酶檢測裝置制造方法

酶檢測裝置制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測測試樣品中酶活性的酶檢測裝置。本發明也涉及用于檢測測試樣品中的酶活性特別是酶裂解活性的指示分子，和用于檢測酶活性存在的方法。
【專利說明】酶檢測裝置

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酶檢測裝置，盡管并非是專門地，特別涉及一種用于檢測測試樣 品中酶活性的裝置。本發明也涉及用于檢測測試樣品中酶活性的指示分子和用于檢測測試 樣品中酶活性存在的方法。
[0002] 發明背景
[0003] 酶組成參與生物體內催化化學反應的蛋白質家族。由于它們的重要性，大量情形 中測量酶水平，以及重要地，酶活性是必須和/或有益的。
[0004] 特別是已發現酶活性的增加與特定的健康狀況和/或疾病相關。例如，升高的蛋 白酶活性與癌癥進展的許多方面有關聯。因此，測量取自具有特別健康狀況或疑似具有特 定健康狀況或疾病的個體的樣品中的酶活性可能對預后目的或診斷目的是有用的。
[0005] 在酶家族內，有六個酶的主要類別：氧化還原酶；轉移酶；水解酶；裂解酶；異構酶 和連接酶。這種分類是基于每個類別內的酶催化的反應類型。例如，水解酶通常催化它們 底物內的化學鍵的水解，尤其（inter alia)包括例如蛋白酶、肽酶、脂酶和核酸酶的酶。
[0006] 之前已經建立了測量酶活性的試驗；然而，經常關聯有問題或局限。例如，一些 酶檢測裝置僅用于測量裂解其底物的酶的活性。US2006/0003394中描述了這樣的裝置， 包括試劑盒，含有底物-報告子"反應復合物"，其被加至已知或疑似含有所述酶的測試樣 品。所述酶-反應復合物施加至層析介質，于是在一個上游位置出現反應復合物的固定。 如果所述底物被測試樣品內存在的酶裂解，反應復合物的報告部分被釋放并流動至下游位 置，在那里它能夠被單獨檢測。由于酶活性的檢測是基于來自原反應復合物的報告"離開 基團"的測量，因此這種裝置一點也不適合于測量修飾其底物，而不是裂解其底物的酶的 活性。例如，轉移酶催化轉移例如磷酸基團的功能基團至它們的底物，這樣就不能夠使用 US2006/0003394描述的裝置檢測。
[0007] 已經描述了不同的適合于檢測修飾底物的酶的活性的裝置。W02009/024805中描 述了一種這樣的裝置，其基于使用攜帶可檢測標記的"底物識別分子"（SRM)，其中所述SRM 特異地結合至未修飾或修飾狀態的酶底物。
[0008] 如W02009/024805中描述的測定，經常需要適合于區分修飾和未修飾兩種形式的 酶底物和有效檢測的非常特異的檢測試劑。使用這種裝置獲得的測定結果的精確性和可靠 性因此受合適試劑的可用性所限。
[0009] 發明概沭
[0010] 本發明通過提供一種用于精確檢測測試樣品中酶活性的標準化、魯棒裝置，尋求 解決與現有酶檢測裝置相關的至少有些問題。
[0011] 本發明特別提供一種裝置，其中在兩相中有效進行酶活性的檢測。在第一相中，試 劑用于區分酶底物的修飾的和未修飾形式，在第二相，測量這其中任一種或兩種形式的檢 測以確定酶活性。本裝置給出一種測量測試樣品中酶活性的標準分析模式，其能夠容易地 適配于測量任意相關酶的活性。
[0012] 本發明也提供一種指示分子，用于檢測測試樣品中的酶活性。
[0013] 根據本發明的第一方面，提供一種用于檢測測試樣品中酶活性的指示分子，包 括：
[0014] (i)酶可修飾區域（an enzyme modifiable region)，能夠被所述酶修飾，引起該區 域從未修飾狀態向修飾狀態的轉變；
[0015] (ii)間隔開的捕獲位點，不論酶可修飾區域的修飾狀態如何，該捕獲位點可以被 捕獲分子結合；和
[0016] (iii)間隔開的檢測位點。
[0017] 在某些實施方式中，所述指示分子的酶可修飾區域包括裂解位點，以使得該指示 分子用于檢測能夠裂解其底物的酶的活性。在裂解位點的裂解引起酶可修飾區域從未修飾 狀態轉變至修飾狀態，也引起指示分子的片段的釋放，該片段由所述檢測位點組成，基本由 其組成，或包括所述檢測位點。所述酶或待檢測酶可選自如下種類：氧化還原酶、水解酶和 裂解酶，并包括蛋白酶、肽酶、脂酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶（phosphatase)、硫酸酯酶、神經氨 酸苷酶、酯酶、DNA酶和RNA酶的亞種。在優選實施方式中，所述指示分子用于檢測蛋白酶 活性。
[0018] 在本發明的某些實施方式中，所述酶可修飾區域可以包括多個裂解位點，其中在 任何一個位點的裂解引起檢測位點從指示分子的捕獲位點分離。在本發明的文本中，術語 "多個"指至少兩個、至少三個、至少四個等等。
[0019] 因此，本發明提供一種用于測試樣品中酶裂解活性檢測的指示分子，包括：
[0020] (i)包括多個裂解位點的酶可修飾區域，其中任何一個裂解位點的裂解引起該區 域從非修飾狀態向修飾狀態的轉變；
[0021] (ii)間隔開的捕獲位點，不論該酶的可修飾區域的修飾狀態如何，該捕獲位點可 以被捕獲分子結合；和
[0022] (iii)間隔開的檢測位點。
[0023] 在某些實施方式，所述指示分子包括2、3、4、5和10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、25、50、100、500或1000個之間的裂解位點。在某些實施方式，所述指示分子包括2 和5、6、7、8、9或10個之間的裂解位點。
[0024] 在一個實施方式中，多個裂解位點可以都是相同的。在這種配置中，重復的裂解位 點可以相對非特異或可以對如上限定的一種酶或酶亞型高度特異。此外，使用這種類型的 指示分子可以通過提供增加測試樣品內存在的裂解位點的濃度的方式而有助于提高所述 酶檢測裝置的靈敏性。
[0025] 在其他實施方式中，所述指示分子可以包括多個裂解位點，其中在相同指示分子 內存在至少兩個不同的裂解位點。在本發明的優選實施方式中，所述指示分子可以包括至 少3個、至少4個、至少5個，和達至少8個不同的裂解位點。
[0026] 在進一步優選的實施方式中，所述不同的裂解位點被如上定義的不同的酶或不同 的種類、亞種或亞型的酶識別，以使得本發明的裝置能夠用于檢測多種不同的酶的活性。所 述活性可以分組，以使酶活性的檢測提供有用的結果。例如，可以是涉及疾病狀態的一組 酶，這樣所述酶組的一個或多個的相關活性的檢測具有診斷意義。
[0027] 使用多個裂解位點（不論相同或不相同）可以對待檢測測試樣品中酶活性非常低 的情況特別有用。例如，以上定義的具有多個裂解位點的指示分子可以用于檢測含有低水 平蛋白酶的尿液樣品中的酶活性。
[0028] -旦根據本發明第一方面的指示分子被裂解，可使用本領域技術人員已知的合適 方式檢測所述檢測位點。在某些實施方式中，所述檢測位點本身可包括報告基團（moiety)， 其中報告基團這里定義為任意能夠生成或產生信號的基團。在本發明的優選實施方式中， 所述報告基團從如下選擇：_金顆粒、發色團、發光化合物、熒光分子、放射化合物、可視化 合物、脂質體或其他包含信號生成物質的囊泡、電活性物質、或酶和其底物的組合。用作報 告基團的合適的酶-底物組合可以是堿性磷酸酶和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽。可 選地，或另外地，檢測位點可以被本文下述的單獨的報告分子結合。
[0029] 這里描述的指示分子可以與根據本發明的酶檢測裝置協同使用。
[0030] 根據本發明的第二方面，提供一種用于檢測測試樣品中酶活性的酶檢測裝置，包 括：
[0031] (i)加入樣品中的指示分子，所述指示分子包括：
[0032] (a)酶可修飾區域，能夠被所述酶修飾，引起該區域從非修飾狀態到修飾狀態的轉 變；和
[0033] (b)檢測區域，不論該酶修飾區域的修飾狀態如何，該檢測區域不被該酶修飾和能 夠被報告分子結合；
[0034] (ii)接收測試樣品的選擇性捕獲區域（detection zone)，其中，該選擇性捕獲帶 包含能夠選擇性地結合處于修飾或非修飾的任一種狀態的指示分子的酶可修飾區域的選 擇性識別分子；和
[0035] (iii)接收與選擇性捕獲帶接觸后的測試樣品的檢測帶，其中，檢測帶與選擇性捕 獲帶空間上間隔開，以使得測試樣品對檢測帶的暴露發生在測試樣品對選擇性捕獲帶的預 暴露后，其中只有那些不結合選擇性捕獲帶中的選擇性識別分子的指示分子進入檢測帶， 其中在選擇性捕獲帶和/或檢測帶檢測指示分子。
[0036] 在使用中，測試樣品首先與選擇性捕獲帶接觸，其中修飾的或未修飾的指示分子 通過結合至選擇性識別分子被捕獲，隨后與檢測帶接觸，其中只有那些不結合選擇性捕獲 帶中的選擇性識別分子的指示分子進入檢測帶。可以使用本領域技術人員已知的合適的方 式，按照下述方式在檢測帶檢測在選擇性捕獲帶沒有被捕獲的指示分子。
[0037] 與本發明的裝置聯合使用的測試樣品可以是任意已知材料，或疑似含有酶，和可 以是來源于任意來源。在某些實施方式中，測試樣品可以來源于包括液體的生物來源，例如 血液、唾液、尿液、牛奶、創面積液、腹水、腹膜液、羊水等等。在優選實施方式中，所述測試樣 品是創面積液，所述裝置用于檢測在創面積液中的酶活性，優選蛋白酶活性，作為評估傷口 的狀況和/或愈合率的措施。在更優選的實施方式中，所述測試樣品是尿液，所述裝置用于 檢測尿中的酶活性，尤其是蛋白酶的活性。
[0038] 所述測試樣品可通過任意合適方式收集，并存在于任意適合于本裝置使用的形 式，包括固體或液體形式。此外，作為從其最初來源獲得測試樣品的一部分，所述樣品可以 在使用本發明的裝置測試前進行一種或多種處理或預處理步驟。在一個實施方式中，可以 處理固體樣品以產生用于測試的溶液或懸浮液。此外，在某些實施方式中，可以在使用本發 明的裝置測試前儲存測試樣品任意給定長度的時間，例如以大約_20°C冷凍作為保存樣品 的方式。
[0039] 本發明的裝置用于特異性檢測測試樣品中的酶活性。因此所述裝置可以用于間接 測量任意給定的測試樣品中是否實際存在或不存在一種酶。或者，已知提供的測試樣品中 存在酶，使用本發明的裝置可以測量所述酶的活性。例如，含有已知量的酶和酶活性的一種 或多種調節劑或疑似調節劑的測試樣品可與本裝置聯合使用。在本發明的一種實施方式 中，所述裝置用于測試酶活性的潛在調節劑或抑制劑。
[0040] 本裝置基于使用加入至測試樣品中的指示分子。所述指示分子首先包含"酶可修 飾區域"，其作為適合于被待檢測的相關酶修飾的底物被選擇。由相關的酶一如果存在于測 試樣品內一對酶可修飾區域的修飾引起這個區域從未修飾狀態向修飾狀態的轉變。
[0041] 在本發明的文本中，"酶可修飾區域的修飾"是指能夠由任意相關酶的作用帶來的 這個底物區域的任何改變。在本發明的某些實施方式中，修飾可以包括例如酶可修飾區域 的裂解或分別向該區域加入或從該區域去除一個化學基團的事件。此外，從未修飾狀態向 修飾狀態的轉變必須是所述酶可修飾區域的兩種形式通過如下進一步描述的所述裝置的 選擇性識別分子可區分的。
[0042] 在本發明的優選實施方式中，指示分子的酶可修飾區域包括多肽、蛋白質、碳水化 合物、脂質或核酸。此外，使用本發明所述裝置的待檢測酶可以選自如下種類：氧化還原酶、 轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶和連接酶，包括蛋白酶；肽酶；脂酶；核酸酶；糖酶；磷酸酶； 硫酸酶；神經氨酸苷酶；酯酶；DNA酶；RNA酶；激酶；糖基轉移酶；氧化酶；還原酶；和轉氨 酶的亞種。
[0043] 在優選實施方式中，本發明的裝置用于檢測來源于創傷的液體中的酶活性。在這 樣的實施方式中，待檢測的酶優選蛋白酶，特別是基質金屬蛋白酶（MMP)和人中性粒細胞 來源的彈性蛋白酶（HNE)。在優選實施方式中，待檢測酶是組織蛋白酶，特別是組織蛋白酶 G0
[0044] 在更優選實施方式中，本發明的裝置用于檢測收集自受試者尿液樣品的酶活性。 在這種實施方式中，待檢測酶優選蛋白酶，特別是基質金屬蛋白酶（MMP)和人中性粒細胞 來源的彈性蛋白酶（HNE)。
[0045] 在某些實施方式中，指示分子的酶可修飾區域可以包含或由與酶的天然底物或其 片段相同的一個區域組成。在另一實施方式中，酶可修飾區域可以是工程化的，以使其包含 非天然的酶底物。例如，酶可修飾區域可以是工程化的或突變的，以使所述相關酶顯示的酶 活性的速率和/或特異性相對于其天然底物升高（或如果合適的話下降）。
[0046] 此外，可以這樣選擇酶可修飾區域，即其是相對非特異性的，意味著多于一種如上 定義的酶或酶的亞類識別或作用于其上。例如，包括多肽底物或由其組成的酶可修飾區域， 可以受蛋白酶和肽酶兩者或蛋白酶和/或肽酶的亞組裂解，在酶可修飾區域被多于一種的 酶識別或作用的情況中，所述裝置可以用于檢測測試樣品中任意能夠修飾指示分子的這樣 酶（例如酶的個別的組或亞類）的存在。
[0047] 或者，可以這樣選擇酶可修飾區域，即其是高度特異性的，意味著只有一種酶或一 種亞型的酶能夠識別和修飾這個區域。這種情況中，亞型定義為落入以上定義的亞類的酶 的子類。在這樣的實施方式中，所述裝置可以滿足于測試樣品內單一的酶或單一的酶亞型。
[0048] 在某些實施方式中，酶可修飾區域可以只包含單一的修飾位點，即酶能夠作用的 單一位點或位置。例如，酶可修飾區域可以含有被一種或多種蛋白酶識別的單一的裂解位 點。在該特別位點或位置的修飾負責所述酶可修飾區域從其未修飾狀態至修飾狀態的轉 變。或者，酶可修飾區域可以含有多個這樣的修飾位點，這樣這些位點之一（或多個）的修 飾導致該區域從未修飾狀態至修飾狀態。在本發明的文本中，術語"多個"指至少兩個、至 少三個、至少四個等等。例如酶可修飾區域可以包含多個被一種或多種激酶識別的磷酸化 位點。
[0049] 在某些實施方式中，指示分子包括2、3、4、5和10、11、12、13、14、15、25、50、100、 500或1000之間的修飾位點。在一些實施方式，指示分子包括2和5、6、7、8、9或10個之間 的修飾位點。
[0050] 多個修飾位點存在于酶可修飾區域內時，這些位點可以都是相同的。例如酶可修 飾區域可以包含多個相同的裂解位點。重復的裂解位點可以是相對非特異的或可以高度特 異于以上定義的一種酶或酶亞型。
[0051] 在其他實施方式中，酶可修飾區域可以包含多個修飾位點，其中在相同的指示分 子內至少存在兩個不同的修飾位點。在本發明的優選實施方式中，指示分子可以包含至少 三個、至少四個、至少五個，和到至少五十個不同的修飾位點。在這些位點的任意一個的修 飾可以導致該區域從未修飾至修飾狀態的轉變。在更優選的實施方式，不同的修飾位點被 以上定義的不同的酶或不同種類、亞類或亞型的酶識別，這樣品發明的裝置能夠用于檢測 測試樣品內多種不同的酶的活性。
[0052] 在指示分子內使用多個修飾位點（無論相同或不相同）可以通過提供增加存在于 測試樣品內的修飾位點的濃度的方式有助于增加所述酶檢測裝置的靈敏性。這對測試樣品 中待測的酶活性非常低的情況可能特別有用。例如，以上定義的具有多個修飾位點的指示 分子可以用于檢測含有低水平蛋白質的尿液樣品中的酶活性。
[0053] 除了酶可修飾區域外，本發明的指示分子還包含檢測區域，檢測區域不受待檢測 酶的任何修飾。指示分子的檢測區域可以通過任何合適的方式連接于酶可修飾區域。在一 個實施方式，附著是通過直接共價連接。在另一實施方式中，指示分子的檢測區域通過連接 子（linker)或轉運蛋白（carrier protein)連接于酶可修飾區域。在指示分子的優選實 施方式，檢測區域和酶可修飾區域由不同的肽組成，轉運蛋白（carrier protein)由牛血清 白蛋白組成。對于酶可修飾區域和檢測區域通過轉運蛋白（carrier protein)相聯的實施 方式中，指示分子可以包括多個酶可修飾區域和/或檢測區域。
[0054] 在本發明的更優選實施方式中，指示分子的檢測區域包含捕獲位點，并且所述裝 置的檢測帶包含捕獲分子，指示分子一如果存在的話一的捕獲位點能夠結合至捕獲分子。 在更優選的實施方式中，指示分子的檢測區域包含與捕獲位點間隔開的檢測位點。
[0055] 這樣，在本發明的第三方面，提供一種用于測試樣品中酶活性的檢測的指示分子， 包括：
[0056] (i)酶可修飾區域，能夠被所述酶修飾，引起該區域從未修飾狀態至修飾狀態的轉 變，就被選擇性識別分子結合而言，未修飾和修飾狀態結構上可區分；
[0057] (ii)間隔的捕獲位點，無論酶可修飾區域的修飾狀態如何，捕獲位點能夠被捕獲 分子結合；和
[0058] (iii)間隔的檢測位點，無論酶可修飾區域的修飾狀態如何和無論預先或同時捕 獲分子結合至捕獲位點，檢測位點能被報告分子結合。
[0059] 根據本發明第三方面的指示分子可以與本文描述的酶檢測裝置聯合用于檢測酶 活性，或者可以與其他酶檢測分析聯合應用。關于指示分子的所有實施方式，與本文描述的 酶檢測裝置聯合使用時，等同適用于本發明第三方面的指示分子。
[0060] 在某些實施方式，指示分子的酶可修飾區域包含一個或多個裂解位點，這樣指示 分子能夠被用于檢測能夠裂解其底物的酶的活性。待檢測的酶可選自如下種類：氧化還原 酶、水解酶和裂解酶，并包括蛋白酶，肽酶、脂酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神經氨酸 苷酶、酯酶、DNA酶和RNA酶的亞種。在優選實施方式中，指示分子用于檢測蛋白酶活性。 [0061] 在本發明的某些實施方式，酶可修飾區域可以包含多個裂解位點，其中在這些位 點的任意一個的裂解導致所述檢測位點從指示分子的捕獲位點分離。在本發明的文本中， 術語"多個"指至少兩個、至少三個、至少四個等等。
[0062] 在某些實施方式中，指示分子包括2、3、4、5和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 21、25、50、100、500或1000個之間的裂解位點。在一些實施方式，指示分子包括2和5、6、 7、8、9或10個之間的裂解位點。
[0063] 在一個實施方式中，所述多個裂解位點可以都是相同的。在這種配置中，重復裂解 位點可以是相對非特異的或可以對如上限定的一種酶或酶亞型高度特異。此外，使用這種 類型的指示分子可以通過提供增加測試樣品內存在的裂解位點的濃度的方式提高所述酶 檢測裝置的靈敏性。
[0064] 在其他實施方式中，所述指示分子可以包括多個裂解位點，其中在相同指示分子 內存在至少兩個不同的裂解位點。在本發明的優選實施方式中，所述指示分子可以包括至 少3個、至少4個、至少5個，和到至少8個不同的裂解位點。
[0065] 在進一步優選實施方式中，所述不同的裂解位點被如上定義的不同的酶或不同的 種類、亞類或亞型的酶識別，以使得本發明的裝置能夠用于檢測多種不同的酶的活性。所述 活性可以分組，以使酶活性的檢測提供有用的結果。例如，可能涉及疾病狀態的一組酶，這 樣檢測所述酶組的一個或多個的相關活性具有診斷意義。
[0066] 使用多個裂解位點（不論相同或不相同）可以對測試樣品中酶活性非常低的情況 特別有用。例如，以上定義的具有多個裂解位點的指示分子可以用于檢測含有低水平蛋白 酶的尿液樣品中的酶活性。
[0067] 一旦根據本發明第三方面的指示分子被裂解，可用本領域技術人員已知的任意合 適方式檢測所述檢測位點。在某些實施方式，所述檢測位點本身可包括報告基團，其中報告 基團這里定義為任意能夠生成或產生信號的基團。在本發明的優選實施方式中，所述報告 基團從如下選擇：_金顆粒、發色團、發光化合物、熒光分子、放射化合物、可視化合物、脂質 體或其他包含信號生成物質的囊泡、電活性物質、或酶和其底物的組合。用作報告分子的合 適的酶底物組合可以是堿性磷酸酶和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽。
[0068] 除了指示分子，本發明的裝置還包含選擇性捕獲帶，選擇性捕獲帶包含能夠選擇 性結合至處在修飾或未修飾的任一種狀態的指示分子的酶可修飾區域的選擇性識別分子。 因此選擇性識別分子是本裝置的能夠結構上區分指示分子的修飾和未修飾形式的成分，促 進這兩種形式的分離。
[0069] 選擇性識別分子可以僅識別指示分子的未修飾形式。或者，可以這樣選擇選擇性 識別分子，即其僅識別指示分子的修飾形式。在選擇性識別分子識別指示分子的修飾形式 和待檢測酶的修飾導致指示分子以任何方式裂解或片段化的實施方式中，本裝置需要選擇 性識別分子至少結合包含檢測區域的指示分子的片段。
[0070] 在指示分子的酶可修飾區域包括多個修飾位點的情況中，所述裝置的選擇性捕獲 帶可以包含不同的選擇性識別分子，每一個能夠識別酶可修飾區域采取的修飾的或未修飾 的形式的至少一種。其中，所述裝置的選擇性捕獲帶包含不同的選擇性識別分子，每個定制 成區分酶可修飾區域關于特定位點的特定修飾的修飾和未修飾形式，為了裝置的運行，優 選不同的選擇性識別分子都識別指示分子的修飾的或未修飾的形式。
[0071] 所述選擇性識別分子可以是任意能夠結構性地區分指示分子的酶可修飾區域的 修飾和未修飾形式的分子。在本發明的優選實施方式中，選擇性識別分子是抗體或其抗原 結合片段、親和素、鏈霉親和素或其衍生物、凝集素、核酸分子、受體分子、或激素結合蛋白 質。在特別優選實施方式中，選擇性識別分子是能夠僅選擇性識別酶可修飾區域的修飾或 未修飾形式的一種的抗體。在本發明的文本中，術語抗體涵蓋來自任意種類的天然免疫球 蛋白、嵌合抗體、人源化抗體、F(ab'） 2片段、Fv片段、sFv片段和高度相關分子，例如那些基 于保留特異性結合親和力的抗體域（例如，單一域抗體）。
[0072] 選擇性識別分子的首要作用是結合指示分子的未修飾或修飾的任一種形式，從而 在裝置的選擇性捕獲帶保留指示分子的未修飾或修飾的任一種形式，這樣使得采用另一種 形式的指示分子進入檢測帶。在優選實施方式中，選擇性捕獲帶包含固相支撐，指示分子以 未修飾或修飾狀態的任一種選擇性結合的選擇性識別分子位于固相支撐之上或之中。
[0073] 在本發明的文本中，優選指示分子以相對高的親和力結合至選擇性識別分子。在 優選實施方式中，指示分子的解離速率（k d)相對低并且優選在OM和IxKT7M之間（依賴于 分析所需要的靈敏性）。在本發明特別優選的實施方式中，指示分子的解離速率在IxKT 15M 和IxKT9M之間。特別優選選擇性識別分子比待檢測酶對指示分子具有較低的解離速率 (k d)，和較高的結合速率GO。
[0074] 在本發明更優選的實施方式中，一旦指示分子被選擇性識別分子結合后，所述酶 可修飾區域不能夠被任何酶修飾或進一步修飾。在選擇性識別分子選擇性結合至指示分子 的未修飾形式的情況中，這尤其相關和有益。
[0075] 含有指示分子的測試樣品與裝置的選擇性捕獲帶接觸后，測試樣品暴露于裝置的 檢測帶。任何沒有藉由結合至位于選擇性捕獲帶內的選擇性識別分子而保留在選擇性捕獲 帶的指示分子將被轉移至檢測帶。
[0076] 在指示分子的檢測區域包含捕獲位點的情況中，檢測帶可以包含能夠結合至存在 于檢測帶的任何指示分子的捕獲位點的捕獲分子。在本發明的某些實施方式中，由于指示 分子的捕獲位點直接結合至存在于檢測帶內的捕獲分子，可以達到這樣的結合反應。在本 文中，直接結合指指示分子不需要任何中間因子（intermediary)結合至捕獲分子。
[0077] 在本發明的優選實施方式中，指示分子的捕獲位點和存在于裝置的檢測帶的捕獲 分子是結合對的兩半。在本文中，結合對由能夠相互結合的兩個分子或實體（entities)組 成。在本發明的優選實施方式中，所述結合反應是特異的，這樣結合對的每個成員僅能夠結 合其各自的配對物、或有限數量的配對物。優選結合對顯示相對高的親和力。這種結合對 可以是在自然界中發現的結合對或者是人工生成的相互作用分子或實體對。
[0078] 在本發明的更優選實施方式中，指示分子的捕獲位點和捕獲分子是結合對的兩 半，其中結合對從如下選擇：抗原和抗體或其抗原結合片段；生物素和親和素、鏈霉親和 素、中性親和素或核心生物素（captavidin);免疫球蛋白或其合適的域和蛋白A或G;碳水 化合物和凝集素；互補的核苷酸序列；配體和受體分子；激素和激素結合蛋白質；酶輔助因 子和酶；酶抑制因子和酶；纖維素結合域和纖維素纖維；固定化氨基苯硼酸和具有順式二 醇的分子（cis-diol bearing molecules);木葡聚糖和纖維素纖維和其類似物、衍生物和 片段。
[0079] 在本發明的裝置的特別優選實施方式中，結合對由生物素和鏈霉親和素組成。在 本發明更特別優選的實施方式中，指示分子的捕獲位點包含表位，并且檢測帶內的捕獲分 子包含特異性結合至存在于捕獲位點的該表位的抗體。
[0080] 在本發明的某些實施方式中，指示分子的捕獲位點與裝置的檢測帶內的捕獲分子 的結合可以是間接的。在本發明的文本中，"間接結合"指由一些能夠橋連指示分子和捕獲 分子的中間實體（intermediate entity)介導的結合，例如能夠同時結合指示分子的捕獲 位點和捕獲分子的"適配子"。
[0081] 其中指示分子與捕獲分子的結合是間接的并且由適配子介導，可以是復數個指示 分子結合至每個捕獲分子。在本文中，復數個指至少兩個、至少三個、至少四個，等等。
[0082] 這可以通過合并多價適配子分子而達到，例如能夠同時結合至多個含生物素的指 示分子的鏈霉親和素分子和含生物素的捕獲分子。
[0083] 指示分子的檢測區域可以是適合于通過本領域技術人員已知的任意方式檢測的 物質或基團。在本發明的一個實施方式中，檢測區域本身可以包含報告基團，其中報告基團 這里被定義為能夠生成或產生信號的任意基團。在本發明的優選實施方式中，所述報告基 團從如下選擇：_金顆粒、發色團、發光化合物、熒光分子、放射化合物、可視化合物、脂質體 或其他包含信號生成物質的囊泡、電活性物質、或酶和其底物的組合。用作報告基團的合適 的酶底物組合可以是堿性磷酸酶和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽。在本發明的特別 優選實施方式中，報告基團是金顆粒。
[0084] 或者，或除了以上實施方式，所述裝置可以包含一個或多個結合至或能夠結合至 指示分子的檢測區域的報告分子，并且使用由報告分子生成的信號進行檢測。不論酶可修 飾區域的修飾狀態如何，任何報告分子與指示分子的檢測區域的結合都發生。
[0085] 如上所述，報告分子可以在特定的"檢測位點"結合至指示分子的檢測區域，其與 檢測區域內存在的捕獲位點不同，并且空間上間隔開。檢測位點可以包含定位于直接相鄰 于或接近于捕獲位點的殘基。或者，檢測位點可以包含指示分子的不連續部分，空間上與捕 獲位點間隔開，例如藉由連接體或間隔子區域或轉運蛋白（carrier protein)。
[0086] 在指示分子的捕獲位點直接結合至檢測帶中的捕獲分子的裝置的實施方式中，檢 測位點不同于和/或空間上與捕獲位點間隔開可能是有利的，以免妨礙捕獲分子和報告分 子同時結合至指示分子。
[0087] 此外，在一些情況中，盡管檢測位點和捕獲位點兩者都定義為存在于指示分子的 "檢測區域"內，但是這兩個位點可以包含或由聯合的不同的化學實體組成，以便形成所述 分子的檢測區域。例如，捕獲位點可以包含第一肽抗原，同時檢測位點可以包含生物素部 分。在本發明的優選實施方式中，檢測位點包含表位，與捕獲位點內存在的表位不同，報告 分子包含特異地結合于所述表位的抗體。
[0088] 在本發明某些其他實施方式中，檢測區域可以不具有間隔的檢測位點，并且報告 分子結合至捕獲位點不損壞捕獲位點結合至檢測帶內捕獲分子的能力，報告分子可以通過 提供的捕獲位點結合至指示分子的檢測區域。在本發明優選實施方式中，捕獲位點是生物 素，報告分子包含能夠結合生物素的基團，例如抗生物素抗體或鏈霉親和素或其衍生物。 [0089] 本發明的報告分子包含任意能夠生成用于檢測目的的信號的報告基團。在本發明 的優選實施方式中，報告基團從如下選擇：_金顆粒、發色團、發光化合物、熒光分子、放射 化合物、可視化合物、脂質體或其他包含信號生成物質的囊泡、電活性物質、或酶和其底物 的組合。
[0090] 此外，報告分子與指示分子的結合可以是間接的，通過能夠同時結合檢測區域和 報告分子的適配子介導。在本發明的報告分子藉由適配子分子結合至指示分子的實施方式 中，在測試樣品加入至指示分子前，所述適配子可以與檢測區域預復合。
[0091] 適配子可以是能夠介導指示分子的檢測區域和報告分子間接相互作用的任意材 料或分子。在優選實施方式中，所述適配子是鏈霉親和素，并且檢測區域包含生物素。所述 適配子也可以是"適配子結合對"，其中所述結合對包含：
[0092] ⑴能夠結合至指示分子的檢測區域的第一成員；和
[0093] (ii)能夠結合至所述對的第一成員和報告分子的第二成員。在本發明的特別優選 實施方式中，指示分子的檢測區域包含生物素，適配子結合對的第一成員是親和素或鏈霉 親和素，適配子結合對的第二成員是生物素，報告分子包含能夠結合生物素的基團。
[0094] 適配子分子或適配子結合對的加入可以促進多個報告分子結合至每個指示分子。 例如，使用多價鏈霉親和素作為適配子將允許除了結合多個含有生物素的報告分子外，又 同時結合含有生物素的指示分子。
[0095] 在報告分子通過適配子或適配子結合對結合至指示分子的檢測區域的裝置的實 施方式中，該相同的適配子或適配子結合對可用于介導捕獲位點與存在于所述裝置的檢測 帶中的捕獲分子的間接結合。
[0096] 在優選實施方式中，指示分子的捕獲位點包含生物素并結合含有鏈霉親和素的適 配子。鏈霉親和素適配子介導與含有生物素的報告分子和也含有生物素的捕獲分子兩者的 結合。這樣，相同的適配子顯示三向結合以連接指示分子的檢測區域至報告分子和裝置的 檢測帶中的捕獲分子兩者。
[0097] 為使所述裝置按照預定運行，選擇性捕獲帶必須與檢測帶空間上間隔開。必須是 這樣的空間間隔，即允許組合指示分子的測試樣品首先與選擇性捕獲帶內的選擇性識別分 子接觸，隨后轉移至裝置的檢測帶。在一個實施方式中，選擇性捕獲帶和檢測帶兩者被間隔 的固相支撐限定，并且選擇性識別分子和捕獲分子一如果存在的話一位于它們各自固相支 撐之上或之中。
[0098] 在本發明的優選實施方式中，所述裝置配置為流體裝置，并且選擇性捕獲帶和檢 測帶存在于沿層析介質的順序位置。層析介質可以安裝在固相支撐上。在本發明的特別優 選實施方式中，所述裝置配置為側流裝置，但是也可以配置為例如垂直流裝置。在某些實施 方式中，所述裝置可以選擇測試條的形式。
[0099] 可以通過固定在其中或其上的能夠結合至指示分子的修飾或未修飾狀態的任一 種的選擇性識別分子形成（be defined by)選擇性捕獲帶。可以通過固定于其中或其上的 能夠結合至在測試樣品先前暴露于選擇性捕獲帶內的選擇性識別分子后留在測試樣品中 的指示分子的捕獲分子形成（be defined by)檢測帶。可以通過任意合適方式固定選擇性 識別分子和/或捕獲分子。其中所述裝置是包含層析介質的流體裝置，選擇性識別分子和/ 或捕獲分子可以通過直接結合至介質固定，或者通過結合至與介質相連的載體分子如蛋白 質而間接固定。
[0100] 可以在選擇性捕獲帶的上游位點將測試樣品施加至層析介質，這樣測試樣品通過 例如毛細管作用吸收，穿過選擇性捕獲帶接著檢測帶。層析介質可以由液體能夠穿過的任 意材料制成，例如流體通道或多孔膜。在本發明的優選實施方式中，層析介質包含硝酸纖維 素條或膜。如此，本發明的裝置可以包括樣品施加帶。樣品施加帶可以與選擇性捕獲帶間 隔開，或者在其他實施方式中，包括選擇性捕獲帶。
[0101] 如上描述，本發明的裝置包含能夠結合至指示分子檢測區域的報告分子，所述裝 置還可以包括含有控制捕獲分子的控制捕獲帶。控制捕獲帶與選擇性捕獲帶和檢測帶空間 上間隔開。
[0102] 在某些實施方式中，控制捕獲帶內的控制捕獲分子可以結合至任意不結合至指示 分子的報告分子。在優選實施方式中，控制捕獲分子是能夠識別報告分子內的表位的抗體， 其中所述表位與指示分子內的任何表位不同。檢測至控制捕獲帶內的控制捕獲分子的報告 分子可以用于確定裝置內功能化的報告分子的存在。
[0103] 在本發明進一步的實施方式中，除了報告分子，所述裝置還可以包含一個或多個 "控制報告分子"。通常，控制報告分子將包含與報告分子相同的報告基團，但將不會結合至 指示分子的檢測區域。這種控制報告分子可以用于間接評估裝置內報告分子的運行。在這 些情況下，所述裝置也可以包含控制捕獲帶，與選擇性捕獲帶和檢測帶空間上間隔開，包含 控制捕獲分子，其中如果存在控制報告分子的話，所述控制捕獲分子能夠結合控制報告分 子。在優選實施方式中，控制捕獲分子是能夠識別控制報告分子內表位的抗體，其中所述表 位與指示分子或報告分子內的任何表位不同。檢測結合至控制捕獲帶內的控制捕獲分子的 報告分子可以用于間接評估裝置內功能化的報告分子的存在。
[0104] 其中本發明的裝置配置為包含層析介質的流體裝置，選擇性捕獲帶、檢測帶和控 制捕獲帶（如果存在的話）可以包含在塑料殼體內，配備有能夠檢測固定于一個或多個所 述不同的帶的報告分子的方式。例如，塑料殼體可以包含允許可視化觀察結合在選擇性捕 獲帶、檢測帶和控制捕獲帶的一個或多個的報告分子生成的信號的窗口。在某些實施方式 中，尤其是選擇性識別分子結合至指示分子的未修飾形式的實施方式中，所述塑料殼體可 以將選擇性捕獲帶隱藏不可見，這樣只有結合在檢測帶的報告分子能被檢測到。這有助于 終端用戶僅在存在酶時（在檢測帶）見到陽性測試線。
[0105] 根據本發明的另一方面，本文提供一種用于檢測測試樣品中酶活性存在的方法， 所述方法包含步驟：（i)提供酶檢測裝置，包含
[0106] 用于加至測試樣品的指示分子，所述指示分子包含
[0107] (a)酶可修飾區域，能夠被所述酶修飾，引起該區域從未修飾至修飾狀態的轉變； 和
[0108] (b)檢測區域，不被酶修飾，并且不論酶可修飾區域的修飾狀態如何，該區域能夠 被報告分子結合；
[0109] 接收測試樣品的選擇性捕獲帶，其中選擇性捕獲帶包含能夠選擇性結合至指示分 子的酶可修飾區域的修飾或未修飾狀態的任一種的選擇性識別分子；和 [0110] 測試樣品與第一捕獲帶接觸后接收測試樣品的檢測帶，其中所述檢測帶與第一捕 獲帶空間上間隔開，
[0111] (ii)提供疑似含有酶活性的測試樣品；
[0112] (iii)在如果存在酶活性能夠修飾酶可修飾區域的條件下，將裝置的指示分子加 入至測試樣品；
[0113] (iv)使測試樣品與裝置的選擇性捕獲帶接觸，從而處于修飾或未修飾狀態的任一 種的指示分子與選擇性識別分子結合，從而如果存在的話，允許指示分子的修飾或未修飾 形式與相反狀態的指示分子分離；
[0114] (V)使測試樣品與檢測帶接觸，其中只有不結合至選擇性捕獲帶內的選擇性識別 分子的指示分子進入檢測帶；和
[0115] (Vi)檢測存在于選擇性捕獲帶和/或檢測帶內的任何指示分子。
[0116] 以上詳述的方法涉及使用本文其他地方詳述的本發明的酶檢測裝置。所有已描述 的關于本發明的酶檢測裝置和指示分子的所有實施方式參照適用于本發明的方法的這些 方面，因簡潔的緣由不再重復。
[0117] 本發明的方法需要在酶一如果存在（并且有活性）一能夠修飾酶可修飾區域的條 件下將裝置的指示分子加入至測試樣品。用于進行所述方法的條件可以視待檢測的相關酶 而定，也可以包括例如指示分子與測試樣品的孵育時間、溫度、PH參數的變化。并且，所述 條件可以調整，以便改進所述分析的靈敏性；例如，更長的孵育時間可能增加測試樣品中修 飾的指示分子的比例。在某些實施方式中，本發明的裝置和方法可以用于優化相關酶的分 析條件。
[0118] 根據待檢測的酶，加入至測試樣品中的指示分子的量或濃度也可以不同。優選將 充足的指示分子加入至測試樣品，以使酶底物過量存在。
[0119] 在本發明的某些實施方式中，可優選在使測試樣品與裝置的選擇性捕獲帶接觸前 孵育指示分子與測試樣品。特別是對于存在于選擇性捕獲帶內的選擇性識別分子識別指示 分子的未修飾形式的實施方式的情況，并且一旦指示分子被選擇性識別分子結合，酶可修 飾區域不能夠被酶修飾。
[0120] 進行本方法獲得的結果也將受到存在于裝置的選擇性捕獲帶內的選擇性識別分 子的量與加入至測試樣品的識別分子的量之間關系的影響。在本發明的某些實施方式中， 存在充足的選擇性識別分子，從而，如果指示分子保持在被選擇性識別分子識別的形式，在 選擇性捕獲帶捕獲測試樣品中指示分子的所有量。本領域技術人員能夠容易地試驗確定捕 獲所有指示分子需要的選擇性識別分子的量，或者使裝置的選擇性捕獲帶內的所有選擇性 識別分子結合位點飽和的指示分子的量。
[0121] 如果選擇性識別分子少于捕獲所有任一形式的指示分子所需，特別是在選擇性識 別分子結合至酶可修飾區域的未修飾形式的情況中，存在于選擇性捕獲帶的任何未結合的 指示分子可以隨后被轉移至檢測帶。如果在裝置的檢測帶檢測到指示分子的存在，其中這 些指示分子本該保留在所述選擇性捕獲帶，可能導致假陽性結果。然而，根據所需分析靈敏 度的程度，一定程度的未結合指示分子"泄露"至檢測帶是可以容許的，其中這樣的指示分 子本該藉由其未修飾/修飾狀態保留在選擇性捕獲帶。此外，可以測量這種"泄露"，并藉由 合適的控制反應而被考慮在內。
[0122] 如上所詳述，選擇性識別分子的作用首先是在裝置的選擇性捕獲帶內選擇性保留 未修飾或修飾形式的指示分子。這樣，為了將指示分子保留在該帶內，選擇性識別分子必須 定位于選擇性捕獲帶內，這樣它們不與測試樣品一起被轉移至檢測帶。可以通過將選擇性 識別分子附著于固相支撐達到定位。在本發明的優選實施方式中，所述裝置是流體裝置，選 擇性識別分子固定于延層析介質長軸的離散位置。可通過本領域技術人員已知的合適方式 固定選擇性識別分子。
[0123] 在使測試樣品與選擇性捕獲帶接觸后，任一種修飾或未修飾形式的指示分子已結 合至捕獲帶的選擇性識別分子，接著測試樣品被轉移至檢測帶。如果所述裝置配置為選擇 性識別分子結合至酶可修飾區域的未修飾形式，任何修飾形式的指示分子將被轉移至檢測 帶。如果所述裝置配置為選擇性結合至酶可修飾區域的修飾形式，未修飾指示分子將被轉 移至檢測帶。
[0124] 根據所述裝置的配置和用戶期望的讀出，本發明的方法可以包含檢測選擇性捕獲 帶或檢測帶內或兩者內的指示分子的存在和/或水平。例如，如果裝置是選擇性識別分子 結合至指示分子的未修飾形式，檢測帶內的修飾的指示分子的存在一如果有一將指示測試 樣品內存在酶活性。或者，如果裝置的選擇性識別分子結合至指示分子的修飾形式，選擇性 捕獲帶內的修飾的指示分子的存在一如果有一將指示測試樣品內酶活性的存在。在某些實 施方式，測量與檢測帶比較的選擇性捕獲帶內結合的指示分子的相對量或許是有用的。鑒 于指示分子在這些位點的任意一個存在，在選擇性捕獲帶生成的信號和檢測帶生成的信號 通常存在負相關。
[0125] 以上描述的方法可以用于確定任意給定的測試樣品中存在或缺失酶活性。所述方 法也可以用于基于比較兩種或多種樣品確定測試樣品中酶活性的相對量。為了進行這樣的 比較分析，將使用第一樣品執行本發明的方法獲得的結果與使用一種或多種其他測試樣品 重復所述方法獲得的結果比較。
[0126] 例如，在本發明的選擇性識別分子結合至指示分子的未修飾形式的實施方式中， 存在于檢測帶的修飾的指示分子生成的信號強度可以與測試樣品內的酶活性的水平成正 t匕。這樣，比較兩個或多個測試樣品中的單個在檢測帶生成的信號強度可以用于計算每一 樣品中酶活性的相對水平。
[0127] 此外，根據存在于選擇性捕獲帶和檢測帶兩者的指示分子計算的信號強度的比率 可以與酶活性的水平成正比。這樣，兩個或多個樣品的該比率的比較可以用于確定每一樣 品中酶活性的相對水平。
[0128] 使用本發明的所述方法的這種比較分析可以用于多種目的。首先，測量兩個或更 多樣品之間酶活性的相對水平可以用作不同樣品內存在的所有酶的相對量的間接測量。與 此相關，本方法可以首先針對含有已知量的酶的系列測試樣品進行。獲得的結果可以用于 生成酶活性相對于酶濃度的標準曲線。此后，可以測試含有未知量的酶的另一測試樣品的 酶活性，并且基于來自標準曲線的數據，可以確定測試樣品內的酶的絕對量。
[0129] 在目前方法的另一應用中，比較兩樣品之間的相對酶活性，例如對照樣品和試驗 樣品，可以用于評估潛在的調節劑或抑制劑對酶活性的影響。
[0130] 可通過本領域技術人員可用的任意方式進行存在于選擇性捕獲帶、檢測帶或兩者 的指示分子的檢測。如上所述，可以通過檢測檢測區域內存在的報告基團進行指示分子的 檢測。
[0131] 在本發明的優選實施方式中，通過加入能夠結合至檢測區域的報告分子進行指示 分子的存在的檢測。所述報告分子可以取自以上已經描述的形式，可以與指示分子的檢測 區域以任意在此已詳述的方式相關聯。
[0132] 在本發明的優選實施方式中，指示分子的存在的檢測是通過使用含有能夠結合指 示分子的檢測區域的抗體的報告分子的免疫分析進行的。在特別優選的實施方式中，指示 分子的檢測是通過如下技術之一進行的：ELISA、熒光免疫分析或放射免疫分析。
[0133] 在使用單獨的報告分子進行檢測的實施方式中，可以在將指示分子加入至測試樣 品前，將所述報告分子加入至指示分子。在這些情況下，優選報告子不影響酶對指示分子的 修飾，例如裂解。或者，可以在不存在報告分子時，將指示分子加入至測試樣品，并且當測試 樣品暴露于選擇性捕獲帶內的選擇性識別分子時存在或加入報告分子。在另一選擇實施方 式中，可以在含有指示分子的測試樣品已經暴露于選擇性捕獲帶內的選擇性識別分子并且 隨后被轉移至檢測帶后加入報告分子。
[0134] 可以籍由存在于指示分子的檢測區域內的捕獲位點將指示分子結合至存在于檢 測帶內的捕獲分子，促進檢測帶內存在的指示分子的檢測。更具體地，任何指示分子與固定 于檢測帶內的離散位置的捕獲分子的結合可以允許執行所述方法的人集中于在該離散位 置的水平的指示分子的檢測。指示分子結合至檢測帶內存在的捕獲分子可以籍由捕獲位點 和捕獲分子之間的直接相互作用而發生，或者可以是間接的，例如通過本文其他地方描述 的適配子分子介導。
[0135] 在適配子用于介導指示分子與報告分子或捕獲分子或兩者的間接結合的實施方 式中，該適配子可以在將指示分子加入至測試樣品前加入到指示分子，即可以與指示分子 預復合。或者，可以在指示分子暴露于裝置的選擇性捕獲帶或檢測帶時加入適配子。
[0136] 如上詳述，在本發明的優選實施方式中，所述裝置配置為流體裝置，具有沿層析介 質由離散位置形成的選擇性捕獲帶和檢測帶。測試樣品可以在選擇性捕獲帶的上游位點暴 露于層析介質，例如樣品接收帶。該位點或帶可以由施加樣品的樣品墊的存在而形成。在 某些實施方式中，該樣品墊可以執行血液分離器功能，這樣測試樣品的某些成分，例如一種 或多種類型的血液細胞，留存在樣品墊的材料內，從而被防止進入層析條。
[0137] 測試樣品施加到樣品接收帶后，所述樣品可以流過選擇性捕獲帶并進入檢測帶。 所述樣品施加帶可以通過例如可溶性屏障的方式與選擇性捕獲帶間隔開，這樣包含指示分 子的測試樣品在流入選擇性捕獲帶前與例如硝酸纖維素條的層析介質的接觸一段時間。層 析介質也可以具有與其附著的位于選擇性捕獲帶和檢測帶下游的吸收墊。這可以作為儲存 池以促進測試樣品流動通過層析介質的帶。
[0138] 可以在測試樣品已被允許穿過或沿介質通過后，將報告分子加入至層析介質。在 優選實施方式中，當測試樣品施加至介質時，報告分子可以以干燥形式與層析介質預先關 聯。一旦測試樣品離開一段時間，以流過裝置的選擇性捕獲帶和檢測帶，所述報告分子可以 通過例如加入合適的緩沖液重復原，接著流過層析介質，這樣任何結合的指示分子被隨后 結合的報告分子標記。
[0139] 如上所述，本發明的裝置還可以包含含有控制捕獲分子的控制捕獲帶。在某些實 施方式中，控制捕獲分子可以結合任何不結合至指示分子的報告分子。
[0140] 在這樣的裝置使用中，本發明的方法還可以包含檢測結合至控制捕獲帶內的控制 捕獲分子的任意報告分子。
[0141] 如上定義，對于使用報告分子檢測指示分子存在的實施方式，所述裝置也可以包 含控制報告分子。這樣的控制報告分子可以在與報告分子加入至裝置的相同時間加入至裝 置。其中所述裝置是包含層析介質的流體裝置，報告分子和控制報告分子兩者都可以在測 試樣品施加至介質時以干燥形式與層析介質預先關聯。報告分子的復原，例如使用合適的 緩沖液，可以伴隨著控制報告分子的復原。在這些情況下，本發明的裝置可以進一步包含含 有能夠結合控制報告分子的控制捕獲分子的控制捕獲帶。當使用這樣的裝置時，本發明的 方法還可以包含檢測結合至控制捕獲帶內的控制捕獲分子的控制報告分子的存在。該"控 制"讀出對于間接確認報告分子在裝置內存在和/或有功能或許是重要的。
[0142] 本發明將參照以下條款得以進一步理解：
[0143] 1.用于檢測測試樣品中酶活性的酶檢測裝置，包括：
[0144] (i)加入樣品中的指示分子，該指示分子包括：
[0145] (a)酶可修飾區域，該區域能夠被所述酶修飾，引起該區域從非修飾到修飾狀態的 轉變；
[0146] (b)檢測區域；不論所述酶可修飾區域的修飾狀態如何，該區域不被所述酶修飾 和能夠被報告分子結合，和
[0147] (ii)接收測試樣品的選擇性捕獲帶，其中，該選擇性捕獲帶包括能夠選擇性地結 合至處于修飾或非修飾的任一種狀態的指示分子的酶可修飾區域的選擇性識別分子；和
[0148] (iii)接收與選擇捕獲區域接觸后的測試樣品的檢測帶，其中，檢測帶與選擇性捕 獲帶空間上間隔開從而測試樣品向檢測帶的暴露發生在測試樣品向選擇性捕獲帶的暴露 之后，和其中，只有那些不結合至選擇性捕獲帶中的選擇性捕獲分子的指示分子進入檢測 帶，其中，在所述選擇性捕獲帶和/或檢測帶上檢測所述指示分子。
[0149] 2.條款1的裝置，其中所述指示分子的檢測區域包括捕獲位點，所述檢測帶包括 能夠特異地結合至指示分子的捕獲位點的捕獲分子，如果所述指示分子存在的話。
[0150] 3.條款1或2的裝置，其中所述指示分子的酶可修飾區域包括肽、蛋白、碳水化合 物，脂質或核酸。
[0151] 4.條款1-3之一的裝置，其中所述待檢測酶選自如下種類：氧化還原酶，轉移酶， 水解酶，裂解酶，異構酶和連接酶，和包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、硫酸 酯酶、神經氨酸苷酶，唾液酸苷酶、脂酶，脫氧核糖核酸酶（DNAse)和核糖核酸酶（RNAse)， 激酶；甘油轉移酶；氧化酶；還原酶和轉氨酶的亞種。
[0152] 5.條款1-4之一的裝置，其中所述待檢測的酶為金屬蛋白酶或者人中性粒細胞衍 生的彈性蛋白酶。
[0153] 6.條款1-5之一的裝置，其中所述選擇性識別分子為抗體或其抗原結合片段；生 物素，鏈霉親和素或他們的衍生物，血凝素，核酸分子，受體分子或激素結合蛋白。
[0154] 7.條款1-6之一的裝置，其中選擇性捕獲帶包含固相支撐和位于固相支撐之上或 之中的選擇性識別分子，指示分子以修飾狀態的任一種選擇性結合于選擇性識別分子。
[0155] 8.條款1-7之一的裝置，其中，一旦所述指示分子被選擇性識別分子結合，所述酶 可修飾區域不能夠被所述酶修飾。
[0156] 9.條款2-8之一的裝置，其中所述指示分子的捕獲位點直接結合至所述裝置的檢 測帶內存在的捕獲分子。
[0157] 10.條款9的裝置，其中所述捕獲位點和捕獲分子是結合對的兩半。
[0158] 11.條款10的裝置，其中結合對選自選自如下的結合對：抗原和抗體或者他們的 結合片段；生物素和親和素，鏈霉親和素，中性親和素或captavidin ;免疫球蛋白或者片段 和蛋白A或G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸序列互補的序列；配體和受體分子；激素和 激素結合蛋白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素結合區域和纖維素纖維；固定的 氨基苯基硼酸和具有順式-二醇分子；木葡聚糖和纖維素纖維及其類似物、衍生物以及片 段。
[0159] 12.條款10的裝置，其中所述結合對是生物素和鏈霉親和素。
[0160] 13.條款10的裝置，其中所述指示分子的捕獲位點包含表位，并且捕獲分子包含 特異地結合至所述表位的抗體。
[0161] 14.條款1-13之一的裝置，其中所述指示分子的檢測區域包含報告基團。
[0162] 15.條款14的裝置，其中所述報告基團從如下選擇：金顆粒、發色團、發光化合物、 熒光分子、放射化合物、可視化合物、脂質體或其他包含信號生成物質的囊泡、電活性物質、 或酶和其底物的組合。
[0163] 16.條款1-13之一的裝置，還包括可以結合至或者能夠結合至所述指示分子的檢 測區域的報告分子。
[0164] 17.條款16的裝置，其中所述指示分子的檢測區域包括檢測位點，與捕獲位點不 同并且空間上間隔開，所述報告分子通過所述檢測位點結合至檢測區域。
[0165] 18.條款17的裝置，其中所述檢測位點包含表位，與捕獲位點內存在的任意表位 不同，并且所述報告分子包含特異地結合于所述表位的抗體。
[0166] 19.條款18的裝置，其中所述報告分子通過捕獲位點結合至檢測區域，其中所述 報告分子與捕獲位點的結合不損害捕獲位點結合捕獲分子的能力。
[0167] 20.條款16-19之一的裝置，其中所述報告分子包含報告基團，從如下選擇：_金顆 粒、發色團、發光化合物、熒光分子、放射化合物、可視化合物、脂質體或其他包含信號生成 物質的囊泡、電活性物質、或酶和其底物的組合。
[0168] 21.條款16-20之一的裝置，其中所述報告分子與捕獲區域的結合是間接的，通過 能夠同時結合檢測區域和報告分子的適配子介導。
[0169] 22.條款21的裝置，其中在將測試樣品加入至所述指示分子前，所述適配子與檢 測區域預復合。
[0170] 23.條款21或22的裝置，其中所述適配子是鏈霉親和素并且所述檢測區域包含生 物素。
[0171] 24.條款21或22的裝置，其中所述適配子是適配子結合對，所述結合對包含：
[0172] (i)能夠結合至所述指示分子的檢測區域的第一成員；和
[0173] (ii)能夠結合至所述對的第一成員和所述報告分子的第二成員。
[0174] 25.條款24的裝置，其中所述指示分子的檢測區域包含生物素，所述適配子結合 對的第一成員是親和素或鏈霉親和素，所述適配子結合對的第二成員是生物素，并且所述 報告分子包含能夠結合生物素的基團。
[0175] 26.條款21-25的裝置，其中多個報告分子可以結合每個指示分子。
[0176] 27.條款21-26的裝置，其中所述適配子結合至指示分子的檢測區域中的捕獲位 點，從而捕獲位點通過適配子間接地結合至存在于裝置的檢測帶中的捕獲分子。
[0177] 28.條款27的裝置，其中所述適配子是鏈霉親和素并且所述捕獲分子是生物素。
[0178] 29.條款1-28之一的裝置，其中所述檢測帶包括固相支撐，和所述捕獲分子位于 固相支撐之上或之中。
[0179] 30.條款1-29的裝置，其中所述裝置為流體裝置，和所述選擇性捕獲帶和檢測帶 沿著層析介質順序存在。
[0180] 31.條款16-30的酶檢測裝置，其中所述檢測區域另外還包括固定的識別分子，在 指示分子不存在時，報告分子結合至識別分子。
[0181] 32.用于測試樣品中酶活性檢測的指示分子，包括：
[0182] (i)酶可修飾區域，該區域被所述的酶修飾，引起該區域從未修飾到修飾狀態的轉 變，所述未修飾和修飾狀態就被選擇性識別分子結合而言是為結構上可區分的；
[0183] (ii)間隔開的捕獲區域，不論所述酶可修飾區域的修飾狀態如何，該區域被捕獲 分子結合；
[0184] (iii)間隔開的檢測位點，不論所述酶可修飾區域的修飾狀態如何和不論捕獲位 分子與捕獲位點為之前或同時結合，該位點都能夠被報告分子結合。
[0185] 33.根據條款32的指示分子在條款1-30限定的酶檢測裝置中的應用。
[0186] 34.用于檢測測試樣品中酶活性存在的方法，該方法包括以下步驟：
[0187] (i)提供一種酶檢測裝置，包括：
[0188] 加入至測試樣品中的指示分子，該指示分子包括：
[0189] (a)酶可修飾區域，能夠被所述酶修飾，引起該區域從非修飾狀態到修飾狀態的轉 變；
[0190] (b)檢測區域，不論所述酶可修飾區域的修飾狀態如何，該檢測區域不被酶修飾和 能夠被報告分子結合；
[0191] 接收測試樣品的選擇性捕獲帶，其中，該選擇性捕獲帶包括能夠選擇性地結合修 飾或非修飾的任一種狀態的指示分子的酶修飾區域的選擇性識別分子；和
[0192] 接收與選擇捕獲帶接觸后的測試樣品的檢測帶，其中，檢測帶與選擇性捕獲帶空 間上間隔開；
[0193] (ii)提供懷疑有酶活性的測試樣品；
[0194] (iii)在酶的活性一如果存在一能夠修飾酶的修飾區域的條件下，將裝置的指示 分子加入至測試樣品；
[0195] (iv)使測試樣品與裝置的選擇性獲帶接觸，使處于修飾或未修飾的任一種狀態的 指示分子與選擇性捕獲分子結合，從而，如果存在，使得修飾狀態或非修飾狀態中的指示分 子與相反狀態的指示分子分離；
[0196] (V)使測試樣品與檢測帶接觸，其中，只有不與選擇性捕獲帶中的選擇性捕獲分子 結合的指示分子進入檢測帶；和
[0197] (Vi)檢測存在于檢測帶和或選擇性帶中的任何指示分子。
[0198] 35.條款34的方法，其中所述酶檢測裝置是條款1-31之一所述的酶檢測裝置。
[0199] 36.條款34或35的方法，其中通過免疫分析方法進行檢測帶中任何指示分子的檢 測。
[0200] 37.條款36的方法，其中通過ELISA、熒光免疫或者放射性免疫方法進行檢測區域 中任指示分子的檢測。
[0201] 38.條款34-37之一的方法，其中所述指示分子的檢測區域包括捕獲位點，并且所 述檢測帶包括能夠結合至指示分子的捕獲位點的捕獲分子，如果所述指示分子存在。
[0202] 39.條款34-38之一的方法，其中所述選擇性識別分子結合至處于未修飾狀態的 指示分子，并且檢測帶中指示分子的存在表示酶存在于測試樣品中。
[0203] 40.如條款1-31之一所述的酶檢測裝置在檢測測試樣品中酶活性中的用途。
[0204] 41. 一種參考附圖酶在此充分描述的酶檢測裝置。
[0205] 42. -種參考附圖在此充分描述的檢測測試樣品中酶活性的存在的方法。
[0206] 43.參考附圖在此充分描述的酶檢測裝置的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0207] 現在通過關于附圖的非限制性的實施例描述本發明，其中：
[0208] 圖1是根據本發明的一個實施方式的指示分子的示意圖。
[0209] 圖2是根據本發明的一個實施方式的包含圖1的指示分子的酶檢測裝置的示意 圖。
[0210] 圖3是根據本發明另一實施方式的指示分子的示意圖。
[0211] 圖4是根據本發明另一實施方式的包含圖3的指示分子的酶檢測裝置的示意圖。
[0212] 圖5顯示與本發明的酶檢測裝置聯合使用的層析條的裝配。
[0213] 圖6顯示使用根據本發明的酶檢測裝置檢測人中性粒細胞彈性蛋白酶（HNE)活性 產生的結果。
[0214] 圖7顯示使用根據本發明的含有1、2、3、5和7個裂解位點的指示分子產生的結 果，用于檢測MMP9活性。
[0215] 圖8顯示使用根據本發明的含有1、2、3和4個裂解位點的指示分子產生的結果， 用于檢測MMP9活性。
[0216] 優選實施方式描述
[0217] 圖1顯示根據本發明的優選實施方式的指示分子。所示的指示分子（1)包含酶可 修飾區域（2)和含有捕獲位點（4)和分隔的檢測位點（5)的檢測區域（3)。酶可修飾區域 (2)的修飾引起該區域從未修飾狀態至修飾狀態的轉變，其中這些不同的狀態是被本裝置 (在此詳細討論的）的選擇性識別分子結構上可區分的。在圖1，可修飾區域（2)顯示處于 修飾中，藉由轉移酶家族內的酶的作用加入化學基團"X"至該區域。
[0218] 圖2顯示根據本發明優選實施方式的酶檢測裝置。所述裝置包含如圖1所述的指 示分子（1)，和包含上游選擇性捕獲帶（7)和下游的檢測帶（8)的層析測試條（6)。
[0219] 在所示裝置的實施方式中，通過結合至測試條（6)的固相支撐而固定的選擇性識 別分子（9)的存在形成選擇性捕獲帶（7)。通過在第一位點固定的捕獲分子（10)和在第二 離散位點固定的另一識別分子（11)的存在形成檢測帶（8)。此外，檢測帶（8)與選擇性捕 獲帶（7)空間上間隔開，藉由沿著層析測試條（6)長軸的離散位置處各自的分子的固定形 成每一條帶。
[0220] 使用中，可以在使測試樣品與所述裝置的選擇性捕獲帶（7)接觸前，將指示分子 (1)加入至測試樣品。一旦出現在選擇性捕獲帶（7)，處于未修飾或修飾的任一種狀態的指 示分子（1)僅被那里存在的選擇性識別分子結合。在圖2所示的（優選）實施方式中，存 在于選擇性捕獲帶（7)的選擇性識別分子（9)僅能夠結合未修飾的指示分子（14)。如果存 在任何修飾的指示分子（12)，則以"自由"或"未結合"形式在選擇性捕獲帶（7)內。
[0221] 在所述裝置的優選實施方式中，選擇性識別分子（9)以高親和力結合至指示分子 (1)，尤其是親和力高于待檢測酶對指示分子（1)的親和力。此外，優選結合至選擇性識別 分子（9)的指示分子（1)不能被存在于測試樣品內的酶（待檢測）進行任何隨后的修飾。 在一旦測試樣品施加至選擇性捕獲帶（7)，便沒有進一步的指示分子（1)的酶修飾發生的 情況下，在裝置的任何一個帶測量的信號將不因指示分子的繼續修飾而隨時間改變。這樣， 本發明的裝置可以用作可靠的和精確的終點分析。
[0222] 在圖2所示的優選實施方式中，裝置配置為側流裝置。在這種實施方式中，測試樣 品通常在選擇性捕獲帶（7)上游的位置施加至層析測試條（6)，從而通過毛細作用沿測試 條（6)箭頭所示方向被吸取。這樣，在選擇性捕獲帶（7)沒有被捕獲的任何指示分子將進 入檢測帶（8)。
[0223] 在裝置的檢測帶（8)中，任何存在的修飾的指示分子（12)可以藉由指示分子的捕 獲位點⑷和檢測帶⑶內存在的捕獲分子（10)之間的結合相互作用而定位。在圖2,顯 示捕獲分子（10)固定于層析測試條形成檢測帶（8)的區域內的離散位置。在本發明的優 選實施方式中，指示分子的捕獲位點包含表位，并且檢測帶內的捕獲分子包含抗體，其特異 地結合至存在于捕獲位點的所述表位。
[0224] 可以通過檢測區域在所述裝置的任一帶測量指示分子（1)的存在。可以通過測量 已經存在于檢測區域內的報告基團生成的信號，或者通過測量特異地結合至檢測區域的報 告分子生成的信號進行檢測。
[0225] 在圖2中，指示分子的檢測區域包含明顯的檢測位點（5)，并且顯示報告分子（13) 在裝置的檢測帶（8)內結合至該位點。在本發明的優選實施方式中，指示分子的檢測位點 (5)包含不同于在捕獲位點發現的任何表位的表位，并且報告分子包含抗體，其特異地結合 至存在于檢測位點的所述表位。
[0226] 報告分子本身可以通過任意本領域技術人員已知的合適方式包含有任意能夠生 成用于檢測的信號的基團。在本發明的優選實施方式中，報告分子包含綴合至能夠特異地 結合指示分子的檢測區域的分子的金顆粒，例如以上所述的抗體。
[0227] 圖2也顯示另一識別分子（11)在檢測帶⑶內捕獲分子（10)下游的位置固定于 層析條上。如示，該另一識別分子（11)能夠結合任意未結合至指示分子的報告分子（13)。 在選擇性捕獲帶（7)或檢測帶（8和10)缺失來自任意報告分子（13)的信號時，在檢測帶 (8)內的該下游位置的報告分子信號的檢測可以用于確認裝置的報告分子能夠生成陽性信 號。
[0228] 圖3顯示根據本發明第二優選實施方式的指示分子。所示的指示分子（16)包括 含有單一裂解位點（18)的酶可修飾區域（17)。此外，指示分子具有檢測區域（19)。在所 示實施方式中，檢測區域（19)由生物素部分（B)組成，從而能夠結合至多價鏈霉親和素適 配子分子（20)。可以在暴露于疑似含有所述酶（如示）測試樣品前，將指示分子與適配子 分子預復合。或者，可以在酶裂解發生后，將適配子分子（20)加入至測試樣品。
[0229] -旦本發明的指示分子（16)加入至測試樣品，任何特異地識別存在的裂解位點 (18)的酶，可以裂解指示分子（16)，導致該區域從未修飾（17)至修飾（21)狀態的轉變，其 中這些不同的狀態被本裝置的選擇性識別分子結構上區分。
[0230] 圖4顯示根據本發明第二優選實施方式的酶檢測裝置。所述裝置包含如圖3所示 的指示分子（16)，和包含上游選擇性捕獲帶（23)和下游檢測帶（24)的層析測試條（22)。
[0231] 在所示裝置的實施方式中，通過結合至測試條（22)的固相支撐而固定的選擇性 識別分子（25)的存在形成選擇性捕獲帶（23)。通過捕獲分子（26)的存在形成檢測帶 (24)，并且藉由在沿著層析測試條（22)長軸的離散下游位置處固定捕獲分子（26)與選擇 性捕獲帶（23)空間上間隔開。
[0232] 在使用中，在使測試樣品與裝置的選擇性捕獲帶（23)接觸前，將指示分子（16)加 入至測試樣品。如圖4所示，一旦出現于裝置的選擇性捕獲帶（23)，指示分子能夠以未修飾 形式結合選擇性識別分子（25)，而不是修飾的狀態。在圖4,由測試樣品中存在的任意酶對 指示分子的裂解位點（18)的裂解防止酶可修飾區域（17)被選擇性捕獲帶內的選擇性識別 分子（25)識別。
[0233] 在所示優選實施方式中，所述裝置配置為包含層析測試條（22)的側流裝置。在該 實施方式中，測試樣品通常在選擇性捕獲帶上游的位置施加至層析測試條，之后通過毛細 作用沿測試條箭頭所示方向被吸取。這樣，在選擇性捕獲帶（23)沒有被捕獲的任何指示分 子（28)將進入檢測帶（24)。
[0234] 在所述裝置的檢測帶（24)，包含檢測區域（28)的裂解的指示分子片段藉由檢測 區域（28)內的捕獲位點（B)和存在于檢測帶（24)內的捕獲分子（26)之間的相互作用而 定位。
[0235] 圖4所示的裝置的實施方式中，指示分子的檢測區域包含生物素基團（B)，并且被 多價鏈霉親和素適配子分子（20)結合。該鏈霉親和素適配子（20)用作指示分子的檢測區 域（19)和也包含生物素基團的捕獲分子（26)之間的橋梁。
[0236] 在本發明的方法中，可以在選擇性捕獲帶、檢測帶或兩者進行結合的未修飾指示 分子或其裂解的"修飾的"片段的檢測。可以通過測量檢測區域內已經存在的報告基團生 成的信號，或者測量特異地結合至檢測區域的報告分子生成的信號進行檢測。
[0237] 在圖4,顯示報告分子（29)通過鏈霉親和素適配子分子（20)結合至指示分子的檢 測區域。報告分子本身包含生物素基團（30)，其介導與鏈霉親和素適配子的結合，并且金顆 粒（31)綴合至所述生物素基團。以上詳述了偶聯報告分子至指示分子的檢測區域的選擇 方式。
[0238] 在所示實施方式中，結合至指示分子（19)的檢測區域的鏈霉親和素適配子分子 (20)在檢測帶達到雙重目的，其介導指示分子（16)與捕獲分子（26)和報告分子（29)兩者 通過它們各自的生物素基團的結合。
[0239] 參考如下實施例將進一步理解本發明。 實施例
[0240] 實施例I #用多聚鏈霍親和素：多狀復合物指示分子的反相ELATABS平臺
[0241] 包含如下成分的試劑盒：_
[0242] 1)用于收集樣品的裝置（例如用于尿液）
[0243] 2)用于使金綴合物復水的chase緩沖液（chase buffer)，由pH 8. 0的tris鹽緩 沖液（TBS)和 1% Tween?20 組成。
[0244] 3)側流測試條，其固定在塑料盒內。測試條具有隱藏的捕獲帶，其包含四條預吸附 線（PA線）形式的羊抗體，第二捕獲帶，包含綴合至轉運蛋白（carrier protein)的生物素 作為橫穿測試條流動路徑的第一測試線，和第三捕獲帶，在測試線的下游，包含吸附的抗雞 抗體，作為橫穿測試條流動路徑的控制線。在塑料盒中有觀察窗，通過觀察窗觀察測試和控 制線。在第一測試線的上游，還有整合的樣品接收墊。此外，測試條有帶有生物素的金顆粒， 干燥進入測試條的樣品接收墊上游，其可以通過在金綴合墊上游接收chase緩沖液的第二 孔中加入緩沖液而被復原。
[0245] 4)管，其中可設置樣品收集裝置，和指示分子。
[0246] 5)連接至適配子分子（其可以合并進樣品收集裝置）的指示分子。指示分子含 有可修飾區域，其攜帶末端生物素基團，通過聚乙二醇甘油間隔子/連接子連接，這允許其 與適配子分子鏈霉親和素形成復合物。所述可修飾區域被固定于隱藏的捕獲帶的羊抗體識 別。
[0247] 測試條
[0248] 如下所述，根據本發明構建用于檢測液體樣品中蛋白酶活性的測試條。所述分析 基于在絲氨酸蛋白酶人中性粒細胞彈性蛋白酶（HNE)存在時指示分子的修飾，這使其與測 試線形成復合物。用試條測試了包括創面積液樣品的各種樣品，用于檢測蛋白酶活性。
[0249] A.制備金-浸漬綴合墊
[0250] 使用Isoflow分樣儀（噴射高度7mm)以0· 9 μ Ι/mm用稀釋于金干燥緩沖液（50mM Tris，150mM 氯化鈉，20mM 疊氮鈉，1% BSA，10% 海藻糖，1% Tween20, ρΗ8·0)的 0D4 生物 素：40nm 金綴合物（Innova Bioscience)、0D2 雞 IgY 金綴合物（Mologic)噴射 Whatman 玻 璃纖維墊（Whatman, Rapid 24Q，12mmX 300mm)。處理的綴合物條在隧道式干燥室內在60°C 以10mm/sec的速度干燥。在室溫，將干燥的金綴合-浸漬綴合墊干燥保存于有干燥劑的密 封鋁箔袋。
[0251] B.制備抗體-浸漬的硝酸纖維素膜
[0252] 以0. 05 μ Ι/mm的分配速率將所有試劑條帶化于Millipore HF090膜 (]\^11丨口〇代，冊09004540,40\300臟）上。？4線由距離膜的基線10、12、14和16臟處的 lmg/ml CF1060(Mologic)構成，測試線由距離膜的基線23mm處的濃度為0.4mg/mlBSA 的生物素（Mologic)構成，控制線由距離膜的基線28mm處的濃度為0.5mg/ml的羊抗雞 IgY(Lampire，7455207)構成。處理的膜在隧道式干燥室內在60°C以10mm/sec的速度干燥。 干燥的抗體-浸漬的硝酸纖維素膜室溫保存于有干燥劑的密封鋁箔袋。
[0253] C chase 緩沖液
[0254] 50mM Tris、150mM 氯化鈉、20mM 疊氮鈉、1 % vol/vol Tween 20, ρΗ8· 0 的水溶液。
[0255] D.卡裝配
[0256] 根據詳細說明了每個卡部件的確切縱向維度和位置的如下步驟和圖5裝配測試 卡。準備后，修剪所述卡，獲得多個用于蛋白酶分析的試條。
[0257] · 1. -張75X300mm的清潔的具有離型膜保護膠的塑料膜作為襯片（51) (G&L Precision Die Cutting, 28840)，放置于工作臺上。撕去離型膜以暴露膠帶的粘性面。
[0258] · 2.將按照B部分準備的反應膜（52)附著于底襯（51)的粘性面上，距離低末端 16mm〇
[0259] · 3.將按照A部分準備的浸漬的綴合墊（53)附著于底襯（51)上，在反應膜（52) 上交疊1mm。
[0260] · 4.將緩沖墊（54, Whatman, CF5, 11 X 300mm)放置于底襯（51)上，于綴合墊（53) 上交疊 6臟。
[0261] · 5.雙面膠（55, G&L Precision Die Cutting, GL-187)附著覆蓋于綴合墊（53) 上，距離低末端15mm。
[0262] ·6·樣品接收墊 / 血液分離膜（56, Spectral SG membrane, Primecare)覆蓋放置 于去掉覆蓋層的膠帶（55)上，距離低末端15mm。
[0263] · 7.吸收墊（57, Gel blotting paper, Ahlstrom, grade 222, 23 X 300mm)放置于 底襯（51)上側上，于反應膜（52)上交疊3mm。
[0264] 使用自動化沖壓裁剪機（Kinematic, 2360)修剪所述卡至4mm寬的試條，并組裝進 入2孔塑料殼體（BBI Dundee, vision)。使用在Mologic專門為該裝置生產的氣動壓板裝 置封閉所述裝置。
[0265] 在以下描述的實施例中，制備緩沖液標準品，含有從2000ng/ml低至62. 5ng/m的 不同濃度的 HNE(Lee biotech, 342-40)。
[0266] 步驟I :液體樣品（測試樣品）放于具有固定量的與適配子蛋白質（lOOng/test) 預復合的多肽（6ng/test)的收集裝置中。預確定多肽與適配子蛋白質的比率以保證最佳 結合。劇烈旋轉所述收集裝置以使樣品與底物溶液充分混合。在室溫下孵育該反應混合物 固定的時間段（例如10分鐘）。
[0267] 步驟2 :在孵育期結束時，滴加固定體積的液體至樣品接收墊（56)。當液體遷移至 測試條上，任何完整的指示分子被隱藏的捕獲帶中的預-吸附線識別并捕獲。在那里，樣品 中的HNE已經破壞底物區域，指示分子超生物素測試線遷移，通過多聚鏈霉親和素適配子 蛋白質固定在那里。
[0268] 步驟3 :-旦樣品在用作儲存池的吸收墊（57)幫助下已經通過測試條（52)，加入 兩滴試劑盒中提供的chase緩沖液至緩沖墊（54)，與干燥的附著于金顆粒的生物素接觸并 使其復水。當綴合的金顆粒進入隱藏的捕獲帶，任何結合至預吸附線的完整的指示分子籍 由多聚鏈霉親和素適配子蛋白質被標記。那些沒有在隱藏的捕獲帶結合至完整指示分子的 沿試條向下遷移，并標記任何被測試線捕獲的指示分子。使用單獨的控制系統，其包含結合 至羊抗雞IgY控制線的連接于金顆粒的雞IgY。存在線表示測試完成。
[0269] 通過其相對強度評估形成的線。存在測試線并且存在完全強度的控制線表示在測 試樣品內存在蛋白酶。陰性測試線指示沒有或低于檢測限的低水平的蛋白酶。這兩項極端 之間的階段指示測試樣品內不同水平的蛋白酶。用視覺和NES側流裝置讀取儀測量產生的 有顏色的線的強度。具有0-10數值范圍的半定量評分系統用于視覺讀取，其中1是最低的 可檢測顏色強度，10是觀測到的最高顏色強度。
[0270] 圖6顯示出當運行加入了 HNE標準的緩沖液樣品時分析的靈敏性。使用20 μ 1體 積的樣品，對HNE的檢測限大約在500-1000ng/ml。顯示讀取儀單位，高于1的數值被認為 是陽性的。
[0271] 實施例2 #用具有一個或多個裂解位點的多聚鏈霍親和素：多狀復合物指示分 子的反相ELTABA平臺用于檢測某質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)
[0272] 包含如下成分的試劑盒：_
[0273] 1)用于收集樣品的裝置（例如用于尿液）
[0274] 2)用于使金綴合物復水的chase緩沖液，由pH 8. 0的tris鹽緩沖液（TBS)和1 % Tween?20 組成。
[0275] 3)側流測試條，其固定在塑料盒內。測試條具有隱藏的捕獲帶，捕獲帶包含四條預 吸附線（PA線）形式的羊抗體，第二捕獲帶，包含綴合至轉運蛋白（carrier protein)的生 物素作為橫穿測試條流動路徑的第一測試線，和第三捕獲帶，在測試線的下游，包含吸附的 抗雞抗體，作為橫穿測試條流動路徑的控制線。在塑料盒中有觀察窗，通過觀察窗觀察測試 和控制線。在第一測試線的上游，還有整合的樣品接收墊。此外，測試條有帶有生物素的金 顆粒，干燥進入測試條的樣品接收墊上游，其可以通過在金綴合墊上游接收chase緩沖液 的第二孔中加入緩沖液而被復原。
[0276] 4)管，其中可設置樣品收集裝置，和指示分子。
[0277] 5)指示分子（其可以合并進樣品收集裝置）。指示分子由包含MMP-9偏好的氨基 酸序列一GPQGIFGQ(SEQ ID N0:1)-組成。指示分子攜帶末端生物素基團，通過聚乙二醇甘 油間隔子/連接子連接，這允許其與適配子分子鏈霉親和素形成復合物。也包括能夠被固 定于隱藏的捕獲帶中的羊抗體識別的第一捕獲區域（ALP)。使用了具有不同數量的MMP9裂 解位點的不同指示分子，特別是1、2、3、5和7個MMP9裂解位點。
[0278] 6)適配子分子，例如含有能夠與含有裂解位點的指示分子形成復合物的多個結合 區域的多聚鏈霉親和素。
[0279] 測試備
[0280] 如下所述，根據本發明構建用于檢測液體樣品中蛋白酶活性的測試條。所述分析 基于在MMP-9存在時指示分子中的裂解產生將結合至測試線的片段。用試條測試了包括創 面積液樣品的各種樣品，用于檢測蛋白酶活性。
[0281] A.制各金-潯淸綴合物墊
[0282] 使用Isoflow分樣儀（噴射高度7mm)以0· 9 μ Ι/mm用稀釋于金干燥緩沖液（50mM Tris，150mM 氯化鈉，20mM 疊氮鈉，1% BSA，10% 海藻糖，1% Tween20, ρΗ8·0)的 0D4 生物 素：40nm 金綴合物（Innova Bioscience)、0D2 雞 IgY 金綴合物（Mologic)噴射 Whatman 玻 璃纖維墊（Whatman, Rapid 24Q，12mmX 300mm)。處理的綴合物條在隧道式干燥室內在60°C 以10mm/sec的速度干燥。在室溫，將干燥的金綴合-浸漬綴合墊干燥保存于有干燥劑的密 封鋁箔袋。
[0283] B.制各抗體-潯淸的硝酸纖維素臘
[0284] 以0. 05 μ Ι/mm的分配速率將所有試劑條帶化于Millipore HF090膜 (Millipore，HF09004S40,40X300mm)上。PA 線由距離膜的基線 10、12、14 和 16mm 處的 lmg/ml CF1060(Mologic)構成，測試線由距離膜的基線23mm處的濃度為0.4mg/mlBSA 的生物素（Mologic)構成，控制線由距離膜的基線28mm處的濃度為0.5mg/ml的羊抗雞 IgY(Lampire，7455207)構成。處理的膜在隧道式干燥室內在60°C以10mm/sec的速度干燥。 干燥的抗體-浸漬的硝酸纖維素膜室溫保存于有干燥劑的密封鋁箔袋。
[0285] C. Chase 緩沖液
[0286] 50mM Tris，150mM 氯化鈉 ，20mM 疊氮鈉，1 % vol/vol Tween 20, pH8. O 的水溶液。
[0287] D.裝配卡
[0288] 根據詳細說明了每個卡成分的確切縱向維度和位置的如下步驟和圖5組裝測試 卡。準備后，修建所述卡，獲得多個用于蛋白酶分析的試條。
[0289] · 1. 一張75X300mm的清潔的具有離型膜保護膠的塑料膜作為襯片（51) (G&L Precision Die Cutting, 28840)，放置于工作臺上。撕去離型膜以暴露膠帶的粘性面。
[0290] · 2.將按照B部分準備的反應膜（52)附著于底襯（51)的粘性面上，距離低末端 16mm〇
[0291] · 3.將按照A部分準備的浸漬的綴合墊（53)附著于底襯（51)上，在反應膜（52) 上交疊 1mm。
[0292] · 4.將緩沖墊（54, Whatman, CF5, 11 X 300mm)放置于底襯（51)上，于綴合墊（53) 上交疊 6臟。
[0293] · 5.雙面膠（55, G&L Precision Die Cutting, GL-187)附著覆蓋于綴合墊（53) 上，距離低末端15mm。
[0294] ·6·樣品接收墊 / 血液分離膜（56, Spectral SG membrane, Primecare)覆蓋放置 于去掉覆蓋層的膠帶（55)上，距離低末端15mm。
[0295] · 7.吸收墊（57, Gel blotting paper, Ahlstrom, grade 222, 23 X 300mm)放置于 底襯（51)上側上，于反應膜（52)上交疊3mm。
[0296] 使用自動化沖壓裁剪機（Kinematic, 2360)修剪所述卡至4mm寬的試條，并組裝進 入2孔塑料殼體（BBI Dundee, vision)。使用在Mologic專門為該裝置生產的氣動壓板裝 置封閉所述裝置。
[0297] 在以下描述的實施例中，制備緩沖液標準品，含有從2000ng/ml低至31. 25ng/m的 不同濃度的MMP_9 (Mologic)。
[0298] 步驟1 :液體樣品（測試樣品）放于具有固定量多肽（6ng/test)的收集裝置中。 劇烈旋轉所述收集裝置以使樣品與指示分子充分混合。在室溫下孵育該反應混合物固定的 時間段（例如10分鐘），之后加入適配子分子（lOOng/test)，其與指示分子上的生物素形 成復合物。
[0299] 步驟2 :在孵育期結束時，滴加固定體積的液體至樣品接收墊（56)。孵育期前加入 至樣品的指示分子能夠通過第1捕獲區域結合至隱藏的捕獲帶中的羊抗體（CF1060)。存在 于樣品中的任何MMP-9在裂解位點裂解指示分子，使裂解的片段從隱藏的捕獲帶釋放。裂 解的片段超生物素測試線遷移，通過多聚鏈霉親和素適配子分子固定在那里。
[0300] 步驟3 :-旦樣品在用作儲存池的吸收墊（57)幫助下已經通過測試條（52)，加入 兩滴試劑盒中提供的chase緩沖液至緩沖墊（54)，與干燥的連接于金顆粒的生物素接觸并 使其復水。當綴合的金顆粒進入隱藏的捕獲帶，任何結合至預吸附線的完整的指示分子籍 由多聚鏈霉親和素適配子蛋白質被標記。那些沒有在隱藏的捕獲帶結合至完整指示分子的 沿試條向下遷移，并標記任何被測試線捕獲的指示分子。使用單獨的控制系統，其包含結合 至羊抗雞IgY控制線的連接于金顆粒的雞IgY。存在線表示測試完成。
[0301] 通過其相對強度評估形成的線。存在測試線并且存在完全強度的控制線表示在測 試樣品內存在蛋白酶。陰性測試線指示沒有或低于檢測限的低水平的蛋白酶。這兩項極端 之間的階段指示測試樣品內不同水平的蛋白酶。用視覺和NES側流裝置讀取儀測量產生的 有顏色的線的強度。
[0302] 結果顯示于表1和圖7。
[0303] 表 1

【權利要求】
1. 在用于檢測測試樣品中酶裂解活性的指示分子，包括： (i) 包括多個裂解位點的酶可修飾區域，其中任何一個裂解位點的裂解引起該區域從 非修飾狀態向修飾狀態轉變； (ii) 間隔開的捕獲位點，不論該酶的可修飾區域的狀態如何，該捕獲位點可W被捕獲 分子結合；和 (iii) 間隔開的檢測位點。
2. 根據權利要求1所述的指示分子，包括2-25個裂解位點。
3. 根據權利要求1或2所述的指示分子，其中多個裂解位點能夠被金屬蛋白酶（MMP) 或者人中性粒細胞彈性蛋白酶裂解。
4. 根據權利要求3所述的指示分子，其中MMP為MMP-9。
5. 根據權利要求1-4之一所述的指示分子，其中酶可修飾區域和檢測區域被附著至轉 運蛋白。
6. 用于檢測測試樣品中酶活性的酶檢測裝置，包括： (i) 加入樣品中的指示分子，該指示分子包括： (a)酶可修飾區域，該區域能夠被所述酶修飾，引起該區域從非修飾到修飾狀態的轉 變； 化）檢測區域；不論該酶修飾區域的修飾狀態如何，該區域未被所述酶修飾和能夠被 報告分子結合，和 (ii) 來接收測試樣品的選擇性捕獲區域，其中，該選擇性捕獲區域包括能夠選擇性地 結合處于修飾或未修飾任一狀態中的指示分子的酶可修飾區域的選擇性識別分子；和 (iii) 用來接收與選擇捕獲區域接觸后的測試樣品的檢測區域，其中，檢測區域與選擇 性捕獲區域空間上間隔開從而向檢測區域暴露測試樣品發生在在先向選擇性捕獲區域暴 露測試樣品之后，和其中，只有那些不結合選擇性捕獲區域中的選擇性捕獲分子的指示分 子進入檢測區域，其中，所述指示分子在選擇性捕獲區域和/或檢測區域上被檢測。
7. 根據權利要求6所述的裝置，其中，指示分子的檢測區域包括捕獲位點，和檢測區域 包括能夠特異結合指示分子的捕獲位點的捕獲分子，如果指示分子存在的話。
8. 根據權利要求6或7所述的裝置，其中，指示分子的酶可修飾區域包括膚、蛋白、碳水 化合物，脂質或核酸。
9. 根據權利要求6-8任一項所述的裝置，其中被檢測的酶選自如下種類；氧化還原酶， 轉移酶，水解酶，裂解酶，異構酶和連接酶，包括蛋白酶、膚酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磯酸 酶、硫酸醋酶、神經氨酸巧酶，唾液酸巧酶、脂酶，脫氧核糖核酸酶值NAse)和核糖核酸酶 (RNAse)，激酶；甘油轉移酶；氧化酶；還原酶和轉氨酶的亞種。
10. 根據權利要求6-9任一項所述的裝置，其中，被檢測的酶為金屬蛋白酶或者人中性 粒細胞衍生的彈性蛋白酶。
11. 根據權利要求6-10任一項所述的裝置，其中，選擇性的識別分子為抗體或其抗原 結合片段；生物素，鏈酶親和素或他們的衍生物，凝集素，核酸分子，受體分子或激素結合蛋 白。
12. 根據權利要求6-11任一項所述的裝置，其中，一旦所述指示分子被選擇性識別分 子結合，所述酶可修飾區域不能夠被所述酶修飾。
13. 根據權利要求7-12任一項所述的裝置，其中，捕獲位點和捕獲分子為結合對中的 兩半，其中所述的結合對選自如下的結合對：-抗原和抗體或者他們的結合片段；生物素和 親和素，鏈霉親和素，中性親和素或captavidin ;免疫球蛋白或其合適的域和蛋白A或G ; 碳水化合物和凝集素；核巧酸序列互補的序列；配體和受體分子；激素和激素結合蛋白；酶 輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素結合區域和纖維素纖維；固定的氨基苯基測酸和 具有順式-二醇分子；木葡聚糖和纖維素纖維和他們的類似物，衍生物W及片段。
14. 根據權利要求6-13任一項所述的裝置，其中，另外包括結合至指示分子的檢測區 域或者能夠結合指示分子的檢測區域的報告分子。
15. 根據權利要求14所述的裝置，其中，所述指示分子的檢測區域包括與捕獲位點不 同并且空間上間隔開的檢測位點，和所述報告分子通過所述檢測位點結合至檢測區域。
16. 根據權利要求14所述的裝置，其中，所述報告分子通過捕獲位點結合到檢測區域 上，其中報告分子與捕獲位點的結合不消弱捕獲位點結合捕獲分子的能力。
17. 根據權利要求14-16任一項所述的裝置，其中，所述報告分子與捕獲區域的結合是 間接的，并且通過能夠同時結合所述檢測區域和所述報告分子的適配子作為媒介完成。
18. 根據權利要求14-17任一項所述的裝置，其中，所述多個報告分子可W結合每一個 指示分子。
19. 根據權利要求17或18所述的裝置，其中，所述適配子結合到指示分子中的檢測區 域中的捕獲位點，從而捕獲位點通過適配子間接地結合存在于裝置的檢測區域中的捕獲分 子。
20. 根據權利要求6-19所述的裝置，其中，檢測區域包括固相支撐，和捕獲分子位于固 相支撐之上或之中。
21. 根據權利要求6-20任一項所述的裝置，其中，所述裝置為流體裝置，和所述的選擇 性捕獲區域和檢測區域沿著層析介質順序存在。
22. 根據權利要求14-21任一項所述的酶檢測裝置，其中，所述檢測區域另外還包括固 定的識別分子，在指示分子不存在的時候，報告分子結合至識別分子。
23. 用于測試樣品中酶活性檢測的指示分子，包括： (i) 酶可修飾區域，該區域被所述酶修飾，引起該區域從未修飾到修飾狀態的轉變，所 述未修飾和修飾狀態就被選擇性識別分子結合而言是結構上可區分的； (ii) 間隔開的捕獲位點，不論該酶修飾區域的修飾狀態如何，該位點被捕獲分子結 合； (iii) 間隔開的檢測位點，不論該酶修飾區域的修飾狀態如何和不論捕獲位分子與捕 獲位點為之前或同時結合，該位點都能夠被報告分子結合。
24. 根據權利要求23所述的指示分子，其中，酶可修飾區域為在酶裂解位點被酶所裂 解。
25. 根據權利要求24所述的指示分子，其中，所述指示分子包括多個酶裂解位點，其中 在任意一個位點的裂解引起酶修飾區域從非修飾狀態到修飾狀態的轉變。
26. 根據權利要求25所述的指示分子，包括2和7個之間的裂解位點。
27. 根據權利要求23-26任一項所述的指示分子，酶可修飾區域和檢測位點附著于轉 運蛋白。
28. 如權利要求23-27所述的指示分子在如權利要求6-22所述的酶檢測裝置中的用 途。
29. 用于檢測測試樣品中酶活性存在的方法，該方法包括W下步驟；（i)提供一種酶檢 測裝置，包括： 加入樣品中的指示分子，所述指示分子包括： (a)酶可修飾區域，能夠被所述酶修飾，引起該區域從非修飾狀態到修飾狀態的轉變； 化）檢測區域，不論該酶修飾區域的修飾狀態如何，該檢測區域不被酶修飾和能夠被報 告分子結合； 用來接收測試樣品的選擇性捕獲區域，其中，該選擇性捕獲區域包括能夠選擇性地結 合處于修飾或未修飾任一種狀態的指示分子的酶可修飾區域的選擇性識別分子；和 用來接收與選擇捕獲區域接觸后的測試樣品的檢測帶，其中，檢測區域與選擇性捕獲 區域空間上間隔開； (ii) 提供懷疑有酶活性的測試樣品； (iii) 在如果存在所述酶的活性能夠修飾所述酶可修飾區域的條件下，把裝置的指示 分子加入到測試樣品中； (iv) 讓測試樣品與裝置的選擇性獲區域接觸，從而讓處于修飾或未修飾的任一狀態的 指示分子與選擇性捕獲分子結合，從而，如果存在，允許修飾形式或未修飾形式的指示分子 與相反狀態的指示分子分離； (V)讓測試樣品與檢測區域接觸，其中，只有不結合至選擇性捕獲帶內的選擇性捕獲分 子的指示分子進入檢測區域；和 (Vi)檢測任何存在于檢測區域和/或選擇性捕獲區域中的任何指示分子。
30. 根據權利要求29所述的方法，其中，所述酶檢測裝置為如權利要求6-22所述的裝 置，或者所述指示分子為如權利要求23-27任一項所述的指示分子。
31. 根據權利要求29或30所述的方法，其中，通過免疫分析方法進行檢測區域中任何 指示分子的檢測。
32. 根據權利要求31所述的方法，其中，通過化ISA，英光免疫或者放射性免疫方法進 行檢測區域中任何指示分子的檢測。
33. 根據權利要求29-32任一項所述的方法，其中，所述指示分子的檢測區域包括捕獲 位點，和所述檢測區域包括能夠結合所述指示分子的捕獲位點的捕獲分子，如果所述指示 分子存在。
34. 根據權利要求29-33任一項所述的方法，其中，所述選擇性識別分子結合至未修飾 狀態的識別分子，和檢測區域中指示分子的存在表示酶存在于測試樣品中。
35. 如權利要求6-22之一所述的酶檢測裝置在測試樣品中酶活性中的用途。
【文檔編號】G01N33/573GK104471400SQ201380021024
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年4月22日 優先權日:2012年4月20日
【發明者】保羅·大衛, 凱特·帕克 申請人:莫洛克有限公司