測定。
[0044] 圖12顯示20mg/Kg的Fab'PEG單次/周期性IV劑量在正常食蟹猴中第1天和 67天的IgG藥效學。
[0045] 圖13顯示Fab'PEG:4x20或100mg/Kg/周的重復IV劑量在正常食蟹猴中的IgG 藥效學。
[0046] 圖14顯示20mg/Kg和100mg/Kg的Fab'PEG單次/周期性IV劑量在正常食蟹猴 中第1天和67天的IgG藥效學。
[0047] 圖15顯示在2次IV劑量的20mg/Kg的1519.g57Fab'PEG后在4只食蟹猴中的 血漿IgG水平。
[0048] 圖16顯示在接受10次IV劑量的20mg/Kg的1519.g57Fab'PEG(每3天1次） 的4只食蟹猴中的血漿IgG水平。
[0049] 圖17顯示2次30mg/KgIV劑量的1519.g57IgG4P在食蟹猴中對內源血漿IgG 的作用。
[0050] 圖18顯示30mg/Kg和隨后41次每日劑量的5mg/Kg1519.g57IgG4P在食蟹猴中 對血漿IgG的作用。
[0051] 圖19顯示用媒介物每日給藥在食蟹猴中對血漿IgG的結果。
[0052] 圖20顯示用CA170_01519. g57 Fab'PEG或PBS IV處理的hFcRn轉基因小鼠的血 漿中IV hlgG的增加的清除率。
[0053] 圖21顯示用CA170_01519. g57 IgGl或IgG4或PBS IV處理的hFcRn轉基因小鼠 的血漿中IV hlgG的增加的清除率。
[0054] 圖22顯示用CA170_01519. g57 Fab'-人血清白蛋白或PBS IV處理的hFcRn轉基 因小鼠的血漿中IV hlgG的增加的清除率。
[0055] 圖23顯示用CA170_01519. g57 FabFv或PBS IV處理的hFcRn轉基因小鼠的血漿 中IV hlgG的增加的清除率。
[0056]圖24顯示用CA170_01519. g57 Fab或Fab'PEG或PBS IV處理的hFcRn轉基因小 鼠的血漿中IV hlgG的增加的清除率。
[0057] 圖25顯示本發明的雙特異性抗體融合蛋白，其被稱為Fab-dsFv。
[0058] 發明詳述
[0059] 如本文中所用，FcRn意指人IgG受體α鏈與β2微球蛋白（β2M)之間的非共價 復合物，也稱為新生兒Fc受體，其氨基酸序列見UniProt號Ρ55899,β2Μ的氨基酸序列見 UniProt號Ρ61769。
[0060] 如本文中所用，抗體分子意指抗體或其結合片段。
[0061] 如本文中所用，術語'抗體'通常涉及完整的（全）抗體，即包含兩條重鏈和兩條 輕鏈的元件。抗體還可包含另外的結合結構域例如根據WO 2007/024715中公開的分子 DVD-Ig或W02011/030107中描述的所謂（FabFv)2Fct5因此如本文中所用的抗體包括二價、 三價或四價的全長抗體。
[0062]抗體的結合片段包括單鏈抗體（即全長重鏈和輕鏈）；Fab、修飾的Fab、Fab'、修 飾的Fab'、F(ab，）2、Fv、Fab-Fv、Fab_dsFv、單結構域抗體（例如VH或VL或VHH)、scFv、二 價、三價或四價抗體、Bis_scFv、diabody、tribody、triabody、tetrabody和上述任意一種的 表位結合片段（參見例如Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9) :1126-1136; Adair and Lawson，2005, Drug Design Reviews-Online 2 (3) ,209-217)。產生和制 備這些抗體片段的方法在本領域是公知的（參見例如Verma等人，1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。Fab-Fv形式首先公開于W02009/040562,其二硫 鍵穩定化形式Fab-dsFv首先公開于W02010/035012,也參見本文中圖25。用于本發明的其 它抗體片段包括描述于國際專利申請W02005/003169、W02005/003170和W02005/003171中 的Fab和Fab'片段。多價抗體可包含多特異性例如雙特異性或可以是單特異性的（參見 例如WO 92/22583和W005/113605)。后者的一個這樣的實例是描述于WO 92/22583中的 Tri-Fab(或TFM)。
[0063] 典型的Fab'分子包含重鏈和輕鏈對，其中重鏈包含可變區Vh、恒定結構域ChI和 天然的或修飾的鉸鏈區，輕鏈包含可變區' 和恒定結構域Q。
[0064] 在一個實施方案中，提供了根據本公開內容的Fab'的二聚體以產生F(ab'）2，例 如二聚化可通過鉸鏈來實現。
[0065] 在一個實施方案中，抗體或其結合片段包含結合結構域。結合結構域通常將包含 6個CDR，3個來自重鏈以及3個來自輕鏈。在一個實施方案中，CDR在框架中并且一起形成 可變區。因此在一個實施方案中，抗體或結合片段包含特異于抗原的結合結構域，所述結合 結構域包含輕鏈可變區和重鏈可變區。
[0066] 將理解可對CDR或其它由本發明提供的序列（例如可變結構域）進行一個或多 個（例如1、2、3或4個）氨基酸置換、添加和/或缺失而不顯著地改變抗體結合FcRn的能 力。任何氨基酸置換、添加和/或缺失的效果可由本領域技術人員例如通過使用本文中，特 別地實施例中描述的方法容易地測試以測定FcRn。
[0067] 可對本發明提供的抗體或片段中使用的框架區進行一個或多個（例如1、2、3或4 個）氨基酸置換、添加和/或缺失，并且其中對FcRn的結合親和力得到保持或增加。
[0068] 根據Kabat等人設計的系統對抗體可變結構域中的殘基進行常規地編號。該 系統不于Kabat等人，1987,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,US DepartmentofHealthandHumanServices,NIH,USA(在下文稱為"Kabat等人（同上）"） 中。將該編號系統用于本說明書中，除非另有指明。
[0069]Kabat殘基命名并不總是直接對應于氨基酸殘基的線性編號。實際的線性氨基酸 序列可包含比嚴格Kabat編號中更少的或額外的氨基酸，對應于基本可變結構域結構的結 構組件（無論是構架區還是互補決定區（CDR))的縮短或至其中的插入。可通過將抗體序 列中具有同源性的殘基與"標準"Kabat編號的序列進行比對來確定給定抗體的殘基的正確 Kabat編號。
[0070] 重鏈可變結構域的⑶R位于根據Kabat編號系統的殘基31-35(⑶R-Hl)、殘基 50-65 (CDR-H2)和殘基 95-102 (CDR-H3)。然而，根據〇1〇也1&(〇1〇也1&，(：.&11(11^81^八· M.J.Mol.Biol.，196, 901-917(1987))，相當于CDR-Hl的環從殘基26延伸至殘基32。因此除 非另有指明，本文中使用的'⑶R-ΗΓ意指殘基26至35,如通過Kabat編號系統和Chothia 拓撲環定義的組合所描述的。
[0071] 輕鏈可變結構域的⑶R位于根據Kabat編號系統的殘基24-34(⑶R-Ll)、殘基 50-56 (CDR-L2)和殘基 89-97 (CDR-L3)。
[0072] 本公開內容的抗體和片段阻斷FcRn從而可阻止其在IgG的再利用中發揮功能。本 文中所使用的"阻斷"意指物理阻斷例如封閉受體，但也包含其中抗體或片段結合表位從而 導致例如構象變化，該構象變化意味著受體的天然配體不再結合。本發明的抗體分子結合 FcRn從而減少或阻止（例如抑制）FcRn與IgG恒定區結合。
[0073] 在一個實施方案中，抗體或其片段相對于IgG競爭性結合FcRn。
[0074] 在一個實施方案中，抗體或其結合片段用作人FcRn對人IgG的結合的競爭性抑制 齊U。在一個實例中，抗體或其結合片段結合FcRn上的IgG結合位點。在一個實例中，抗體 或其結合片段不結合β2M。
[0075] 用于本公開內容的抗體可通過使用本領域中已知的任何適當的方法來獲得。可 將FcRn多肽/蛋白包括融合蛋白、（重組地或天然地）表達多肽的細胞（例如激活的T細 胞）用于產生特異性識別FcRn的抗體。多肽可以是'成熟的'多肽或其生物活性片段或衍 生物。人蛋白在號Ρ55899下登記于Swiss-Prot。人FcRna鏈的胞外結構域提供于SEQID Ν0:94。β2Μ的序列提供于SEQIDN0:95。
[0076] 在一個實施方案中，抗原是FcRn的突變體形式，該突變體形式經工程化將FcRn呈 遞在細胞表面，以便存在很少的或不存在將FcRn內化至細胞內的動態加工，例如這可通過 在FcRnα鏈的胞質尾區中產生突變來實現，其中二一亮氨酸被突變成二一丙氨酸，如Ober 等人，2001Int.Immunol.公，1551 - 1559 中所描述的。
[0077] 用于免疫宿主的多肽可通過本領域中公知的方法從經遺傳工程化的包含表達系 統的宿主細胞制備，或者它們可從天然生物源回收而來。在本申請中，術語'多肽'包括肽、 多肽和蛋白質。這些被可互換地使用，除非另有指明。在一些情況下，FcRn多肽可以是較 大蛋白例如融合蛋白的部分例如融合至親和標記物或類似的。
[0078] 可通過使用公知的和常規的方案將多肽施用至動物，優選非人動物來獲 得針對FcRn多肽產生的抗體（其中動物的免疫是必需的），參見例如Handbook ofExperimentalImmunology,D.M.ffeir(ed.),Vol4,BlackwellScientific Publishers,Oxford,England, 1986)。可免疫多種溫血動物例如兔、小鼠、大鼠、羊、母牛、胳 駝或豬。然而小鼠、兔、豬和大鼠通常是最適合的。
[0079] 可通過本領域中已知的任何方法例如雜交瘤技術（Kohler&Milstein,Nature, 1 975, 256, 495-497)、三源雜交瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術（Kozbor等人，Immunology Today, 1983, 4:72)和EBV-雜交瘤技術（Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancer Therapy,ρρ· 77-96,AlanR.Liss,Inc. , 1985)來制備單克隆抗體。
[0080] 用于本發明的抗體還可使用單淋巴細胞抗體法，通過克隆和表達從單個淋巴細胞 產生的免疫球蛋白可變區cDNA來產生，通過例如由Babcook,J.等人，1996，？1'〇(：.似1:1· Acad.Sci.USA93(15) :7843-78481、WO92/02551、W02004/051268 和國際專利申請號 W02004/106377描述的方法來選擇產生特定抗體的單個淋巴細胞。
[0081] 可使用測量對人FcRn的結合的測定和/或測量阻斷IgG與受體的結合的能力的 測定來進行抗體的篩選。結合測定的實例是ELISA，特別地使用固定于平板上的人FcRn和 人Fc的融合蛋白和使用第二抗體來檢測結合于融合蛋白的抗-FcRn抗體。適當的拮抗和 阻斷測定的實例描述于本文的實施例中。
[0082] 人源化抗體（包括⑶R移植抗體）是具有一個或多個來自非人物種的互補決 定區（CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架區的抗體分子（參見例如，US5, 585, 089 ; W091/09967)。將理解可只需要轉移⑶R的特異性決定殘基而不是整個⑶R(參加例如， Kashmiri等人，2005,Methods, 36, 25-34)。人源化抗體可任選地還包括一個或多個來源于 非人物種（CDR來源于該物種）的框架殘基。后者通常被稱為供體殘基。
[0083] 如本文中所用，"特異的"意指抗體僅識別其特異于的抗原或相較于對其非特異于 的抗原的結合，抗體對其特異于的抗原具有顯著更高的結合親和力，例如至少5、6、7、8、9、 10倍更高的結合親和力。結合親和力可通過技術例如下文中描述的BIAcore來測量。在一 個實例中，本發明的抗體不結合β2微球蛋白（β2M)。在一個實例中，本發明的抗體結合食 蟹猴FcRn。在一個實例中，本發明的抗體不結合大鼠或小鼠FcRn。
[0084] 根據本公開內容的某些抗體的氨基酸序列和多核苷酸序列提供于附圖中。
[0085] 在一個實施方案中，根據本公開內容的抗體或片段是人源化的。
[0086] 如本文中所用，術語'人源化抗體分子'意指這樣的抗體分子：其中重鏈和/或輕 鏈包含一個或多個被移植入受體抗體（例如人抗體）的重鏈和/或輕鏈可變區框架的來 自供體抗體（例如非人抗體例如鼠單克隆抗體）的CDR(若需要，包括一個或多個修飾的 CDR)。對于綜述，參見Vaughan等人，NatureBiotechnology, 16, 535-539, 1998。在一個實 施方案中，只將來自上文中描述的任一個CDR的特異性決定殘基的一個或多個，而不是將 整個CDR轉移至人抗體框架（參見例如，Kashmiri等人，2005,Methods, 36, 25-34)。在一 個實施方案中，只將來自上文中描述的一個或多個CDR的特異性決定殘基轉移至人抗體框 架。在另一個實施方案中，只將來自上文中描述的每一個CDR的特異性決定殘基轉移至人 抗體框架。
[0087] 當移植CDR或特異性決定殘基時，可根據CDR來源于的供體抗體的種類/類型使 用任何合適的受體可變區框架序列，包括小鼠、靈長類和人框架區。
[0088] 適當地，根據本發明的人源化抗體具有包含人受體框架區以及一個或多個本文中 特別提供的CDR的可變結構域。因此，在一個實施方案中，提供了結合人FcRn的阻斷性人 源化抗體，其中可變結構域包含人受體框架區和非人供體CDR。
[0089] 可用于本發明的人框架的實例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和P0M(Kabat 等人，同上）。例如，KOL和NEWM可用于重鏈，REI可用于輕鏈，EU、LAY和POM可用于重鏈 和輕鏈。或者，可使用人種系序列:這些可在http://vbase.mrc-cpe.cam,ac.uk/上獲得。
[0090] 在本發明的人源化抗體中，受體重鏈和輕鏈不一定需要來源于相同的抗體，并且 若需要，可包含具有來源于不同鏈的框架區的復合鏈。
[0091] 本發明的人源化抗體的重鏈的一個這樣的適當的框架區來源于人亞組VH3序列 1-33-07 連同JH4(SEQIDN0:56)。
[0092] 因此，在一個實例中，提供了包含SEQIDNO: 1所示的CDR-Hl的序列、SEQIDN0:2 所示的⑶R-H2的序列和SEQIDNO: 3所示的⑶RH3的序列的人源化抗體，其中重鏈框架區 來源于人亞組VH3序列1-33-07連同JH4。
[0093]人JH4 的序列是（YFDY)WGQGTLVTVS(SeqIDNo: 70)。YFDY基序是CDR-H3 的部分 而不是框架 4 的部分（Ravetch，JV.等人，1981，Cell, 27, 583-591)。
[0094] 在一個實例中，抗體的重鏈可變結構域包含SEQIDN0:29中所示的序列。
[0095] 本發明的人源化抗體的輕鏈的適當的框架區來源于人種系亞組VKl序列2-1-(1) A30 連同JK2(SEQIDN0:54)。
[0096] 因此，在一個實例中，提供了包含SEQIDN0:4所示的CDR-Ll的序列、SEQIDN0:5 所示的⑶R-L2的序列和SEQIDN0:6所示的⑶RL3的序列的人源化抗體，其中輕鏈框架區 來源于人亞組VKl序列2-1-(1)Α30連同JK2。
[0097]JK2 序列是（YT)FGQGTKLEIK(SeqIDNo:71)。YT基序是CDR-L3 的部分而不是框 架 4 的部分（Hieter,PA.等人，1982,Biol.Chem.，257, 1516-1522)。
[0098] 在一個實例中，抗體的輕鏈可變結構域包含SEQIDNO: 15中所示的序列。
[0099] 在本發明的人源化抗體中，框架區不需要具有與受體抗體的框架區完全相同的序 列。例如，可將對于該受體鏈種類或類型不常見的殘基改變成更常出現的殘基。或者，可改 變受體框架區中經選擇的殘基以便它們對應于在供體抗體中相同位置處發現的殘基（參 見Reichmann等人，1998,Nature, 332, 323-324)。應當將這樣的改變保持在恢復供體抗 體的親和力所需要的最小程度。在受體框架區中選擇可能需要被改變的殘基的方案示于 W091/09967 中。
[0100] 因此，在一個實施方案中，框架中的1、2、3、4或5個殘基被替代性氨基酸殘基置 換。
[0101]因此，在一個實例中，提供了人源化抗體，其中至少在重鏈的可變結構域的位置3、 24、76、93和94(Kabat編號）的每一個上的殘基是供體殘基，參見例如SEQIDNO:29中所 示的序列。
[0102] 在一個實施方案中，重鏈可變結構域的殘基3被替代性氨基酸例如谷氨酰胺置 換。
[0103]在一個實施方案中，重鏈可變結構域的殘基24被替代性氨基酸例如丙氨酸置換。
[0104]在一個實施方案中，重鏈可變結構域的殘基76被替代性氨基酸例如天冬酰胺置 換。
[0105]在一個實施方案中，重鏈的殘基93被替代性氨基酸例如丙氨酸置換。
[0106] 在一個實施方案中，重鏈的殘基94被替代性氨基酸例如精氨酸置換。
[0107]在一個實施方案中，在根據本公開內容的人源化重鏈可變區中，殘基3是谷氨酰 胺，殘基24是丙氨酸，殘基76是天冬酰胺，殘基93是丙氨酸，殘基94是精氨酸。
[0108] 因此，在一個實施方案中，提供了人源化抗體，其中至少在輕鏈的可變結構域的位 置36、37和58 (Kabat編號）的每一個上的殘基是供體殘基，參見例如SEQIDNO: 15中所 示的序列。
[0109]在一個實施方案中，輕鏈可變結構域的殘基36被替代性氨基酸例如酪氨酸置換。 [0110] 在一個實施方案中，輕鏈可變結構域的殘基37被替代性氨基酸例如谷氨酰胺置 換。
[0111] 在一個實施方案中，輕鏈可變結構域的殘基58被替代性氨基酸例如纈氨酸置換。
[0112] 在一個實施方案中，在根據本公開內容的人源化輕鏈可變區中，殘基36是酪氨 酸，殘基37是谷氨酰胺，以及殘基58是纈氨酸。
[0113]在一個實施方案中，本公開內容提供了在相關序列的部分或全部上與本文中公開 的序列具有80%例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的 相似性或同一性的抗體序列，所述相關序列的部分或全部可以是例如可變結構域序列、CDR 序列或除CDR以外的可變結構域序列。在一個實施方案中，相關序列是SEQIDNO: 15。在 一個實施方案中，相關序列是SEQIDNO:29。
[0114]在一個實施方案中，本發明提供結合人FcRn的包含重鏈的抗體分子，其中重鏈 的可變結構域包含與SEQIDN0:29中所示的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或相似性的序列。
[0115]在一個實施方案中，本發明提供結合人FcRn的包含輕鏈的抗體分子，其中輕鏈 的可變結構域包含與SEQIDN0:15中所示的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或相似性的序列。
[0116]在一個實施方案中，本發明提供結合人FcRn的抗體分子，其中所述抗體具有與SEQIDN0:29 中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的相似性或同一性的重鏈可變結構域，但是其中所述抗體分子具有SEQIDNO: 1所 示的⑶R-Hl的序列、SEQIDNO:2所示的⑶R-H2的序列和SEQIDNO:3所示的⑶R-H3的 序列。
[0117]在一個實施方案中，本發明提供結合人FcRn的抗體分子，其中所述抗體具有與 SEQIDN0:15 中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的相似性或同一性的輕鏈可變結構域，但是其中所述抗體分子具有SEQIDN0:4所 示的CDR-Ll的序列、SEQIDNO:5所示的CDR-L2的序列和SEQIDNO:6所示的CDR-L3的 序列。
[0118] 在一個實施方案中，本發明提供結合人FcRn的抗體分子，其中所述抗體具有與 SEQIDN0:29 中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的相似性或同一性的重鏈可變結構域，和與SEQIDNO: 15中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相似性或同一性的輕鏈可變 結構域，但是其中所述抗體分子具有SEQIDNO: 1所示的⑶R-Hl的序列、SEQIDNO:2所 示的CDR-H2的序列、SEQIDNO: 3所示的CDR-H3的序列、SEQIDNO:4所示的CDR-Ll的序 列、SEQIDN0:5所示的CDR-L2的序列和SEQIDN0:6所示的CDR-L3的序列。
[0119] 如本文中所用，"同一性"是指在比對的序列中的任何特定位置，氨基酸殘基在序 列之間是相同的。如本文中所用，"相似性"是指在比對的序列中的任何特定位置，氨基酸殘 基在序列之間具有相似的類型。例如，可用亮氨酸替換異亮氨酸或纈氨酸。可常常被用來 彼此替換的其它氨基酸包括但不限于：
[0120] 一苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸（具有芳香族側鏈的氨基酸）；
[0121] 一賴氨酸、精氨酸和組氨酸（具有堿性側鏈的氨基酸）；
[0122] 一天冬氨酸和谷氨酸（具有酸性側鏈的氨基酸）；
[0123] 一天冬酰胺和谷氨酰胺（具有酰胺側鏈的氨基酸）；和
[0124] 一半胱氨酸和甲硫氨酸（具有含硫側鏈的氨基酸）。可容易地計算同一性和相 似性的程度（ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.,OxfordUniversity Press,NewYork, 1988 ；Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects,Smith,D. W. ,ed. ,AcademicPress,NewYork, 1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part I,Griffin,A.M. ,andGriffin,H.G. ,eds. ,HumanaPress,NewJersey, 1994；Sequence AnalysisinMolecularBiology,vonHeinjejG. ,AcademicPress，1987,Sequence AnalysisPrimer,GribskovjM.andDevereuxjJ.,eds. ,MStocktonPress,New ￥〇4，1991，81^3了1￥軟件可從【81獲得以1七8(*111，31.等人，1990， <1.]?〇1· Biol. 215 :403-410 ；Gish,W. &States,D.J. 1993,NatureGenet. 3: 266-272.Madden,T. L.等人，1996,Meth.Enzymol. 266:131-141 ;Altschul，S.F.等人，1997,NucleicAcids Res. 25:3389-3402 ；Zhang,J.Madden,T.L. 1997,GenomeRes. 7:649-656) 〇
[0125] 本發明的抗體分子可包含具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子或其片段，并且可 以是但不限于Fab、修飾的Fab、Fab'、修飾的Fab'、F(ab'）2、Fv、單結構域抗體（例如VH或 VL或VHH)、scFv、二價、三價或四價抗體、Bis-scFv、diabodies、triabodies、tetrabodies 和上述任意一種的表位結合片段（參見例如HolligerandHudson，2005,Nature Biotech. 23 (9):1126-1136；AdairandLawson,2005,DrugDesignReviews-Online 2 (3)，209-217)。產生和制備這些抗體片段的方法在本領域是公知的（參見例如Verma等 人，1998,JournalofImmunologicalMethods，216, 165-181)。用于本發明的其它抗體片 段包括描述于國際專利申請W02005/003169、W02005/003170和W02005/003171中的Fab和 Fab'片段。多價抗體可包含多特異性例如雙特異性或可以是單特異性的（參見例如WO92 /22853,W005/113605,W02009/040562 和W02010/035012)。
[0126] 在一個實施方案中，本公開內容的抗體分子是抗體Fab'片段，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分別對于輕鏈和重鏈）的可變區。在一個實施方案中，抗體分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的輕鏈和包含SEQIDN0:36中所示的序列的重鏈。
[0127] 在一個實施方案中，本公開內容的抗體分子是全長IgGl抗體，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分別對于輕鏈和重鏈）的可變區。在一個實施方案中，抗體分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的輕鏈和包含SEQIDN0:72中所示的序列的重鏈。
[0128] 在一個實施方案中，本公開內容的抗體分子是全長IgG4形式，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分別對于輕鏈和重鏈）的可變區。在一個實施方案中，抗體分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的輕鏈和包含SEQIDN0:87中所示的序列的重鏈。
[0129] 在一個實施方案中，本公開內容的抗體分子是全長IgG4P形式，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分別對于輕鏈和重鏈）的可變區。在一個實施方案中，抗體分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的輕鏈和包含SEQIDN0:43中所示的序列的重鏈。
[0130] 如本文中所用，IgG4P是野生型IgG4同種型的突變，其中氨基酸241被脯氨酸置 換，參見例如Angal等人，MolecularImmunology, 1993, 30 (1)，105-108 中描述的位置 241 上的絲氨酸被改變成脯氨酸。
[0131] 在一個實施方案中，將根據本公開內容的抗體提供為FcRn結合抗體融合蛋白，其 包含免疫球蛋白部分例如Fab或Fab'片段，和與其直接或間接連接的一個或兩個單結構 域抗體（dAb)，例如如W02009/040562,W02010035012,W02011/030107,W02011/061492 和 W02011/086091中所描述的，將這些資料通過引用并入本文。
[0132] 在一個實施方案中，融合蛋白包含兩個結構域抗體例如作為可變重鏈（VH)和可 變輕鏈（VL)配對，任選地通過二硫鍵連接。
[0133] 在一個實施方案中，融合蛋白的Fab或Fab'元件具有與單結構域抗體相同或相似 的特異性。在一個實施方案中，Fab或Fab'具有與單結構域抗體不同的特異性，即融合蛋 白是多價的。在一個實施方案中，根據本發明的多價融合蛋白具有白蛋白結合位點，例如其 中VH/VL對提供白蛋白結合位點。在一個這樣的實施方案中，重鏈包含SEQIDN0:50中所 示的序列，輕鏈包含SEQIDN0:46或SEQIDN0:78中所示的序列。在本文的圖25中舉例 說明了該Fab-dsFv形式。
[0134] 在一個實施方案中，根據本公開內容的Fab或Fab'與PEG分子或人血清白蛋白綴 合。
[0135]CA170_01519g57和1519以及1519.g57在本文中互換使用，并用于指可以以多種 不同形式使用的抗體可變區的特定配對。這些可變區是SEQIDN0:29中所示的重鏈序列 和SEQIDNO: 15中所示的輕鏈序列（圖1)。
[0136] 本發明的抗體分子的恒定區結構域，若存在時，可以根據抗體分子的期望功能， 特別地可能期望的效應子功能來選擇。例如，恒定區結構域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG 或IgM結構域。特別地，可使用人IgG恒定區結構域，特別地當期望抗體分子用于治療性 用途并且期望抗體效應子功能時可使用IgGl和IgG3同種型的恒定區結構域。或者，當 期望抗體分子用于治療性目的并且不期望抗體效應子功能時可使用IgG2和IgG4同種 型。將理解還可使用這些恒定區結構域的序列變體。例如可使用Angal等人，Molecular Immunology, 1993, 30 (I)，105-108中描述的IgG4分子，其中已將位置241上的絲氨酸改 變為脯氨酸。本領域技術人員還將理解抗體可經歷多種翻譯后修飾。這些修飾的類型和 程度通常取決于用來表達抗體的宿主細胞系和培養條件。這樣的修飾可包括糖基化、甲硫 氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸異構化和天冬酰胺脫酰胺作用中的變化。常用的修飾 是由于羧肽酶的作用而導致的羧基-末端堿性殘基（例如賴氨酸或精氨酸）的缺失（如 Harris,RJ.JournalofChromatography705:129-134, 1995 中描述的）。因此，抗體重鏈 的C-末端賴氨酸可以缺失。
[0137] 在一個實施方案中，抗體重鏈包含CHl結構域，并且抗體輕鏈包含κ或者λCL結 構域。
[0138] 在一個實施方案中，輕鏈具有SEQIDNO:22所示的序列，并且重鏈具有SEQID NO:43所示的序列。
[0139] 在一個實施方案中，輕鏈具有SEQIDNO:22所示的序列，并且重鏈具有SEQID NO:72所示的序列。
[0140] 在一個實施方案中，抗體分子的C-末端氨基酸在翻譯后修飾過程中被切割。
[0141] 在一個實施方案中，抗體分子的N-末端氨基酸在翻譯后修飾過程中被切割。
[0142] 本發明還提供了人FcRn的特定區域或表位，其被本發明提供的抗體，特別地包含 重鏈序列gH20(SEQIDN0:29)和/或輕鏈序列gL20(SEQIDN0:15)的抗體結合。
[0143] 可通過本領域中已知的任何適當的表位作圖技術結合本發明提供的任一種抗體 來鑒定人FcRn多肽的該特定區域或表位。這樣的方法的實例包括篩選來源于FcRn的具有 不同長度的肽對本發明的抗體的結合，可特異性結合抗體的最小片段包含被該抗體識別的 表位序列。可合成地產生FcRn肽或通過FcRn多肽的蛋白水解消化來產生。可通過例如質 譜分析來鑒定結合抗體的肽。在另一個實例中，可使用NMR光譜分析或X射線晶體學來鑒 定被本發明的抗體結合的表位。經鑒定后，若需要，可將結合本發明的抗體的表位片段用作 免疫原以獲得結合所述表位的額外抗體。
[0144] 在一個實施方案中，本公開內容的抗體結合如下所示的人FcRna鏈胞外序列：
[0145]AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFffVSGffLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGA WVffENQVSffYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGP?TLQGLLGCELGPDNTSVPTAKF AT,NGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEAII,ATSQRffQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRCNLEWKEPP SMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQ⑶FGPNSDGSFHASSSLTVKS⑶EHHY CCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSS(SEQIDN0：94).
[0146] 加以下劃線的殘基是已知對于人FcRn與人IgG的Fe區的相互作用至關重要的那 些殘基，粗體顯示的那些殘基是參與FcRn與本公開內容的1519抗體的相互作用的那些殘 基，所述1519抗體包含重鏈序列gH20(SEQIDN0:29)和輕鏈序列gL20(SEQIDN0:15)。
[0147] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含至少一個選自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一個 例如至少 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個選自SEQIDN0:94 中的P100、E115、E116、F117、M118、 N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、D130、W131、P132 和E133 的殘基。
[0148] 在一個實例中，使用與β2Μ復合的FcRna鏈胞外序列（SEQIDNO: 94)通過X射 線晶體學來測定抗體分子的表位。
[0149] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含至少一個選自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一個 例如至少 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個選自SEQIDN0:94 中的E115、E116、F117、M118、N119、 F120、D121、L122、K123 和Q124 的殘基。
[0150] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含至少兩個、三個、四個或五個選自SEQIDN0:94中的￥105、？106、1107、4108和1(109的氨 基酸，和至少一個選自SEQIDN0:94 中的E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、 K123和Q124的殘基。
[0151] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含至少一個選自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一個 選自SEQIDN0:94 中的P100、E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、 G128、G129、D130、W131、P132 和E133 的殘基。
[0152] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含至少一個選自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一個 選自SEQIDN0:94 中的P100、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124 和G128 的殘基。
[0153] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含SEQIDN0:94 中的殘基V105、P106、T107、A108和K109，和至少一個選自SEQIDN0:94 中的P100、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124 和G128 的殘基。
[0154] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含SEQIDN0:94 中的殘基V105、P106、T107、A108 和K109,和至少一個選自SEQIDN0:94 中的P100、E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、D130、 W131、P132 和E133 的殘基。
[0155] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含SEQIDN0:94中的殘基P100、V105、P106、T107、A108和K109，和至少一個選自SEQID N0:94 中的E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、D130、 W131、P132 和E133 的殘基。
[0156]在一個實例中，'至少一個殘基'可以是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或16個殘基。
[0157] 在一個實例中，本發明提供結合人FcRn的表位的抗-FcRn抗體分子，所述表位包 含SEQIDN0:94中的殘基100、105至109、115至124和129至133或由所述殘基組成。
[0158] 交叉阻斷根據本發明的抗體分子，特別地包含SEQIDN0:29所示的重鏈序列和 SEQIDNO: 15所示的輕鏈序列的抗體分子的結合的抗體可類似地用于阻斷FcRn活性。因 此，本發明還提供抗-FcRn抗體分子，其交叉阻斷上文中描述的任一種抗體分子與人FcRn 的結合和/或被這些抗體的任一種交叉阻斷而不能結合人FcRn。在一個實施方案中，這樣 的抗體結合至與上文中描述的抗體相同的表位。在另一個實施方案中，交叉阻斷中和抗體 結合至與上文中描述的抗體所結合的表位相鄰和/或重疊的表位。
[0159] 可使用本領域中任何適合的方法來鑒定交叉阻斷抗體，例如通過使用競爭ELISA 或BIAcore測定，其中交叉阻斷抗體與人FcRn的結合阻止本發明的抗體的結合，或反之亦 然。這樣的交叉阻斷測定可使用分離的天然或重組FcRn或適當的融合蛋白/多肽。在一 個實例中，使用重組人FcRn胞外結構域（SEQIDN0:94)來測量結合和交叉阻斷。在一個 實例中，將重組人FcRna鏈胞外結構域用在與β2微球蛋白（i3 2M)(SEQIDN0:95)的復 合物中。
[0160] 在一個實施方案中，提供了抗-FcRn抗體分子，其阻斷FcRn與IgG的結合，并且交 叉阻斷其重鏈包含SEQIDNO: 29所示的序列和其輕鏈包含SEQIDNO: 15所示的序列的抗 體與人FcRn的結合。在一個實施方案中，本發明提供的交叉阻斷抗體將包含SEQIDNO: 29 所示的重鏈序列和SEQIDNO: 15所示的輕鏈序列的抗體的結合抑制超過80%,例如超過 85 %，例如超過90 %，特別地超過95 %。
[0161] 可選擇地或另外的，根據本發明的該方面的抗-FcRn抗體可以被包含SEQID NO: 29所示的重鏈序列和SEQIDNO: 15所示的輕鏈序列的抗體交叉阻斷而不能與人FcRn 結合。因此還提供了抗-FcRn抗體分子，其阻斷FcRn與IgG的結合，并且被包含SEQID NO: 29所示的重鏈序列和SEQIDNO: 15所示的輕鏈序列的抗體交叉阻斷而不能與人FcRn 結合。在一個實施方案中，包含SEQIDNO:29所示的重鏈序列和SEQIDNO: 15所示的輕 鏈序列的抗體將本發明的該方面提供的抗-FcRn抗體與人FcRn的結合抑制超過80 %，例如 超過85 %，例如超過90 %，特別地超過95 %。
[0162] 在一個實施方案中，本發明提供的交叉阻斷抗體是完全人的。在一個實施方案中， 本發明提供的交叉阻斷抗體是人源化的。在一個實施方案中，本發明提供的交叉阻斷抗體 對人FcRn的親和力為IOOpM或更少。在一個實施方案中，本發明提供的交叉阻斷抗體對人 FcRn的親和力為50pM或更少。可使用下文中描述的方法來測量親和力。
[0163] 生物分子例如抗體或片段，包含酸性和/或堿性的功能基團，從而使得該分子帶 凈的正電荷或負電荷。總共的"被觀察到的"電荷量將取決于實體的絕對氨基酸序列、帶電 基團在3D結構中的局部環境和分子的環境條件。等電點（pi)是特定分子或其溶劑可及表 面不帶凈電荷時的pH。在一個實例中，可將本發明的FcRn抗體和片段工程化以具有合適的 等電點。這可導致抗體和/或片段具有更穩定的性質，特別地合適的溶解度和/或穩定性 特征譜和/或改善的純化特征。
[0164] 因此在一個方面，本發明提供了人源化FcRn抗體，其經工程化而具有與原始鑒定 的抗體的等電點不同的等電點。可以例如通過置換氨基酸殘基，例如用一種或多種堿性氨 基酸殘基置換酸性氨基酸殘基來工程化抗體。或者，可引入堿性氨基酸殘基或可去除酸性 氨基酸殘基。或者，如果分子具有不可接受的高Pi值，則可按需引入酸性殘基以降低pi。 重要的是當操縱Pi時，必須小心操作以保持抗體或片段的期望活性。因此在一個實施方案 中，經工程化的抗體或片段具有與"未修飾的"抗體或片段相同的或大體上相同的活性。
[0165] 可使用程序例如**ExPASY http://www. expasy. ch/tools/pi tool, html,和
[0166]http://www. iut-arles. up. univ-mrs· fr/w3bb/d abim/compo-D. html,來予頁測丨抗 體或片段的等電點。
[0167] 本發明的抗體分子適當地具有高的結合親和力，特別地在納摩爾范圍內的親和 力。可以使用本領域中已知的任何適當的方法包括如本文的實施例中描述的BIAcore，利用 分離的天然或重組FcRn或適當的融合蛋白/多肽來測量親和力。在一個實例中，使用如本 文的實施例中描述的重組人FcRn胞外結構域（SEQIDN0:94)來測量親和力。在一個實例 中，使用與β2微球蛋白（β2Μ)(SEQIDNO:95)締合的重組人FcRna鏈胞外結構域（SEQ IDN0:94)來測量親和力。適當地，本發明的抗體分子對分離的人FcRn的結合親和力為約InM或更少。在一個實施方案中，本發明的抗體分子的結合親和力為約500pM或更少（即 更高的親和性）。在一個實施方案中，本發明的抗體分子的結合親和力為約250pM或更少。 在一個實施方案中，本發明的抗體分子的結合親和力為約200pM或更少。在一個實施方案 中，本發明提供結合親和力為約IOOpM或更少的抗-FcRn抗體。在一個實施方案中，本發明 提供結合親和力為約IOOpM或更少的人源化抗-FcRn抗體。在一個實施方案中，本發明提 供結合親和力為50pM或更少的抗-FcRn抗體。
[0168] 重要地，本發明的抗體能夠在pH6和pH7. 4下以相當的結合親和力結合人FcRn。 從而有利地，即使在內涵體內抗體也能夠持續結合FcRn，從而最大化地阻斷FcRn與IgG的 結合，參見圖10對機制的舉例說明。
[0169] 在一個實施方案中，本發明提供在pH6和pH7. 4下測量時具有IOOpM或更少的結 合親和力的抗-FcRn抗體。
[0170] 可由本領域技術人員使用常規技術例如Scatchard等人描述的那些（Ann. KY.Acad.Sci. 51:660-672(1949))，或者通過表面等離子體共振技術（SPR)使用例如 BIAcore的系統來測定本發明的抗體或結合片段的親和力以及結合劑（例如抗體）抑制結 合的程度。對于表面等離子體共振技術，將靶分子固定于固相上并暴露于沿著流動池流動 的流動相中的配體。如果發生對固定靶的配體結合，那么局部折射率發生變化，從而導致 SPR角的變化，這可通過檢測折射光強度的變化來實時監測。可分析SPR信號的變化率以 給出結合反應的締合相和解離相的表觀速率常數。這些值的比率給出表觀平衡常數（親和 力）（參見例如，Wolff等人，CancerRes. 53:2560-65(1993))。
[0171] 在本發明中，通常如下所述地使用SPR測定測試抗體分子的親和力。將測試抗體 分子捕獲在固相上，將與β2Μ非共價復合的人FcRna鏈胞外結構域在流動相中于被捕獲 的抗體上方流過并測定測試抗體分子對人FcRn的親和力。可以使用任何適當的方法例如 使用抗-Fc或抗Fab'特異性捕獲劑將測試抗體分子捕獲在固相芯片表面。在一個實例中， 在PH6下測定親和力。在一個實例中，在ρΗ7· 4下測定親和力。
[0172] 將理解可以使用本領域中已知的任何適當的方法來改變本發明提供的抗 體的親和力。本發明從而還涉及本發明的抗體分子的變體，所述變體具有改善的對 于FcRn的親和力。可通過許多親和力成熟方案包括突變⑶R(Yang等人，J.Mol. Biol. . 254. 392-403, 1995)、鏈改組（Marks等人，Bio/Technology，l^，779-783, 1992)、 使用大腸桿菌（E.coli)的增變株（Low等人，J.Mol.Biol.，250, 359-368, 1996)、 DNA改組（Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol·, §,724-733, 1997)、噬菌體展不 (Thompson等人，J.Mol.Biol. , 256, 77-88, 1996)和有性PCR(sexualPCR)(Crameri等 人，Nature, 391, 288-291, 1998)來獲得這樣的變體。Vaughan等人（同上）討論了這些親 和力成熟的方法。
[0173] 在一個實施方案中，本發明的抗體分子阻斷人FcRn活性。適合用于確定抗體阻 斷FcRn的能力的測定描述于本文的實施例中。適當的用于確定抗體是否阻斷FcRn與循環 的IgG分子的相互作用的測定描述于本文的實施例中。適合用于確定抗體分子在體外阻斷 IgG再利用的能力的測定描述于下文中。
[0174] 若需要，可將用于本發明的抗體綴合于一個或多個效應分子。將理解，效應分子 可包含單個效應分子或兩個或更多個這樣的分子（如此連接以形成可連接于本發明的抗 體的單個部分）。當期望獲得連接于效應分子的抗體片段時，這可通過標準化學或重組 DNA法（其中將抗體片段直接或通過偶聯劑連接于效應分子）來制備。用于將這樣的效 應分子綴合于抗體的技術在本領域是公知的（參見，Hellstrom等人，ControlledDrug Delivery, 2ndEd.，Robinson等人，eds.，1987,ρρ· 623-53;Thorpe等人，1982,Tmmunol. Rev.，62:119-58 和Dubowchik等人，1999,PharmacologyandTherapeutics, 83, 67-123)。 具體化學方法包括例如WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476 和 W003031581中描述的方法。或者，當效應分子是蛋白質或多肽時，連接可使用重組DNA法， 例如WO86/01533和EP0392745中描述的方法來實現。
[0175] 如本文中所用，術語效應分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白例如 酶、其它抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其片 段、放射性核素，特別地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金屬、納米顆粒和報道基團例如 熒光化合物或可通過NMR或ESR光譜分析檢測的化合物。
[0176] 效應分子的實例可包括細胞毒素或細胞毒性劑，包括對細胞有害（例如殺死）的 任何試劑。實例包括考布他汀（combrestatin)、多拉司他汀、埃博霉素、星形孢菌素、美登 素類化合物（maytansinoid)、海綿毒素（spongistatin)、根霉素、軟海綿素、桿孢菌素、哈 米特林（hemiasterlins)、泰素、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴乙陡、依米丁（emetine)、絲裂 霉素、依托泊苷、鬼白噻吩式（tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉 素、二輕基炭疽菌素二酮（dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、 1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或 同源物。
[0177] 效應分子還包括但不限于抗代謝藥（例如甲氨蝶呤、6-巰嘌呤，6-硫鳥 嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺），烷化劑（例如氮芥、噻替哌苯丁酸氮芥 (thioepachlorambucil)、美法侖、卡莫司汀（BSNU)和洛莫司汀（CCNU)、環磷酰胺 (cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C，和順-二氯二氨鉬（II) (DDP)順鉬）、蒽環類（例如柔紅霉素（以前稱為道諾霉素）和多柔比星）、抗生素（例如 更生霉素（以前稱為放線菌素）、博來霉素、光輝霉素、氨茴霉素（AMC)、卡奇霉素或多卡米 星）和抗有絲分裂劑（例如長春新堿和長春堿）。
[0178] 其它效應分子可包括螯合放射性核素例如111In和9°Y、Lu1'鉍213、锎252、銥192和 鎢187錸188;或藥物例如但不限于烷基磷酸膽堿、拓撲異構酶I抑制劑、紫杉烷和舒拉明。
[0179] 其它效應分子包括蛋白質、肽和酶。目標酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂 解酶、異構酶、轉移酶。目標蛋白質、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思豆毒 蛋白、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白質例如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干 擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織型纖溶酶原激活物、血栓形成 劑或抗血管生成劑例如血管他丁或內皮他丁，或生物反應修飾劑例如淋巴因子、白細胞介 素-I(IL-I)、白細胞介素-2 (IL-2)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、粒細胞集落 刺激因子（G-CSF)、神經生長因子（NGF)或其它生長因子和免疫球蛋白。
[0180] 其它效應分子可包括用于例如診斷的可檢測物質。可檢測物質的實例包括各種 酶、輔基、熒光材料、發光材料、生物發光材料、放射性核素、正電子發射金屬（用于正電子 發射斷層攝影術）和非放射性順磁性金屬離子。關于可綴合于抗體以用作診斷劑的金屬離 子，通常參見美國專利No. 4, 741，900。適當的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適當的輔基包括鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素； 適當的熒光材料包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹酰氯 和藻紅蛋白；適當的發光材料包括魯米諾；適當的生物發光材料包括螢光素酶、螢光素和 水母發光蛋白；以及適當的放射性核素包括 125I、131I、mIn和"Tc。
[0181] 在另一個實例中，效應分子可增加抗體的體內半衰期和/或減小抗體的免疫原性 和/或增強抗體穿過上皮屏障至免疫系統的遞送。該類型的適當效應分子的實例包括聚合 物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物例如WO05/117984中描述的那些蛋白質 或化合物。
[0182] 在一個實施方案中，效應分子提供的不依賴于FcRn的半衰期是有利的。
[0183] 當效應分子是聚合物時，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任選地取 代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化亞烷基聚合物或分支多糖或未分支多糖，例 如同聚或異聚多糖。
[0184] 可存在于上述合成聚合物上的具體的任選取代基包括一個或多個羥基、甲基或甲 氧基。
[0185] 合成聚合物的具體實例包括任選地取代的直鏈或支鏈聚（乙二醇）、聚（丙二 醇）、聚（乙烯醇）或其衍生物，特別地任選地取代的聚（乙二醇）例如甲氧基聚（乙二醇） 或其衍生物。
[0186] 具體的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
[0187] 在一個實施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。
[0188] 本文中使用的"衍生物"意欲包括反應性衍生物，例如巰基選擇性反應基團例如馬 來酰亞胺類等。反應基團可直接或通過接頭片段連接于聚合物。將理解，這樣的基團的殘 基在一些情況下將形成產物的部分作為抗體片段與聚合物之間的連接基團。
[0189] 可按需要改變聚合物的尺寸，但聚合物的尺寸通常在500Da至50000Da，例如5000 至40000Da、例如20000至40000Da的平均分子量范圍內。可特別地基于產物的期望用途例 如定位至某些組織例如腫瘤的能力或延長循環半衰期的能力來選擇聚合物尺寸（關于綜 述，參見Chapman, 2002,AdvancedDrugDeliveryReviews, 54, 531-545)。因此，例如，當意 欲產物離開循環和滲入組織，例如用于治療腫瘤時，可有利地使用小分子量（例如具有約 5000Da的分子量）聚合物。對于其中產物保留在循環中的應用，可有利地使用具有更高分 子量的聚合物，例如具有在20000Da至40000Da的范圍內的分子量。
[0190] 適當的聚合物包括聚亞烷基聚合物，例如聚（乙二醇）或，特別地甲氧基聚（乙二 醇）或其衍生物，并且特別地具有在約15000Da至約40000Da的范圍內的分子量。
[0191] 在一個實例中，將用于本發明的抗體連接于聚（乙二醇）（PEG)部分。在一個特 定實例中，抗體是抗體片段，并且可通過任何可獲得的位于抗體片段中的氨基酸側鏈或末 端氨基酸官能團（例如任何游離氨基、亞胺基、巰基、羥基或羧基）來連接PEG分子。這 樣的氨基酸可天然存在于抗體片段中或可使用重組DNA法工程化入片段（參見例如US 5, 219, 996;US5, 667, 425;TO98/25971、TO2008/038024)。在一個實例中，本發明的抗體 分子是修飾的Fab片段，其中修飾是將一個或多個氨基酸添加至其重鏈的C末端以允許效 應分子附著。適當地，添加的氨基酸形成效應分子可附著的包含一個或多個半胱氨酸殘基 的修飾的鉸鏈區。多個位點可用于連接兩個或更多個PEG分子。
[0192] 適當地通過位于抗體片段中的至少一個半胱氨酸殘基的巰基共價連接PEG分子。 每一個連接于修飾抗體片段的聚合物分子可共價地連接于位于片段中的半胱氨酸殘基的 硫原子。共價連接通常為二硫鍵或特別地硫-碳鍵。當巰基用作連接點時適當地可使用激 活的效應分子，例如巰基選擇性衍生物例如馬來酰亞胺和半胱氨酸衍生物。激活的聚合物 可在上述聚合物-修飾抗體片段的制備中用作起始材料。激活的聚合物可以是包含巰基反 應基團例如α-鹵代羧酸或酯例如碘乙酰胺、酰亞胺例如馬來酰亞胺、乙烯基砜或二硫化 物的任何聚合物。這樣的起始材料可商購獲得（例如來自Nektar,先前稱為Shearwater PolymersInc. ,Huntsville,AL,USA)或可使用常規化學法從商購可得的起始材料制備。 具體的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺（獲自Nektar,先前稱為Shearwater;Rapp Polymere;和SunBio)和M-PEG-SPA(獲自Nektar,先前稱為Shearwater)。
[0193] 在一個實施方案中，抗體是修飾的Fab片段、Fab'片段或diFab，其是 PEG化的，即具有例如根據EP0948544或EP1090037中公開的方法共價連接至其 的PEG(聚（乙二醇））（也參見〃Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical andBiomedicalApplications"，1992,J.MiltonHarris(ed),PlenumPress,New York, ^Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications^, 1997,J. MiltonHarrisandS.Zalipsky(eds),AmericanChemicalSociety,Washington DCancT'BioconjugationProteinCouplingTechniquesfortheBiomedical Sciences^, 1998,M.AslamandA.Dent,GrovePublishers,NewYork; Chapman,A. 2002,AdvancedDrugDeliveryReviews2002, 54:531-545)。在一個實例中， 將PEG連接于鉸鏈區中的半胱氨酸。在一個實例中，PEG修飾的Fab片段具有共價連接于 修飾的鉸鏈區中的單個巰基的馬來酰亞胺基團。可將賴氨酸殘基共價連接于馬來酰亞胺基 團，并且可將具有約20000Da的分子量的甲氧基聚（乙二醇）聚合物連接于賴氨酸殘基上 的每一個氨基。連接于Fab片段的PEG的總分子量從而可以是約40000Da。
[0194] 特定的PEG分子包括Ν，Ν' -二（甲氧基聚（乙二醇））（MW20000)修飾的賴氨酸 的2-[3-(Ν-馬來酰亞胺）丙酰胺基]乙酰胺，也稱為PEG2MAL40K(可獲自Nektar，先前稱 為Shearwater)〇
[0195] 備選的PEG接頭的來源包括N0F，其提供GL2-400MA3 (其中下面的結構中的m為 5)和GL2-400MA(其中m為2)以及η為約450 :
[0196]
【權利要求】
1. 抗-FcRn抗體或其結合片段，所述抗體或其結合片段包含具有可變區的重鏈或重鏈 片段，其中所述可變區包含獨立地選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的一個、 兩個或三個⑶R。
2. 權利要求1的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中⑶R HI具有SEQ ID NO: 1所示的序 列。
3. 權利要求1或2的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中⑶R H2具有SEQ ID NO: 2所示 的序列。
4. 權利要求1-3任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中⑶R H3具有SEQ ID NO: 3 所示的序列。
5. 權利要求1-4任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中所述抗體或結合片段還包 含具有可變區的輕鏈或其片段，其中所述可變區包含獨立地選自SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和SEQ ID NO:6的一個、兩個或三個CDR。
6. 權利要求5的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中⑶R LI具有SEQ ID NO: 4所示的序 列。
7. 權利要求5或6的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中⑶R L2具有SEQ ID NO: 5所示 的序列。
8. 權利要求5-7任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中⑶R L3具有SEQ ID NO:6 所示的序列。
9. 權利要求1-8任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中所述抗體是人源化的。
10. 權利要求1-9任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，所述抗體或其結合片段具有包 含SEQ ID NO:29所示的序列的重鏈和包含SEQ ID NO: 15所示的序列的輕鏈。
11. 與人FcRn結合的抗-FcRn抗體或其結合片段，所述抗體或其結合片段包含重鏈和 輕鏈，其中所述重鏈的可變結構域包含與SEQ ID N0:29所示的序列具有至少80%同一性或 相似性的序列，并且其中輕鏈的可變結構域包含與SEQ ID NO: 15所示的序列具有至少80% 同一性或相似性的序列。
12. 權利要求1-11任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中所述抗體是scFv、Fv、 Fab或Fab'片段。
13. 權利要求12的抗-FcRn抗體Fab'片段，其具有包含SEQ ID NO:36所示的序列的 重鏈和包含SEQ ID NO:22所示的序列的輕鏈。
14. 權利要求1-13任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中所述抗體或結合片段綴 合于聚合物例如選自淀粉、白蛋白和聚乙二醇的聚合物。
15. 權利要求14的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中所述聚合物是PEG，例如具有 5-50kDa的分子量的PEG。
16. 權利要求1-11任一項的抗-FcRn抗體，其中所述抗體是全長抗體。
17. 權利要求16的抗-FcRn抗體，其中所述全長抗體選自IgGl、IgG4和IgG4P。
18. 權利要求16或17的抗-FcRn抗體，其具有包含SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 87或 SEQ ID N0:43所示的序列的重鏈和包含SEQ ID N0:22所示的序列的輕鏈。
19. 權利要求1-11任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中所述抗體或其結合片段 是Fab-dsFv，其具有包含SEQ ID N0:50所示的序列的重鏈和包含SEQ ID N0:46或SEQ ID NO:78所示的序列的輕鏈。
20. 抗-FcRn抗體或其結合片段，所述抗體或其結合片段對人FcRn的結合親和力為 100pM或更少。
21. 權利要求20的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中在pH6和pH7. 4測量時，對人FcRn 的結合親和力為l〇〇pM或更少。
22. 抗-FcRn抗體或其結合片段，其結合與權利要求10的抗體相同的人FcRn表位。
23. 結合人FcRn表位的抗-FcRn抗體或其結合片段，其中所述表位包含至少一個選自 SEQ ID N0:94中的殘基￥105、？106、1107、4108和1(109的氨基酸，和至少一個選自5￡〇10 N0:94 中的 P100、E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、 D130、W131、P132 和 E133 的殘基。
24. 抗-FcRn抗體或其結合片段，其交叉阻斷權利要求10的抗體與人FcRn的結合或被 權利要求10的抗體交叉阻斷與人FcRn的結合。
25. 權利要求20-24任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其是人源化或完全人的。
26. 權利要求22-25任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其對人FcRn的結合親和力 為100pM或更少。
27. 權利要求1-26任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其與人FcRn結合。
28. 權利要求1-27任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其阻斷人IgG與人FcRn的結 合。
29. 權利要求1-28任一項的抗-FcRn抗體或其結合片段，其不結合0 2微球蛋白。
30. 用于檢測測試分子例如抗體分子阻斷人FcRn活性的能力，特別是人FcRn再利用 IgG的能力的測定，其中方法包括步驟： a) 將重組地表達人FcRn a鏈和人￠2微球蛋白（P2M)的非人哺乳動物細胞涂覆在表 面上， b) 在溫和的酸性條件下例如約pH5. 9將細胞與測試抗體分子和待被細胞再利用的IgG 接觸充足的時間以允許測試抗體分子和IgG與FcRn結合， c) 用微酸性的緩沖液洗滌，和 d) 檢測被細胞內化和/或再利用的IgG的量。
31. 權利要求30的測定，其中將測試抗體分子先于待被再利用的IgG添加，并溫育充足 的時間以允許在添加待被再利用的IgG之前測試抗體分子與FcRn的結合。
32. 分離的DNA序列，其編碼權利要求1-29任一項的抗體的重鏈和/或輕鏈。
33. 包含一種或多種權利要求32的DNA序列的克隆或表達載體。
34. 權利要求33的載體，其中所述載體包含i )SEQ ID NO:37所示的序列和SEQ ID N0:23所示的序列或ii)SEQ ID N0:80所示的序列和SEQ ID N0:79所示的序列或iii)SEQ ID NO:93所示的序列和SEQ ID NO:91所示的序列。
35. 宿主細胞，其包含一種或多種權利要求33或權利要求34的克隆或表達載體。
36. 用于產生對人FcRn具有結合特異性的抗體的方法，其包括培養權利要求35的宿主 細胞和分離抗體。
37. 藥物組合物，其包含與一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合的權 利要求1-29任一項中定義的抗-FcRn抗體或其結合片段。
38. 權利要求37的藥物組合物，其另外地包含其它活性成分。
39. 權利要求1-29任一項中定義的抗體或其結合片段或權利要求37或38中定義的組 合物，其用于治療用途。
40. 權利要求1-29任一項中定義的抗體或其結合片段或權利要求37或38中定義的組 合物，其用于治療自身免疫性疾病，例如重癥肌無力、尋常天皰瘡、視神經脊髓炎、格-巴二 氏綜合征、狼瘡和血栓性血小板減少性紫癜。
41. 治療患者的方法，包括施用治療有效量的權利要求1-29任一項中定義的抗體或其 結合片段或權利要求37或38中定義的組合物。
42. 權利要求41的方法，其中所述治療用于自身免疫性疾病，例如重癥肌無力、尋常天 皰瘡、視神經脊髓炎、格-巴二氏綜合征、狼瘡和血栓性血小板減少性紫癜。
【文檔編號】G01N33/53GK104364265SQ201380025216
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年5月13日 優先權日:2012年5月14日
【發明者】H·M·芬尼, A·D·G·勞森, S·G·紹爾, B·J·史密斯, K·L·泰森, L·科夫凱恩, C·梅爾, K·薩卡爾, P·A·阿瑟羅夫德 申請人:Ucb醫藥有限公司