酶檢測裝置制造方法

酶檢測裝置制造方法
【專利摘要】本發明涉及檢測測試樣本中的能夠裂解底物的酶活性的酶檢測裝置。本發明也涉及檢測酶活性，特別的涉及測試樣本中能夠裂解底物的酶活性，和確定測試樣本中這樣的酶的水平或數量的方法。
【專利說明】酶檢測裝置

【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶檢測裝置，特別的但并不排出的，涉及用于檢測測試樣本中能夠裂 解底物的酶活性的裝置。本發明也屬于檢測酶活性的方法，特別的，涉及監測測試樣本中能 裂解底物的酶活性的方法，和確定測試樣本中這樣酶的水平或數量的方法。

【背景技術】
[0002] 在生命組織中，酶屬于參與催化化學反應的蛋白家族。作為他們的重要或有益的 結果，許多情況需要來檢測酶的水平，重要的，酶的活性。
[0003] 特別的，酶活性的增加已經發現與某些特殊的情況和/或疾病相關。例如，蛋白酶 活性的增加與很多癌癥發展的進程相關。從患者體內獲得樣本進行與某種特殊狀況或懷疑 具有某種特殊的狀況的酶活性的測試可以被利用作為預測或診斷目的。
[0004] 在酶族中，有許多類型的酶可以加速底物的裂解。例如，在他們各自的底物中，肽 酶或蛋白酶可以催化肽鏈的水解。過去，研宄者在某些案例中使用試劑盒或裝置來試圖 測量這些類型的活性，這些試劑盒或裝置測量從初始酶底物中釋放的片段或者"脫離的基 團"。
[0005] 基于這樣的原理的分析測試已經在某些案子中被描述，
【發明者】已經描述使用工 程底物分子連接到報告半族。通過被檢測的酶對底物的裂解，如果存在，導致所述報告 物質的釋放，他可以別被本領域一般技術人員知道的很多技術檢測到。這種檢測在例如 US20060003394申請中有描述。
[0006] 其他一些開發的用于測試酶活性的測試方法是基于酶底物的修飾和非修飾之間 的區別。在這方面，W02009/024805描述了酶檢測裝置，該裝置利用帶有可被檢測的標記的 "底物識別分子"（SRM)，其中，在修飾或非修飾狀態中，SRM特異結合到酶底物上。
[0007] 到目前為止，和這些已有描述檢測有關的問題包括，特別是，使用描述的形式可以 取得的準確性。特別的，US2006/0003394描述了一個盒子，其中，酶-底物混合物被施加到 層析介質上。當酶不存在的時候，底物-報告物"反應復合物"在上游位置發生固定，當存 在酶的時候，反應復合物的裂解倒是報告物向下游流動。因為酶，如果存在，能夠繼續裂解 固定在上游位置的反應復合物，通過在任意位置存在的報告物質的任何信號的產生都常常 隨著時間而改變，這樣的反應沒有明確的終點。使用這樣分析形式，就會產生嚴重的準確性 和數據重現性的問題。


【發明內容】

[0008] 考慮到在多種情況中，酶活性的測量是非常有用或有利的，本發明人的目的就是 提供或開發一種簡單的，精力充沛的裝置來準確地測量測試樣本中酶的裂解活性。
[0009] 基于本發明的第一方面，提供用于測試樣本中具有裂解底物的酶的裂解活性存在 的酶檢測裝置，該裝置包括：
[0010] α)用于加入測試樣本中的指示分子，該指示分子包括：
[0011] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0012] (b)第一捕獲位點；和
[0013] (C)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0014] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子的片段的釋放；
[0015] (ii)用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的 第一捕獲位點的第一捕獲分子，但并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解片段，和其 中，通過第一捕獲位點的結合，指示分子被捕獲到第一捕獲分子上從而實質防止任何隨后 被該酶引起的裂解位點的裂解；和
[0016] (iii)用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕 獲區域包括能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第 一捕獲區域處于空間上的分離；和其中，在檢測區域對通過第二捕獲位點被結合到第二捕 獲分子上的任何被裂解的指示分子的檢測，表示測試樣本中酶裂解活性的存在。
[0017] 在使用的時候，測試樣本首先與第一捕獲區域接觸，其中，通過第一捕獲位點與第 一捕獲分子的結合，該指示分子被捕獲，從而實質避免任何后來裂解位點被酶所裂解，和然 后，測試樣本與第二捕獲區域接觸，其中，在檢測區域對通過第二捕獲位點被結合到第二捕 獲分子上的任何被裂解的指示分子的檢測，表示測試樣本中酶裂解活性的存在。
[0018] 用于本發明裝置中的測試樣本可以使是任何已知的或懷疑含有酶的材料，也可是 從人任何資源獲得的材料。在一些方式中，測試樣本可以從生物資源中獲得，這些生物資源 包括血液，唾液，尿液，牛奶，來源于傷口的流體，腹水，腹膜的流體，羊水和其他。在一些優 選的方式中，測試樣本為傷口流體和裝置被用來檢測傷口流體中酶的活性，優選的，蛋白酶 活性，這樣可以評估傷口恢復的狀態或和速度。在一些方式中，測試樣本為尿液，裝置被用 來檢測尿液中酶的活性，特別是蛋白酶的活性。
[0019] 測試樣本可以被任何合適的方式收集，和一任何形式的存在來使用本發明的裝置 進行檢測，例如固體或液體形式存在。進一步，作為從他的原始資源中獲得的樣本，在使用 本發明的裝置進行檢測之前，該樣本可以經過一個或多個處理或前處理步驟。在一個實施 方式中，固態樣本可以被處理產生溶液或懸浮樣本。進一步，在一些方式中，測試樣本可以 被儲藏，例如在大約-20°C下冷凍儲藏，從而在使用本發明的裝置進行檢測前可以讓樣本保 存任何時間長度。
[0020] 本發明的裝置用來檢測酶的裂解活性的存在。裝置可以被用來直接測試酶是否存 在或不存（物理的）在一個給定的測試樣本中。可選的，測試樣本可以被提供，其中酶是已 知存在的，和該酶的裂解活性可以使用本發明的檢測裝置被檢測。例如，測試樣本包括有已 知數量的酶，一個或多個酶活性的調節器或懷疑的酶活性調節器可以被與本發明的裝置結 合使用。在一個實施方式中，本發明的裝置被用來檢測酶裂解活性的調節器或抑制試劑。
[0021] 本發明依賴加入測試樣本中的指示分子的使用。這樣，本發明的第二個方面，本發 明提供在用于檢測測試樣本中具有裂解底物的酶的裂解活性存在的指示分子，該指示分子 包括：
[0022] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0023] (b)第一捕獲位點；和
[0024] (C)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0025] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放。
[0026] 本發明裝置的指示分子包括第一裂解位點，它被這樣選擇來被所述的酶或被檢測 的酶特異裂解，如果所述的酶存在于測試樣本中。在裂解位點，指示分子的裂解是本發明的 酶檢測裝置的實質功能，因為它引起了包括有檢測區域的指示分子的片段的釋放；這個指 示分子的片段不被裝置的第一捕獲區域中第一捕獲分子所結合。因此，裝置中第二捕獲區 域中的被釋放的片段的檢測可以表示測試樣本中酶的裂解活性。
[0027] 裂解位點可以是存在任何酶-裂解結合的位點。例如，這樣結合可以存在于指示 分子臨近的殘基之間。這樣的殘基可以選自于核苷酸，單糖和氨基酸。在一個優選的方式 中，所述的裂解位點為位于兩個氨基酸殘基之間的特殊的肽鍵。
[0028] 在一些優選的方式中，裂解位點位于指示分子的底物區域中。所述的底物區域可 以包括一肽，蛋白或糖類，脂質或和核苷酸。在這些方式中，指示分子的底物區域可以被改 造，這樣底物區域就包括酶的自然底物或底物的一部分，這樣酶就與底物區域的本土裂解 位點一起存在。在一些其他的方式中，指示分子也可以這樣改造，這樣它就包括人工的，非 自然的裂解位點和/或底物區域。例如，底物區域可以被改造或變異，這樣，通過所述酶表 現出來的裂解活性或特異的裂解活性的速度就相對于在可以比較的情況下，酶的自然狀態 下，酶表現出來的裂解活性或特異的裂解活性的速度得以增加（或降低）。
[0029] 在這里，使用本發明描述的裝置進行檢測的酶必須具有裂解底物的能力。這種活 性被要求來讓指示分子可以被裂解為至少兩個分離的片段，其中一個片段包括或由檢測區 域組成。這樣，在一個優選的方式中，酶或被本發明裝置檢測的酶選自于如下的酶：氧化還 原酶；水解酶和裂解酶，和包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神經 氨酸苷酶，唾液酸苷酶、脂酶，脫氧核糖核酸酶（DNAse)和核糖核酸酶（RNAse)的亞種。
[0030] 在一些優選的方式中，用于本發明的裝置來檢測來自傷口流體樣本中的酶 活性。在這樣的實施方式中，被檢測的酶優選為蛋白酶，和優選的為金屬蛋白酶矩 陣（matrix metalloproteases MMPs)或者人類衍生的中性粒細胞彈性蛋白酶（human neutrophil-derived elastase HNE)。在一些優選的方式中，被本發明檢測裝置檢測酶為 組織蛋白酶，特別為組織蛋白酶G(cathepsin G)。
[0031] 在一些優選的方式中，用于本發明的裝置來檢測來自尿液樣本中的酶活性。在這 樣的實施方式中，被檢測的酶優選為蛋白酶，和優選的為金屬蛋白酶矩陣（MMPs)或者人類 衍生的中性粒細胞彈性蛋白酶（HNE)。
[0032] 在一些方式中，指示分子的裂解位點和/或底物區域可以是相對非特異性，這樣 裂解位點可以被至少一種如上所述的酶或酶的亞簇識別或作用。例如，一個單一的肽底物 可以被蛋白酶和肽酶同時裂解。在這樣的實施方式中，其中裂解位點被至少一種如上所述 的酶裂解或作用，裝置可以被用來檢測測試樣本中具有裂解指示分子的任何這樣的酶的存 在。
[0033] 在另外一些方式中，指示分子的裂解位點和/或底物區域可以是具有高度的特異 性，僅僅只有一種如上所述的酶或酶的亞簇識別或作用裂解位點。這樣，作為酶分類的亞簇 就落入到任何如上所述的亞簇中。例如，裂解位點可以被單一的蛋白酶或蛋白酶的亞簇識 另IJ。蛋白酶的亞簇可以包括如下的酶：絲氨酸蛋白酶，蘇氨酸蛋白酶，天門冬氨酸蛋白酶，金 屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶。這樣，本發明的裝置就可以是僅僅只檢測一個種酶的活性或單 一的酶的亞族中的酶。
[0034] 本發明裝置中的指示分子可以包括多個裂解位點，其中在任何一個裂解位點的裂 解導致包括檢測區域的片段的釋放。在本發明中，術語"多個"意思是指至少兩個，至少3 個，至少4個或更多。
[0035] 在一些方式中，指示分子包括位于 2,3, 4, 5 和 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1 9, 20, 25, 50, 100, 500或1000之間的裂解位點。在一些方式中，指示分子包括位于2和 5, 6, 7, 8, 9或10之間的裂解位點。
[0036] 在一個方式中，多個裂解位點可以都是相同的。在這樣的結構中，重復的裂解位點 可以對于某種酶或酶的亞族具有非特異性或高度特異性。進一步，這樣指示分子的使用可 以通過提高測試樣本中裂解位點的濃度來幫助提高酶檢測裝置的靈明度。
[0037] 在一些另外的方式中，指示分子可以包括多個裂解位點，其中至少兩個不同的裂 解位點存在于相同的指示分子中。在優選的方式中，指示分子可以包括至少3種，至少4種， 至少5種，至少8種不同的裂解位點。
[0038] 在進一步的方式中，這些不同的裂解位點可以被不同的酶或不同的種類，亞族的 酶所識別，這樣本發明的裝置可以被用來檢測多種不同酶的活性。這種活性可是群體性的， 這樣酶的活性的檢測給出了有用的結果。例如，這樣多種酶群可能與某種疾病的狀態相關， 這樣對一種或多種酶的活性的檢測可以作為診斷使用。
[0039] 多種裂解位點的使用（無論是相同的或不同的）可以對于需要測試的樣本中非常 低水平的酶的活性的檢測特別有用。例如，指示分子具有多個如上所述的裂解位點，可以被 用來檢測具有低水平蛋白的尿液中的酶的活性。
[0040] 除了裂解位點，本發明的指示分子包括第一捕獲位點。該第一捕獲位點作為指示 分子結合到裝置的第一捕獲區域的第一捕獲分子上的媒介。這樣，第一捕獲位點作為相應 指示分子的一部分在裝置的第一捕獲區域上來保留或定位指示分子。隨著指示分子的裂 解，第一捕獲位點可以保持完整或實質完整，這樣該位點任然可以被裝置中的第一捕獲區 域張的捕獲分子識別或接合。在這樣的環境下，完整的指示分子和包括第一捕獲位點的指 示分子的任何裂解的片段都將在裝置的第一捕獲區域上被結合到第一捕獲分子上。
[0041] 可選的，指示分子的裂解可以導致第一捕獲位點的破壞或毀滅，這樣僅僅只有完 整的指示分子（例如，哪些沒有被酶作用的分子）才能結合到裝置的第一捕獲區域上的第 一捕獲分子上。
[0042] 在某些方式中，指示分子的第一捕獲位點可以作為裂解位點存在于指示分子的相 同區域中。依據本發明的內容，一"區域"的意思就是指含有多個"位點"的指示分子的一 部分或某個范圍。裂解位點和第一捕獲位點可以在指示分子的底物區域中形成離散、不連 續的位點。可選的，裂解位點和第一捕獲位點可以在指示分子的底物區域中形成重疊的位 點。其中，裂解位點和第一捕獲位點重疊的時候，很可能就是指示分子的裂解位點的裂解將 會導致第一捕獲位點的破壞或毀壞（如上討論的）。
[0043] 如上所述，底物區域可以是肽，蛋白，糖，脂質或核酸。在一些優選的方式中的指示 分子，裂解位點和第一捕獲位點可以是肽或蛋白底物區域中的一些離散的氨基酸，氨基酸 組。在另一些方式中，裂解位點和第一捕獲位點是肽或蛋白底物區域中的重疊的氨基酸殘 基形成。在這里，術語"肽"是指長度不超過20, 30, 40or50個氨基酸的氨基酸序列。
[0044] 可選的，存在于指示分子的第一捕獲位點的位置與指示分子上的裂解位點的位置 是分開的。這樣，在一些實施方式中，第一捕獲位點可以存在于第一捕獲區中，和裂解位點 可以存在于間隔開的指示分子中的另一底物區域中。在一些方式中，對于裂解位點，第一捕 獲位點可以位于指示分子的間隔開的區域，第一捕獲位點可以包括完全與含有裂解位點的 分子的區域不同的殘基或材料。例如，底物區域可以包括氨基酸殘基，然而第一捕獲位點可 以包括或由生物素半族。進一步，在一些方式中，指示分子包括分隔的區域，該區域包括裂 解位點和第一捕獲位點，這樣的區域可以通過本領域現有的技術進行連接。在一個優選的 方式中，所述的區域通過直接的共價鍵連接。進一步，這樣的區域可以通過連接子，空間相 緊鄰或間隔開，例如聚乙二醇或聚氧乙稀（polyethylene glycol)半族。
[0045] 在前述所有方式中，不論捕獲位點與指示分子的裂解位點是否在相同或不同的區 域，捕獲區域中的第一捕獲分子與指示分子的第一捕獲位點的結合都實質阻止任何隨后通 過該酶對裂解位點的裂解。在一些方式中，指示分子包括多個裂解位點，指示分子的捕獲位 點與第一捕獲分子的結合實質阻止任何隨后在任何裂解位點的酶的裂解。在這里，"實質阻 止"意思是一旦該指示分子被結合到第一捕獲分子，在一定的時間結束或者一定的時間后， 相對于使用本發明的裝置測量的非裂解的指示分子，沒有進一步的分子的裂解導致在裂解 的分子中的有意義的（顯著的）檢測變化。這些特點與本發明的裝置共同作為一個整體來 獲得可靠的，準確的"終點"分析，這些將在下面進行詳細的討論。
[0046] -旦指示分子通過第一捕獲位點被結合到裝置的第一捕獲分子上，作為結合相互 作用從物理上阻止酶接近裂解位點的結果就是裂解可以被實質阻止。作為裂解位點和第一 捕獲位點之間重疊或親近的結果，一旦指示分子結合到第一捕獲分子上，接近裂解的位點 可以被阻止掉。可選的，指示分子與第一捕獲分子的結合可以不直接導致裂解位點的阻礙， 但是可以實質通過指示分子空間構象的變化而形成包圍裂解位點的為主從而阻止酶接近 位點。
[0047] 在一些優選的方式中，對于指示分子結合第一捕獲分子具有相對更高的親和力。 在優選的方式中，對于指示分子的裂解系數（k d)將會相對低，優選的在OM he I X KT7M 之間（以來檢測的靈敏性）。在一些更優選的方式中，對于指示分子的裂解系數處于I X KT15M 和 I X KT9M 之間。
[0048] 在一些方式中，指示分子的第一捕獲位點直接結合到存在裝置中的第一捕獲區域 的第一捕獲分子而成為這樣的相互結合。相反，直接結合的意思就是指示分子與第一捕獲 分子的結合不通過任何中間媒介。
[0049] 在一些方式中，指示分子的第一捕獲位點和裝置的第一捕獲區域的第一捕獲分子 為結合對的兩半。這樣，結合對包括兩個可以相互結合的分子或實體。在一個優選的方式 中，相互結合為特異性的結合，這樣結合對的每一個成員只能結合其對應的另一個成員，或 者只是結合少數的結合成員。進一步講，更詳細的，優選的就是結合對表現出相對高的親和 性。結合對可以是自然獲得的，也可是一相互結合的人工合成的。
[0050] 在另一個優選的方式中，指示分子的第一捕獲位點和第一捕獲分子為結合對中的 兩半，其中所述的結合對選自如下的結合對：抗原和抗體或者他們的結合片段；生物素和 親和素，鏈霉親和素，中性或凱普親和素；免疫球蛋白（或者片段）和蛋白A或G ;碳水化合 物和血凝素；與核苷酸序列互補的序列；配體和受體分子；激素和激素結合蛋白；酶輔助因 子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素結合區域和纖維素纖維；固定的氨基苯基硼酸和順式-二 醇軸承分子；葡聚糖和纖維素纖維和他們的類似物，衍生物以及片段。
[0051] 在一個優選的方式中，結合對包括生物素和鏈球菌親和素。在一個優選的方式中， 指示分子的第一捕獲位點包括一表位和第一捕獲分子包括抗體，其中該抗體特異結合位于 第一捕獲位點上的表位。根據本發明的內容，術語抗體包括從任何種類、任何抗體或人工合 成的抗體，F (ab'）2片段，Fab片段，Fv片段，sFv片段，一些與抗體相關區域的高分子，他們 具有特有的親和性（例如，單個區域的抗體）。
[0052] 在某些方式中，指示分子的第一捕獲位點向裝置的第一捕獲分子的結合可以是間 接的。根據本發明的內容，"間接的結合"意思是通過某些具有橋聯指示分子和第一捕獲分 子的媒介來實現結合，例如一個"適配子"（"adaptor"）可以同時結合指示分子的第一捕 獲位點和第一捕獲分子。
[0053] 其中，指示分子的第一捕獲位點向裝置的第一捕獲分子的結合可以是通過適配子 間接的結合，她可以是多個指示分子向每一個捕獲分子的結合。根據內容，多數的意思是指 至少兩個，至少三個，至少4個等等。這可以通過多價受體分子實現，例如，鏈球菌親和素可 以同時結合多個帶有指示分子的生物素，除了第一捕獲分子帶有或包括生物素之外。
[0054] 在裝置的具體方式中，多個指示分子結合到每一個捕獲分子，這樣使用可以提高 檢測的準確性，這在下面詳細闡述。
[0055] 除了裂解位點和第一捕獲位點，指示分子包括檢測區域，檢測區域包括或實質由 第二捕獲位點組成。指示分子的這樣的結構可以讓裂解位點的裂解引起指示分子的釋放片 段，該片段包括檢測區域。包括檢測區域的指示分子的裂解片段不能被裝置的第一捕獲區 域的第一捕獲分子結合或識別。相反，在檢測區域的第二捕獲位點允許在裝置的第二捕獲 區域中對釋放的的指示分子片段進行捕獲，這種捕獲通過第二捕獲位點和位于第二捕獲區 域中的第二捕獲分子之間的結合實現的。
[0056] 指示分子的檢測區域可以通過合適的方式與包括有裂解位點的區域或裂解位點 連接。在一個方式中，連接是通過直接的共價鍵。在一個可選的方式中，指示分子的檢測區 域通過連接器或轉運蛋白與包括有裂解位點的區域連接。在一些優選的方式中的指示分 子，檢測區域和包括有裂解位點的區域包括，或實質包括，或實質組成，牛血清蛋白（BSA)。 通過轉運蛋白的使用，檢測區域和包括有裂解位點的區域相對的數量可以通過控制每一個 區域連接到轉運蛋白的數量進行調整。這樣，轉運蛋白允許多個檢測區域和包括裂解位點 的多個區域被連接到每一個轉運蛋白上。這樣，在一些方式中，比連接到轉運蛋白上的包括 裂解位點區域的數量更大數量的檢測區域連接到轉運蛋白上。例如，轉運蛋白包括檢測區 域與含有裂解位點的區域的比例可以是2:1，3:1，4:1或5:1。這可以提高檢測的靈敏度。 相反的情況可以在其他實施例子中得以運用。
[0057] 在本發明的一些方式中，在檢測區域中的第一捕獲位點與第二捕獲區域中的第二 捕獲分子的結合可以是直接的結合，而不通過媒介。在一個優選的方式中，第二捕獲位點 和第二捕獲分子為結合對的2個半，其中，"結合對"為上述所描述的哪些。其中所述的結 合對選自如下的結合對：抗原和抗體或者他們的結合片段；生物素和親和素，鏈霉親和，中 性或凱普親和素；免疫球蛋白（或者片段）和蛋白A或G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸 序列互補的序列；配體和受體分子；激素和激素結合蛋白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和 酶；纖維素結合區域和纖維素纖維；固定的氨基苯基硼酸和順式-二醇軸承分子；葡聚糖和 纖維素纖維和他們的類似物，衍生物以及片段。
[0058] 在一個優選的方式中，結合對包括生物素和鏈球菌親和素。在一個優選的方式中， 指示分子的第二捕獲位點包括一表位和第二捕獲分子包括抗體，其中該抗體特異結合位于 第二捕獲位點上的表位。術語抗體包括前述定義的任何抗體。
[0059] 在某些方式中，指示分子的第二捕獲位點與裝置的第二捕獲分子的結合可以是間 接的，例如，通過可以同時結合指示分子的第二捕獲位點和第二捕獲分子的適配體作為媒 介進行結合。其中，指示分子向第二捕獲分子的結合是間接的和通過一適配體進行媒介的， 它可能是多個裂解的指示分子結合到每一個捕獲分子上。在一些優選的方式中，指示分子 的檢測區域的第二捕獲位點和第二捕獲分子包括生物素，和媒介間接結合的適配體分子為 多價化合物的鏈球菌親和素或它的派生物。
[0060] 指示分子的檢測區域可以是適合通過本領域知曉的任何方式檢測的任何底物或 者半簇。在一個方式中，檢測區域本身可以包括報告半簇，其中，該報告半簇為在此定義的 任何可以產生信號或信號產物的任何半簇。在一些優選的方式總，報告半簇選自如下的一 些物質金顆粒，染料，發光物質，熒光分子，放射線物質；可見的物質，脂質體，或其他包 括產生信號底物的囊泡物質，電活性物質，或者酶和其底物的混合。被用來作為報告半簇的 合適的酶-底物結合可以是酶為堿性磷酸酶和底物為硝基藍四唑鑰-5-溴-4氯-3-吲哚 基磷酸酉旨（nitro blue tetrazolium-5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl phosphate) 〇 在另一 些優選的方式中，報告半簇為金顆粒。
[0061] 可選的或者前述所有實施方式中，該裝置可以包括一個或多個報告分子，這些分 子能夠被結合到指示分子的檢測區域或者具有結合到指示分子的檢測區域的能力，檢測可 以使用通過報告分子產生的信號進行。在這樣的方式中，報告分子可以在一個特異的"檢測 位點"結合到指示分子的檢測區域上，該特異的位點與存在于檢測區域中的第二捕獲位點 不同和在空間上被間隔開。檢測位點可以包括與第二捕獲位點直接相鄰或靠近的一組殘基 的。可選的，檢測位點可以包括與第二捕獲位點空間上間隔開的不連續的指示分子的部分， 例如通過連接器或間隔子的區域。
[0062] 在該裝置的實施方式中，其中該第二捕獲位點與第二捕獲分子直接結合，這可以 對于與第二捕獲區域空間間隔的檢測位點有利，這樣捕獲同時阻止第二捕獲分子（通過第 二捕獲位點）和報告分子（通過檢測位點）結合到指示分子上。
[0063] 其中，檢測區域包括檢測位點和第二捕獲位點，在該方式中，這些位點可以是相同 的。在這樣的情況下，作為結合到指示分子的第二捕獲位點的結合媒介的第二捕獲分子的 結合半族可以是與作為結合到指示分子的檢測位點結合媒介的任何報告分子的半族相同。 在一個優選的方式中，檢測位點和第二捕獲位點包括同樣的表位，和第二捕獲分子和任何 報告分子包括特異結合該表位的抗體
[0064] 在一些可選的方式中，檢測位點和第二捕獲位點可以是不同的。進一步，盡管檢 測位點和第二捕獲位點兩者都在本發明中被限定為存在于指示分子的"檢測區域"中的事 實，這些兩個位點可以包括或由不同的連接在一起的化學實體組成，這樣形成分子的檢測 區域。例如，第二捕獲位點可以包括第一氨基酸抗原，然而檢測區域可以包括生物素半族。 在優選的方式中，檢測位點包括與存在于第二捕獲位點和第二捕獲位點上任何表位不同的 一表位，和報告分子包括特異結合該表位的抗體。
[0065] 在其他的一些方式中，報告分子可以通過第二捕獲位點結合到指示分子的檢測區 域，假如報告分子向第二捕獲位點的結合不會消弱在裝置的第二捕獲區域中的第二捕獲位 點向第二捕獲分子結合的能力。
[0066] 本發明的報告分子可以包括任何可以為了檢測目的的產生信號的報告半族。在一 些優選的方式中，報告半族選自如下的一些物質金顆粒，染料，發光物質，熒光分子，放 射線物質；可見的物質，脂質體，或其他包括產生信號底物的囊泡物質，電活性物質，或者酶 和其底物的混合。
[0067] 報告分子向指示分子的結合可以是間接的和通過能夠同時結合檢測區域和報告 分子的適配子作用結合的媒介。
[0068] 在本發明的一些實施方式中，其中，報告分子結合到指示分子是通過適配分子實 現的，該適配子可以在檢測樣本添加到指示分子之前與檢測區域形成復合體，假如適配分 子不會阻止指示分子的裂解。
[0069] 適配子可以是能夠媒介與指示分子的檢測區域和報告分子之間的任何材料或分 子。在一些優選的方式中，適配子為鏈球菌親和素和檢測區域包括生物素。適配子可以是 "適配子結合對"，其中，所述的結合對包括：
[0070] (i)能夠結合指示分子的檢測區域的第一成員；和
[0071] (ii)把結合對中的第一成員向報告分子結合的第二成員。在一些優選的方式中， 指示分子的檢測區域包括生物素，結合對的第一成員為親和素或鏈球菌親和素，結合對的 第一成員為生物素；報告分子包括結合生物素的半族。
[0072] 適配分子或者適配子結合對的內含物可以推動多個報告分子向每一個指示分子 的結合。例如，使用多個鏈球菌親和素作為適配子可以允許帶有指示分子的生物素和帶有 報告分子的生物素兩者同時結合。
[0073] 在本發明的一些實施方式中，其中，報告分子結合到指示分子的檢測區域是通過 適配子或者適配結合對實現的，這些相同的適配子或者適配子結合對可以讓裝置中的第二 捕獲區域中的第二捕獲分子間接地與第二捕獲位點結合。
[0074] 在一些有選的方式中，指示分子的第二捕獲位點包括生物素和結合適配子包括鏈 球菌親和素。該鏈球菌親和素作為同時結合帶有報告分子的生物素和包括生物素的第二捕 獲分子的結合媒介。這樣，同樣的適配子表現出三通的結合來把指示分子的檢測區域與報 告分子和裝置中的第二捕獲區域中的第二捕獲分子同時連接。
[0075] 為了讓裝置作為設定的功能，第一捕獲區域必須與第二捕獲區域在空間上間隔 開。這種間隔必須是這樣，從而允許與指示分子混合的測試樣本首先與第一捕獲區域中的 第一捕獲分子接觸，然后才與第二捕獲區域中的第二捕獲分子接觸。在一個方式中，第一捕 獲區域和第二捕獲區域可以在分析測試盒子中不同的組件組成，從而要求通過使用者的手 工把測試樣本從一個組件轉移到另一組件。第一捕獲區域和第二捕獲區域可以是位于分隔 的固體支持上，例如，在不同的物理位置的分隔的欄或珠子上。
[0076] 在一個優選的實施方式中，裝置被設置為流動裝置，和第一和第二捕獲區域沿著 層析介質方向存在于連續的位置上。層析介質可以是安裝在固定支持體上。在一個優選的 方式中，裝置可以被設置在橫向流動裝置中，但是也可以例如作為垂直流動的裝置。該裝置 可以表現為一些實施例子中的試劑條的形式。
[0077] 第一捕獲區域可以通過結合任何完整的指示分子的第一捕獲位點的第一捕獲分 子被固定設定在其上或其中的形式來限定，和在這樣的方式中，指示分子的裂解的片段包 含有完整的第一捕獲位點。第二捕獲區域可以通過結合任何指示分子的裂解片段的第一捕 獲分子被固定設定在其上或其中的形式來限定，其中指示分子包括檢測區域，如果存在。固 定第一捕獲分子和/或第二捕獲分子的方式可以是任何的方式。其中，該裝置為流體裝置 包括層析介質，捕獲區域可以通過直接結合到層析介質或通過轉運蛋白間接的固定在層析 介質上。
[0078] 檢測樣本可以施加到位于第一捕獲區域上游的層析介質上，通過介質的拉動，例 如毛細作用力，讓測試樣本通過第一捕獲區域然后到第二捕獲區域。這樣的層析介質可以 是任何材料構成，流體能夠通過，例如流體通道或者多孔膜。在一個優選的方式中，層析介 質包括硝酸纖維素膜試劑條或硝酸纖維素膜。
[0079] 如上的描述，裝置包括能夠結合指示分子的檢測區域的報告分子，該裝置還可以 進一步包括含有第三捕獲分子的第三捕獲區域。第三捕獲區域與第一和第二捕獲區域空間 間隔開。
[0080] 在一些方式中，第三捕獲區域中的第三捕獲分子可以結合任何沒有結合到指示分 子或指示分子片段上的報告分子。在一些優選的方式中，第三捕獲分子可以是識別報告分 子表位的抗體，其中該表位與指示分子上的任何表位是不同的。結合到第三捕獲區域中的 第三捕獲分子的報告分子的檢測可以用來測試裝置中報告分子的功能的存在。
[0081] 在另一些方式中，除了報告分子外，裝置可以包括一個或多個"報告控制分子"。代 表性的，報告控制分子將包括與報告分子同樣的報告半族，但是并不結合指示分子的檢測 區域。這樣的報告控制分子可以被用來間接的評估裝置中的報告分子的存在和或功能。在 這樣的情況下，該裝置可以包括與第一和第二捕獲區域空間間隔開的第三捕獲區域，其包 括第三捕獲分子，其中第三捕獲分子能夠結合報告控制分子，如果存在。在優選的方式中， 第三捕獲分子為能夠識別報告控制分子上的表位的抗體，其中該表位于指示分子和報告分 子的表位不同。在第三捕獲區域上對結合到第三捕獲分子上的報告控制分子的檢測可以被 用來間接的評估裝置中的報告分子的存在或和工能。
[0082] 酶檢測裝置可以被用來檢測或測量測試樣本中能夠裂解底物的酶的活性的存在。 這樣，根據本發明的第三個方面，用于檢測測試樣本中具有裂解底物的酶的方法，該方法包 括以下步驟：
[0083] (i)提供一種酶檢測裝置，該裝置包括：
[0084] 用于加入樣本中的指示分子，該指示分子包括：
[0085] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0086] (b)第一捕獲位點；和
[0087] (C)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0088] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放；
[0089] 用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的第一 捕獲位點的第一捕獲分子，但并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解片段，和
[0090] 用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕獲區域 包括能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第一捕獲 區域處于空間上的分離；
[0091] (ii)提供測試樣本；
[0092] (iii)向測試樣本施加所述裝置的指示分子，在一定條件下，如果酶存在，該酶能 夠裂解底物的區域；
[0093] (iv)讓測試樣本與檢測裝置的第一捕獲區域接觸，從而讓完整無缺的指示分子， 如果存在，與在第一捕獲區域中的第一捕獲分子結合，和其中，指示分子與第一捕獲分子的 結合實質防止任何隨后被該酶引起的指示分子的裂解位點的裂解；
[0094] (V)讓測試樣本與檢測裝置的第二捕獲區域接觸，從而讓包括有檢測區域的裂解 指示分子的任何片段通過第二捕獲位點被第二捕獲分子結合；和
[0095] (Vi)在第二捕獲區域中通過檢測區域，檢測包括有檢測區域的裂解指示分子的片 段的存在、不存在或水平來確定測試樣本中酶的存在。
[0096] 上述的方法中涉及的酶檢測裝置在別的地方已經詳細描述過了。所有關于酶檢測 裝置的實施方式和本發明的指示分子依據本發明的方法都可以被采用，因此為了簡便再次 不在重復贅述。
[0097] 在本發明的方法中，要求另外裝置中的指示分子加入到測試樣本中，在一定條件 下，酶，如果存在，裂解底物區域。這種條件依據感興趣的酶測量而實施，這種條件包括多種 變化的參數，例如指示分子和測試樣本孵育的時間，溫度和PH.進一步，這些標間可以調節 從而影響測試的靈敏度；例如，長時間的孵育可以增加測試樣本中被裂解分子的數量。在某 些方式中，本發明的裝置和方法可以被用來優化某些酶測試的條件。
[0098] 添加到測試樣本中的指示分子的數量或濃度可以依據被測試酶的不同而變化。足 夠的指示分子被添加到測試樣本中，這樣酶的底物過量存在。
[0099] 在把測試樣本和指示分子與裝置的第一捕獲分子接觸前，讓指示分子與測試樣本 孵育是本發明的裝置的一個重要的功能。在一個方式中，指示分子存在于被用來收集測試 樣本的裝置中。
[0100] 一但指示分子被暴露到第一捕獲分子和被結合后，通過指示分子的裂解位點的裂 解就被實質阻止。進一步，在上面已經討論過，在一個優選的方式中，指示分子通過第一捕 獲位點具有高親和性結合到第一捕獲分子。特別的，優選的，對于第一捕獲分子具有更高的 親和力系數GO，對于指示分子具有更低的親和力系數（k d)，對于指示分子多對應的酶來 講。共同作用，一旦測試樣本與第一捕獲區域中的第一捕獲分子接觸，這些特征幫助確認沒 有進一步的指示分子的酶的裂解。這樣，本發明的裝置可以被用來進行可靠的終點測試。 [0101] 通過實行本發明的方法獲得的測試結果也被存在于第一捕獲區域的第一捕獲分 子的數量和添加到測試樣本中的指示分子的數量之間的關系所影響。在一個方式中，在第 一捕獲區域中存在足夠的第一捕獲分子來捕獲測試樣本中所有數量的指示分子，在第一捕 獲區域中沒有酶的裂解發生。第一捕獲分子的數量要求可以捕獲所有的指示分子，或者在 裝置的第一捕獲區域中，可以充滿所有第一捕獲分子的結合位點的指示分子的數量可以容 易被實驗所測量。
[0102] 如果比試劑需要捕獲所有指示分子的第一捕獲分子的數量要少，在第一捕獲區域 中任何沒有被結合或者"自由"的指示分子可能被轉移到第二捕獲區域。如果在第二區域 進行檢測，存在與第二捕獲區域的指示分子會引起假陽性的結果。然而，因為分析靈敏度的 要求，一定程度的指示分子"遺漏"到第二捕獲區域是可以容忍的。進一步講，這種"遺漏" 可以通過合適的控制反應被測量和被計算。
[0103] 在某些情況下，其中多個指示分子可以結合到每一個捕獲分子上，例如，分子之間 的結合可以是間接的或者通過適配子進行結合，可以在第一捕獲區域包括少量的第一捕獲 分子和通過最少的完整指示分子"遺漏"到第二檢測區域可以保持高水平的靈敏度。
[0104] 位于裝置的第一捕獲區域的第一捕獲分子的主要功能就是攔截任何完整的指示 分子。向第一捕獲分子結合指示分子的結合被指示分子上的第一捕獲位點所媒介。如果指 示分子被裂解，含有第一捕獲位點的任何片段任然結合到第一捕獲分子，然而，在某些實施 方式中，指示分子的裂解可以導致第一捕獲位點的破壞，這樣只有完整的指示分子能夠結 合到第一捕獲分子上。
[0105] 為了攔截指示分子，任何可能的被裂解的片段定位在第一捕獲位點，第一捕獲分 子必須定位于第一捕獲區域，這樣他們不會隨著測試樣本被轉移到第二捕獲區域中。定位 可以通過把第一捕獲分子結合到固體支持上而實現。在一個優選的方式中，裝置為流體裝 置，第一捕獲分子在沿著層析介質的縱軸以不連續的位置被固定。第一捕獲分子的固定可 以通過本領域的現有任何核實的方式進行固定。
[0106] 當測試樣本被引入與第一捕獲區域接觸，和任何完整的指示分子，如果存在，被結 合到第一捕獲分子上后，測試樣本隨后被轉移到第二捕獲區域。如果被檢測的酶存在測試 樣本中和也因此裂解了指示分子，包括有檢測區域的指示分子的片段將會被轉移到該區 域。這些片段通過檢測區域里的第二捕獲位點結合到該區域的第二捕獲分子上而被定位或 保留在第二捕獲區域上。定位可以通過把第二捕獲分子結合到固體支持上而實現。在一個 優選的方式中，裝置為流體裝置，第二捕獲分子在沿著層析介質的縱軸以不連續的位置被 固定。第二捕獲分子的固定可以通過本領域的現有任何核實的方式進行固定。
[0107] 這樣，通過檢測區域，位于第二捕獲區域中的任何包括有檢測區域的指示分子的 裂解的片段的水平或存在的測量，酶的活性可以被確定。更特別地，如果在第二測試區域有 信號的產生，酶的活性就存在測試樣本中。
[0108] 在本發明的一些實施方式中，該方法涉及同時對位于第一捕獲區域中的任何完整 的指示分子和位于第二捕獲區域中的含有檢測區域的指示分子的任何裂解片段的測量。鑒 于在一個或其他這些位點存在的指示分子，一個相反的關系存在于在第一捕獲區域的信號 和在第二捕獲區域上的信號之間。進一步，如果與指示分子相關的報告分子的信號的產生 存在于第一捕獲區域，而在第二捕獲區域中沒有信號被檢測，這表明沒有酶存在于測試樣 本中。
[0109] 因此，指示分子或被裂解片段的檢測可以通過存在于檢測區域的報告半族來進行 檢測。如上面的詳細描述，所述的報告半族可以是任何信號產生半族，依據報告物質的屬 性，測量或檢測信號的方式可以采用任何本領域知曉的方式進行，例如低功率的視覺檢測 器，顯微鏡或者使用與計算機連接的光電倍增器。
[0110] 在本發明的一個優選的方式中，完整指示分子或指示分子的裂解片段的檢測可以 通過兩外能夠結合到檢測區域的報告分子來實現。所述的報告分子可以以上描述的任何形 式和可以是以上描述的任何方式與指示分子的檢測區域連接。
[0111] 在一些方式中，檢測可以使用分開的報告分子來執行，所述的報告分子可以在另 外的指示分子加入到測試樣本前被加入到指示分子上。優選的，在這種條件下，報告分子不 會影響酶對指示分子的裂解。可選的，指示分子可以在沒有報告分子存在的情況下被加入 到測試樣本中，報告分子在測試樣本暴露給裝置的第一捕獲區域的第一捕獲分子的時候或 者被添加或存在。在進一步的方式中，在含有指示分子的測試樣本已經被暴露給第一捕獲 區域中的第一捕獲分子和第二捕獲區域中的第二捕獲分子之后，報告分子被添加。
[0112] 如前所述，在一個優選的方式中，該裝置被設置為流體裝置，沿著層析介質不連續 的設置的第一捕獲區域和第二捕獲區域。測試樣本可以暴露給位于第一捕獲區域的上游位 點的層析介質上，例如，樣本接收區域。這個位點或者區域可以通過存在用于施加樣本的樣 本墊。在一些方式中，樣本墊可以執行血液分離的功能，某些測試樣本的物質，例如一個或 多個類似的血細胞，可以被保留在樣本墊的材料中，從而阻止他們進入層析介質。
[0113] 在把測試樣本施加在樣本接收區域之后，樣本可以流過第一捕獲區域和進入第二 捕獲區域。樣本施加區域可以與第一捕獲區域分隔開，例如通過可溶解的柵欄分隔，這樣， 在樣本流入第一捕獲區域前，帶有指示分子的測試樣本與層析介質接觸一段時間，例如硝 酸纖維試劑條。層析介質也可以附著位于選擇性的捕獲區域和檢測區域下游的吸收墊。這 可以作為一個吸收池來加速測試樣本通過測性介質上的區域。
[0114] 報告分子可以在測試樣本已經被允許通過或經過介質之后被添加在層析介質上。 在一個優選的方式中，在測試樣本被施加到介質上的時候，報告分子可以提前以干的形式 被附著在層析介質上。一旦測試樣本已經離開一段時間并穿過第一捕獲區域和第二捕獲區 域，報告分子可以被再溶解，例如被另外的合適的緩沖液，從而被允許流過層析介質，這樣， 任何結合的指示分子，或者指示分子的片段被后來的報告分子結合。
[0115] 如上面的描述，本發明的裝置可以另外包括含有第三捕獲分子的第三檢測區域。 在一些實施方式中，該第三捕獲分子可以結合哪些沒有結合指示分子或指示分子片段的報 告分子。其中，這樣的裝置被使用的時候，該方法可以被用來另外檢測在第三捕獲區域中結 合到第三捕獲分子上的任何報告分子的存在。
[0116] 在一些實施方式中，其中報告分子被用來測試指不分子的存在，該裝置包括報告 控制分子，如上面的描述。這樣的報告控制分子可以在報告分子被加入到裝置的同時也被 加入到裝置中。其中，該裝置為流體裝置，在測試樣本施加到介質上的時候，該裝置包含提 前以干的形式存在層析介質上的報告分子和報告控制分子。例如，使用適當的緩沖溶液，重 新溶解報告分子，也可以同時溶解報告控制分子。在這樣的情況下，該裝置可以也包括含有 能夠結合報告控制分子的第三捕獲分子的第三檢測區域。其中，這樣的裝置被使用的時候， 本發明的方法可以用來在第三捕獲區域中另外測試結合到第三捕獲分子的報告分子的存 在。該"控制"的測試結果對于間接確定報告分子存在于裝置中和或其功能是非常重要的。
[0117] 其中，該裝置可以被設置為保留在塑料殼中的流體裝置，該裝置包括層析介質，第 一和第二捕獲區域和可選性的第三檢測區域或捕獲區域，通過這樣的設置，固定在不同區 域的報告分子可以被檢測到。例如，塑料殼可以包含窗口，允許結合在第一，第二或和第三 捕獲區域上的報告分子產生的信號通過該窗口被讀取。在一些方式中，塑料殼可以隱藏第 一捕獲區域，這樣僅僅結合在第二和可選的第三區域上的報告分子能夠被檢測到（通過信 號的檢測）。這樣的好處就是終端使用者看到陽性結果線條就認為酶的存在（在第二捕獲 位點）。
[0118] 如果一個適配子被用來媒介以下任何（一個或多個）物質之間的作用：
[0119] (i)向第一捕獲分子結合指示分子的第一捕獲位點；
[0120] (ii)向第二捕獲分子結合指示分子的第二捕獲位點；和或
[0121] (iii)向指示分子的檢測區域結合報告分子；該適配子可以在另外的指示分子被 加入到測試樣本之前被加入到指示分子上；例如，他可以提前與指示分子形成復合物。可選 的，在含有指示分子的測試樣本被暴露給裝置的第一捕獲區域的第一捕獲分子的同時或者 在含有指示分子的測試樣本被暴露給裝置的第一捕獲區域的第一捕獲分子和第二捕獲區 域的第二捕獲分子之后（適當的），適配子被加入到裝置中。
[0122] 與本發明的裝置結合使用的方法可以被用來執行測試樣本中酶活性的定性檢測。 進一步，該方法也可以執行兩個或多個樣本中的酶活性水平的定量或比較分析。
[0123] 因此，根據本發明的另一個方面，本發明提供，相對于另外一個或多個樣本中所述 酶活性的量，用于檢測第一測試樣本中具有裂解底物的酶活性的量的方法包括以下步驟：
[0124] (i)提供一種酶檢測裝置，該裝置包括：
[0125] 用于加入樣本中的指示分子，該指示分子包括：
[0126] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0127] (b)第一捕獲位點；和
[0128] (C)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0129] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放；
[0130] 用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的第一 捕獲位點的第一捕獲分子，但該第一捕獲分子并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解 片段，和
[0131] 用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕獲區域 包括能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第一捕獲 區域處于空間上的分離；
[0132] (ii)提供第一測試樣本；
[0133] (iii)向第一測試樣本施加所述裝置的指示分子，在一定條件下，如果酶存在，該 酶能夠裂解底物的區域；
[0134] (iv)讓第一測試樣本與檢測裝置的第一捕獲區域接觸，從而讓完整無缺的指示分 子，如果存在，與在第一捕獲區域中的第一捕獲分子結合，和其中，指示分子與第一捕獲分 子的結合實質防止任何隨后被該酶引起的指示分子的裂解位點的裂解；
[0135] (V)讓第一測試樣本與檢測裝置的第二捕獲區域接觸，從而讓包括有檢測區域的 裂解指示分子的任何片段通過第二捕獲位點被第二捕獲分子結合；和
[0136] (Vi)檢測包括有檢測區域的裂解指示分子的片段的存在、不存在或水平來確定第 一測試樣本中酶的存在；
[0137] (Vii)對另外的一個或多個樣本重復（i)到（vi)的步驟；
[0138] (Viii)把從第一樣本中獲得水平與另外的一個或多個樣本獲得的水平進行比較， 從而確定在每一個樣本中酶的相對水平。
[0139] 本發明先前描述所有的實施方式，例如酶檢測裝置，指示分子和檢測測試樣本中 具有裂解底物的酶的活性的存在，以及另外的一些方法再次不在重復描述。
[0140] 在本發明的這個方面，基于兩個或多個測試樣本的比較，使用酶檢測裝置的方法 和對應的指示分子來測試多個測試樣本酶裂解活性的相對數量。特別的，該方法要求檢測 在第一捕獲區域中的完整指示分子的存在和水平；和，采用任何合適的方式檢測第二捕獲 區域中的裂解的指示分子的存在和水平。如先所述，在這些值中存在相反的關系，和在優選 的方式中，這些值的比率可以被計算出。使用一個測試樣本獲得的值與采用同樣的方法使 用一個或多個測試樣本獲得的值進行比較。從這些比較，在各自測試樣中相對的裂解活性 酶的數量可以被本領域的一般方法所確定。例如，在第二捕獲區域上的信號與第一捕獲區 域上的信號的更高的比率表示測試樣本中更高水平的酶的活性。
[0141] 這些本發明采用的方法的比較分析方法可以有多種使用目的。第一，測量兩個樣 本或多個樣本之間相對酶活性的水平可以被間接用來測量不同測試樣本之間的相對酶的 總的數量。對于這樣，目前的方法可以首先對含有已知數量酶的系列樣本進行測量。這樣 的測試結果可以作為標準曲線，或對照表或相對于酶濃度的酶活性圖。另外含有未知量的 酶的測試樣本可以基于從表述曲線，對照表或相對酶濃度的酶活性圖從而被測試，在測試 樣本中酶的絕對數量被測試出。
[0142] 在本方法的另一個運用，就是兩個樣本的相對酶活性比較，例如一個控制樣本和 實驗樣本，可以被用來評估潛在的調節，例如酶活性的抑制因子。
[0143] 本發明可以依據以下權利要求進行進一步的理解。
[0144] 1.用于測試樣本中具有裂解底物的酶的裂解活性存在的酶檢測裝置，該裝置包 括：
[0145] (i)用于加入樣本中的指示分子，該指示分子包括：
[0146] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0147] (b)第一捕獲位點；和
[0148] (C)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0149] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放；
[0150] (ii)用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的 第一捕獲位點的第一捕獲分子，但并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解片段，和其 中，通過第一捕獲位點的結合，指示分子被捕獲到第一捕獲分子上從而實質防止任何隨后 被該酶引起的裂解位點的裂解；和
[0151] (iii)用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕 獲區域包括能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第 一捕獲區域處于空間上的分離；和其中，在檢測區域對通過第二捕獲位點被結合到第二捕 獲分子上的任何被裂解的指示分子的檢測，表示測試樣本中酶裂解活性的存在。
[0152] 2.根據權利要求1所述的裝置，其中裂解位點位于指示分子的底物區域中，和所 述的底物區域包括多肽，蛋白，碳水化合物，脂質或核酸。
[0153] 3.根據權利要求2所述的裝置，其中，第一捕獲位點位于底物區域中。
[0154] 4.根據權利要求1-3所述的裝置，其中被檢測的酶選自如下種類：氧化還原酶；水 解酶和裂解酶，和包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神經氨酸苷 酶，唾液酸苷酶、脂酶，脫氧核糖核酸酶（DNAse)和核糖核酸酶（RNAse)的亞種。
[0155] 5.根據權利要求1所述的裝置，其中，被檢測的酶為金屬蛋白酶或者人類衍生的 中性粒細胞彈性蛋白酶。
[0156] 6.根據權利要求1-5之一所述的裝置，其中，指示分子包括多個裂解位點，和其中 在任何一個裂解位點的裂解引起包括有檢測區域的指示分子的片段的釋放。
[0157] 7.根據權利要求6所述的裝置，其中，被不同的能夠裂解底物的酶識別的裂解位 點與指示分子合并。
[0158] 8.根據權利要求1-7所述的裝置，其中，指示分子的第一捕獲位點與裝置的第一 捕獲區域中的第一捕獲分子直接結合。
[0159] 9.根據權利要求8所述的裝置，其中，存在于裝置中的指示分子的第一捕獲位點 和第一捕獲區域中的第一捕獲分子為結合對中的兩半，其中所述的結合對選自如下的結合 對：抗原和抗體或者他們的結合片段；生物素和親和素，鏈霉親和，中性或凱普親和素；免 疫球蛋白（或者片段）和蛋白A或G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸序列互補的序列；配 體和受體分子；激素和激素結合蛋白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素結合區域 和纖維素纖維；固定的氨基苯基硼酸和順式-二醇軸承分子；葡聚糖和纖維素纖維和他們 的類似物，衍生物以及片段。
[0160] 10.根據權利要求9所述的裝置，其中結合對位生物素和鏈球菌親和素。
[0161] 11.根據權利要求9所述的裝置，其中指示分子的第一捕獲位點包括一表位和第 一捕獲分子包括特異結合該表位的抗體。
[0162] 12.根據權利要求1-6所述的裝置，其中，第一捕獲分子與指示分子的第一捕獲 位點的結合為間接結合，和通過可以同時結合第一捕獲位點和第一捕獲分子的適配子所媒 介。
[0163] 13.根據權利要求1-12之一所述的裝置，其中，多數的指示分子可以結合每一個 第一結合分子。
[0164] 14.根據權利要求1-13所述的裝置，其中，裝置中的第一捕獲區域中的第二捕獲 分子與指示分子的第二捕獲位點的結合為直接結合。
[0165] 15.根據權利要求14所述的裝置，其中，指示分子的第二捕獲位點和第二捕獲分 子為結合對中的兩半，其中所述的結合對選自如下的結合對：抗原和抗體或者他們的結合 片段；生物素和親和素，鏈霉親和，中性或凱普親和素；免疫球蛋白（或者片段）和蛋白A或 G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸序列互補的序列；配體和受體分子；激素和激素結合蛋 白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素結合區域和纖維素纖維；固定的氨基苯基硼 酸和順式-二醇軸承分子；葡聚糖和纖維素纖維和他們的類似物，衍生物以及片段。
[0166] 16.根據權利要求15所述的裝置，其中結合對位生物素和鏈球菌親和素。
[0167] 17.根據權利要求15所述的裝置，其中指示分子的第二捕獲位點包括與第一結合 位點表位不同的表位，和第二捕獲分子包括特異結合該表位的抗體或抗原結合片段。
[0168] 18.根據權利要求1-17之一所述的裝置，其中，指示分子的檢測區域包括報告半 族。
[0169] 19.根據權利要求18所述的裝置，其中，報告半族包括選自如下的報告半族：金顆 粒；染料；發光物質；熒光分子；放射性物質；可見物質；脂質體或其他包括信號產生底物 的囊；電子活化粒子或者酶其底物的組合。
[0170] 20.根據權利要求18所述的裝置，其中，報告半族為顆粒。
[0171] 21.根據權利要求1-17所述的裝置，其中，另外包括報告分子，該報告分子能夠結 合到指示分子的檢測區域上或已經被結合到指示分子的檢測區域上。
[0172] 22.根據權利要求21所述的裝置，其中，指示分子的檢測區域包括與第二捕獲位 點不同的，間隔開的檢測位點，和報告分子通過檢測位點結合到檢測區域上。
[0173] 23.根據權利要求22所述的裝置，其中檢測位點包括與第一結合位點和第二結合 位點任何表位不同的表位，和報告分子包括特異結合該表位的抗體。
[0174] 24.根據權利要求21所述的裝置，其中，報告分子通過第二捕獲位點結合到檢測 區域上，其中，報告分子與第二捕獲位點的結合不會消弱第二捕獲位點結合到第二捕獲分 子的結合能力。
[0175] 25.根據權利要求21-24所述的裝置，其中，報告半族包括選自如下的報告半族： 金顆粒；染料；發光物質；熒光分子；放射性物質；可見物質；脂質體或其他包括信號產生 底物的囊；電子活化粒子或者酶其底物的組合。
[0176] 26.根據權利要求21-25所述的裝置，其中，報告分子與檢測區域的結合為間接結 合，和通過可以同時結合報告分子和檢測區域的適配子所媒介。
[0177] 27.根據權利要求26所述的裝置，其中，在另外的測試樣本施加到指示分子中之 前，適配子被提前與檢測區域形成復合物。
[0178] 28.根據權利要求26或27所述的裝置，其中，適配子為鏈球菌親和素和檢測區域 包括生物素。
[0179] 29.根據權利要求26或27所述的裝置，其中，適配子為適配子結合對，所述的結合 對包括：能夠結合指示分子的檢測區域的第一成員和能夠結合到結合對的第一成員和報告 分子上的第二成員。
[0180] 30.根據權利要求29所述的裝置，其中，指示分子的檢測區域包括生物素，適配子 結合對的第一成員為親和素或鏈球菌親和素，適配子結合對的第二成員為生物素，和報告 分子包括可以結合生物素的半族。
[0181] 31.根據權利要求21-30所述的裝置，其中，多個報告分子可以結合到每一個指示 分子上。
[0182] 32.根據權利要求26-31所述的裝置，其中，該適配子與指示分子的檢測區域中的 第二捕獲位點結合，從而第二捕獲位點被存在于裝置的第二捕獲區域中的第二捕獲分子通 過該適配子間接結合。
[0183] 33.根據權利要求32所述的裝置，其中，該適配子為鏈球菌親和素和第二捕獲分 子為生物素。
[0184] 34.根據權利要求1-33之一所述的裝置，其中，該裝置為流體裝置，和第一捕獲區 域和第二捕獲區域沿著色層介質以連續的位置存在。
[0185] 35.在用于如權利要求1-34所述的酶檢測裝置中的指示分子。
[0186] 36.在用于檢測測試樣本中具有裂解底物的酶的裂解活性存在的指示分子，該指 示分子包括：
[0187] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0188] (b)第一捕獲位點；和
[0189] (c)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0190] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放。
[0191] 37.根據權利要求36所述的指示分子，其中，第一捕獲位點包括一個或多個結合 對，和可以被用來固定指示分子和/或指示分子的片段，該片段在一個位點包括第一捕獲 位點，該位點包括結合對的第二半。
[0192] 38.根據權利要求37所述的裝置，其中所述的結合對選自如下的結合對：
[0193] -抗原和抗體或者他們的結合片段；生物素和親和素，鏈霉親和素，中性或凱普親 和素；免疫球蛋白（或者片段）和蛋白A或G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸序列互補的 序列；配體和受體分子；激素和激素結合蛋白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素 結合區域和纖維素纖維；固定的氨基苯基硼酸和順式-二醇軸承分子；葡聚糖和纖維素纖 維和他們的類似物，衍生物以及片段。
[0194] 39.根據權利要求37所述的裝置，其中，結合對為生物素和鏈球菌親和素。
[0195] 40.根據權利要求37所述的裝置，其中，指示分子的第一捕獲位點包括能夠被抗 體或抗體的衍生物識別的表位。
[0196] 41.根據權利要求37-40所述的指示分子，其中，第二捕獲位點包括一個或多個結 合對，和可以被用來固定指示分子和/或指示分子的片段，該片段在一個位點包括第二捕 獲位點，該位點包括結合對的第一半。
[0197] 42.根據權利要求41所述的裝置，其中所述的結合對選自如下的結合對：
[0198] -抗原和抗體或者他們的結合片段；生物素和親和素，鏈霉親和素，中性或凱普親 和素；免疫球蛋白（或者片段）和蛋白A或G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸序列互補的 序列；配體和受體分子；激素和激素結合蛋白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素 結合區域和纖維素纖維；固定的氨基苯基硼酸和順式-二醇軸承分子；葡聚糖和纖維素纖 維和他們的類似物，衍生物以及片段。
[0199] 43.根據權利要求41所述的裝置，其中，結合對為生物素和鏈球菌親和素。
[0200] 44.根據權利要求41所述的裝置，其中，指示分子的第二捕獲位點包括能夠被抗 體或抗體的衍生物識別的表位。
[0201] 45.用于檢測測試樣本中具有裂解底物的酶的方法，該方法包括以下步驟：
[0202] (i)提供一種酶檢測裝置，該裝置包括：
[0203] 用于加入樣本中的指示分子，該指示分子包括：
[0204] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0205] (b)第一捕獲位點；和
[0206] (C)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0207] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放；
[0208] 用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的第一 捕獲位點的第一捕獲分子，但并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解片段，和
[0209] 用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕獲區域 包括能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第一捕獲 區域處于空間上的分離；
[0210] (ii)提供測試樣本；
[0211] (iii)向測試樣本施加所述裝置的指示分子，在一定條件下，如果酶存在，該酶能 夠裂解底物的區域；
[0212] (iv)讓測試樣本與檢測裝置的第一捕獲區域接觸，從而讓完整無缺的指示分子， 如果存在，與在第一捕獲區域中的第一捕獲分子結合，和其中，指示分子與第一捕獲分子的 結合實質防止任何隨后被該酶引起的指示分子的裂解位點的裂解；
[0213] (V)讓測試樣本與檢測裝置的第二捕獲區域接觸，從而讓包括有檢測區域的裂解 指示分子的任何片段通過第二捕獲位點被第二捕獲分子結合；和
[0214] (Vi)檢測包括有檢測區域的裂解指示分子的片段的存在、不存在或水平來確定測 試樣本中酶的存在。
[0215] 46.根據權利要求45所述的方法，其中該酶檢測裝置為權利要求1-33之一所述的 酶檢測裝置。
[0216] 47.根據權利要求45或46所述的方法，其中，完整指示分子的檢測或存在于第二 捕獲區域的指示分子裂解片段的檢測通過存在于檢測區域中的報告半族實現的。
[0217] 48.根據權利要求45或46所述的方法，其中，完整指示分子的檢測或存在于第二 捕獲區域的指示分子裂解片段的檢測通過存在于檢測區域中的報告分子實現的。
[0218] 49.根據權利要求48所述的方法，其中，在加入測試樣本之前，報告分子被加入到 指示分子上。
[0219] 50.根據權利要求48所述的方法，其中，在裝置的第一捕獲區域中，報告分子被加 入到指示分子上。
[0220] 51.根據權利要求45-50之一所述的方法，其中，位于第二捕獲區域中的指示分子 的裂解片段上結合的報告分子的存在表示能夠裂解指示分子的裂解位點的酶存在于測試 樣本中。
[0221] 52.根據權利要求45-50之一所述的方法，其中，位于第一捕獲區域中但不在第二 捕獲區域中的報告分子的存在表不沒有酶存在于測試樣本中。
[0222] 53.相對于另外一個或多個樣本中所述酶的量，用于檢測第一測試樣本中具有裂 解底物的酶的量的方法包括以下步驟：
[0223] (i)提供一種酶檢測裝置，該裝置包括：
[0224] 加入樣本中的指示分子，該指示分子包括：
[0225] (a)裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解；
[0226] (b)第一捕獲位點；和
[0227] (C)包括第二捕獲位點的檢測區域：
[0228] 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放；
[0229] 用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的第一 捕獲位點的第一捕獲分子，但該第一捕獲分子并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解 片段，和
[0230] 用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕獲區域 包括能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第一捕獲 區域處于空間上的分離；
[0231] (ii)提供第一測試樣本；
[0232] (iii)向第一測試樣本施加所述裝置的指示分子，在一定條件下，如果酶存在，該 酶能夠裂解底物的區域；
[0233] (iv)讓第一測試樣本與檢測裝置的第一捕獲區域接觸，從而讓完整無缺的指示分 子，如果存在，與在第一捕獲區域中的第一捕獲分子結合，和其中，指示分子與第一捕獲分 子的結合實質防止任何隨后被該酶引起的指示分子的裂解位點的裂解；
[0234] (V)讓第一測試樣本與檢測裝置的第二捕獲區域接觸，從而讓包括有檢測區域的 裂解指示分子的任何片段通過第二捕獲位點被第二捕獲分子結合；和
[0235] (Vi)檢測包括有檢測區域的裂解指示分子的片段的存在、不存在或水平來確定第 一測試樣本中酶的存在；
[0236] (Vii)對另外的一個或多個樣本重復（i)到（vi)的步驟；
[0237] (Viii)把從第一樣本中獲得水平與另外的一個或多個樣本獲得的水平進行比較， 從而確定在每一個樣本中酶的相對水平。
[0238] 54.根據權利要求53所述的方法，其中酶檢測裝置為如權利要求1-34之一所述的 裝置.
[0239] 55.根據權利要求53或54所述的方法，其中，位于第一捕獲區域中的完整指示分 子的檢測或存在于第二捕獲區域的指示分子裂解片段的檢測為通過存在于檢測區域中的 報告半族實現的。
[0240] 56.根據權利要求53或54所述的方法，其中，位于第一捕獲區域中的完整指示分 子的檢測或存在于第二捕獲區域的指示分子裂解片段的檢測為通過存在于檢測區域中的 報告分子實現的。
[0241] 57.根據權利要求53-56所述的方法，其中，至少一個用來做比較的樣本包括已知 數量的酶。
[0242] 58.如權利要求1-34所限定的酶檢測裝置在作為檢測測試樣本中裂解底物的酶 的存在的用途。
[0243] 59. -種如附圖所限定的酶檢測裝置。
[0244] 60.如附圖所限定的檢測測試樣本中能夠裂解底物的酶的存在的方法。
[0245] 61.如附圖所限定的檢測，相對于一個或多個測試樣本酶的數量，第一樣本中能夠 裂解底物的酶的數量的方法。
[0246] 62.如附圖所限定的酶檢測裝置的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0247] 本發明通過以下說明書附圖進行描述。
[0248] 圖1為本發明一個實施例子中的指示分子的結構示意圖。
[0249] 圖2為本發明一個實施例子中采用圖1中的指示分子的酶檢測裝置的結構示意 圖。
[0250] 圖3為本發明第二個實施例子中的指示分子的結構示意圖。
[0251] 圖4為本發明第二個實施例子中采用圖3中的指示分子的酶檢測裝置的結構示意 圖。
[0252] 圖5為本發明第三個實施例子中的指示分子的結構示意圖。
[0253] 圖6為本發明第三個實施例子中采用圖5中的指示分子的酶檢測裝置的結構示意 圖。
[0254] 圖7為采用本發明的裝置檢測陣列金屬蛋白酶-S(MMP-S)活性的結果圖。
[0255] 圖8為采用層析試劑條的酶檢測裝置的結構示意圖。
[0256] 圖9為采用本發明的裝置和實用第一指示分子來檢測陣列金屬蛋白酶-9(MMP_9) 活性的結果圖。
[0257] 圖10為采用本發明的裝置和實用第二指示分子來檢測陣列金屬蛋白 酶-9 (MMP-9)活性的結果圖。
[0258] 圖11為采用本發明的裝置來檢測中性粒細胞彈性蛋白酶（HNE)活性的結果圖
[0259] 圖12為采用本發明的裝置來檢測MM9活性的結果圖，其中指示分子包含1，2, 3, 5 和7個裂解位點。
[0260] 圖13為包含1，2, 3和4裂解位點的指示分子的本發明的裝置來檢測MM9活性的 靈敏度的結果圖。
[0261] 最佳實施方式的詳細描述
[0262] 圖1為本發明一個實施例子中的指示分子的結構示意圖。從顯示的看，指示分子 (1)包括帶有單個裂解位點⑶和第一捕獲切點⑷的底物區域（2).另外，指示分子（1) 具有包括第二捕獲位點的檢測區域（5).在本實施方式中，檢測區域（5)由生物素半族（B) 和從而可以具有結合多個鏈球菌親和素適配子分子￠).在指示分子暴露給假設含有酶的 測試樣本之前（所顯示的），指示分子可以提前與適配子分子（6)形成復合物。可選的，在 發生酶裂解之后，適配子分子可以加入到指示分子（1)上。
[0263] 一旦指示分子（1)被加入到測試樣本中，酶就會特異識別存在的裂解位點（3)，可 以裂解指示分子從而導致分子的第一捕獲位點（4)和檢測區域（5)的分裂。
[0264] 圖2為本發明一個實施例子中的酶檢測裝置的結構示意圖。該裝置包括如圖1描 述的指示分子（1)和層析試劑條（7)，該層次試劑條包括上游的第一捕獲區域（8)和下游的 第二捕獲區域（9)。
[0265] 在顯示的本實施方式中，第一捕獲區域（8)為固定在試劑條（7)的與固體支撐體 固定結合的第一捕獲分子（10)。第二捕獲區域（9)為第二捕獲分子（11)所限定，并且通過 沿著層析試劑條（7)的長縱軸和第二捕獲分子（11)的固定與第一捕獲區域（8)空間間隔 開。
[0266] 在使用的時候，在讓測試樣本接觸裝置的第一捕獲區域（8)之前，向測試樣本添 加指示分子（1)。如圖2所示，指示分子，一旦存在于裝置的第一捕獲區域（8)，通過第一捕 獲位點（4)與裝置中的第一捕獲分子（10)結合。這種結合可以是直接的（顯示）或間接 地，但是無論如何結合，都實質阻止任何隨后測試樣本中的酶引起的任何裂解位點的裂解。 在一個優選的方式中，第一捕獲分子（10)優選的表現出對于指不分子（1)的高親和力，和 特異的，他們之間的親和力大于酶與指示分子（1)的親和力。這樣，一旦存在于測試樣本中 的指示分子（1)與第一捕獲分子接觸，這將會實質上沒有進一步的酶對指示分子（1)的裂 解。
[0267] 第一捕獲分子（10)可以結合任何指示分子（1)和任何含有第一捕獲位點（12)的 被裂解的片段。然而，在這個方式中，裂解位點的裂解破壞了第一捕獲位點，這樣不帶有檢 測區域的指示分子的參加片段就不與第一捕獲區域中的第一捕獲分子結合。
[0268] 在一個優選的實施方式中，該裝置為流體裝置并包括層析試劑條（7)。在本方式 中，測試樣本被施加在位于第一捕獲區域上游的地方，和然后按照箭頭所指的方向沿著測 試條流動，通過毛細作用。這樣，任何在第一捕獲區域（8)沒有被捕獲的裂解的指示分子將 會進入第二捕獲區域（9)。
[0269] 在第二捕獲區域（9)，包括有檢測區域（13)的指示分子的片段通過存在于檢測區 域（5)的第二捕獲位點⑶和存在于第二捕獲區域（9)的第二捕獲分子（11)之間的結合 作用而被定位。
[0270] 如圖2所顯示的實施方式中，指示分子的檢測區域包括生物素半族（B)和被多個 鏈球菌親和素適配子分子（6)結合。鏈球菌親和素適配子（6)作為指示分子的檢測區域 (5)和第二捕獲分子之間的橋梁作用，其包括生物素半族（11)。
[0271] 在當前發明的方法中，指示分子的結合的檢測或者指示分子裂解片段的檢測可以 在兩個捕獲區域或者其中一個捕獲區域中進行檢測，優選的在第二捕獲區域中。檢測可以 通過測量已經存在檢測區域的報告半族所產生的信號實現，后者通過特異結合在檢測區域 的報告分子所產生的信號而實現。
[0272] 在圖2中，報告分子（14)顯示為通過鏈球菌親和素適配子（6)被結合到指示分子 的檢測區域上。該報告分子本身包括媒介結合鏈球菌親和素適配子的生物素半族（15)，以 及金顆粒（16)與所述的生物素半族共軛在一起。可選的的讓報告分子連接到指示分子的 檢測區域在上面有詳細的描述。
[0273] 在該方式中，結合在指示分子（5)的檢測區域上的鏈球菌親和素適配子（6)在第 二捕獲區域起到雙重的作用，他通過特異的生物素半族讓指示分子（1)結合到第二捕獲分 子（11)和報告分子（14)上。
[0274] 圖3顯示了本發明的第二個實施方式中的指示分子。該指示分子（17)包括底物 區（18)，其包括單一的裂解位點（19)和間隔開的含有第一捕獲位點（21)的第一捕獲區域 (20)。另外，指示分子也具有包括檢位點（23)和通過連機器（25)與檢測區域間隔開的第 二捕獲位點（24)的檢測區域（22)。
[0275] 依照以上所有的其他實施方式，一旦本發明的指示分子被加入到測試樣本中，任 何特異識別裂解位點的酶可以裂解該指示分子，從而導致第一捕獲位點（21)和檢測區域 (22)的分離。
[0276] 圖4顯示了與圖2所示相類似的酶檢測裝置，除了圖3中的指示分子。在第二個 優選的實施方式中，主要的不同在于指示分子的檢測區域，其余圖1和圖2中單個實體顯示 相反，該檢測區域包括三個不同的實體：第二捕獲位點（24)，一個不同的檢測位點（23)和 一個間隔兩個位點（25)的連接器。在這種結構中，第二捕獲位點（24)為一個表位和第二 捕獲分子（26)包括特異結合該表位的抗體。進一步，檢測位點為一個不同的表位和報告分 子包括特異結合該不同位點的抗體。在圖4中，報告分子的抗體顯示為與為了檢測目的的 金顆粒（29)共軛。
[0277] 圖5顯示了本發明的本發明的第三個優選的實施方式中的指示分子。該指示分子 (30)包括含有單一的裂解位點（32)和包括有第一捕獲位點（34)的第一捕獲區域（33)的 底物區域（31)。另外，該指示分子包括檢測區域（35)，該檢測區域包括檢測位點（36)和通 過BSA半族（38)與檢測位點間隔的第二捕獲位點）（37)。
[0278] 依照以上所有的其他實施方式，一旦本發明的指示分子被加入到測試樣本中，任 何特異識別裂解位點的酶可以裂解該指示分子，從而導致第一捕獲位點（34)和檢測區域 (35)的分咼。
[0279] 圖6顯示了與圖2和4所示相類似的酶檢測裝置，除了圖5中的指示分子。在第三 個優選的實施方式中，第一捕獲區域（33)，底物區域（31)和檢測區域（35)為不同的實體， 和在檢測區域中，也存在不同的檢測區域（36)和捕獲位點（37)。如方式所顯示的，檢測區 域的2個位點被轉運BSA(38)所間隔開，和這兩個位點是相同的。參照本發明圖2和圖4 所顯示的實施方式，裝置被設置為含有層析試劑條（39)的橫向流動裝置。在本方式中，測 試樣本被施加在位于第一捕獲區域上游的地方，和然后按照箭頭所指的方向沿著測試條流 動，通過毛細作用。這樣，任何在第一捕獲區域沒有被第一捕獲分子（40)捕獲的裂解的指 示分子將會進入第二捕獲區域（42)。
[0280] 在第二捕獲區域（42)，包括有檢測區域（43)的指示分子的片段通過存在于檢測 區域（35)的第二捕獲位點（37)和存在于第二捕獲區域（42)的第二捕獲分子（44)之間的 結合作用而被定位。
[0281] 本發明通過下述的實驗例子做進一步的說明。
[0282] 實施例子
[0283] 實施例子1伸用雙重多肽蛋白共軛的指示分子的相反ELTABA平臺檢測陣列金屬 蛋白酶-8((MMP-8))
[0284] 由作為運轉蛋白的BSA分子把兩個肽連接到指示分子上，其中一個肽作為裂解位 點和第一捕獲區域，第二個包括奸惡區域和第二捕獲區域。，比第一多肽與第二多肽的比例 高的多個肽被連接到BSA分子上。
[0285] 試劑盒包括如下組分：
[0286] 1)用于收集樣本（例如尿）的裝置。
[0287] 2)用于稀釋含有Tris鹽（TBS)緩沖液的金共軛物的緩沖液，pH 8. 0和1%的吐 溫20。
[0288] 3)存在于溶液中的金共軛物，該溶液包括與用于識別第二捕獲區域的羊抗體結合 的金顆粒。
[0289] 4)橫向流動試劑條。試劑條隱藏了含有羊抗體的捕獲區域，該羊抗體以位于第一 捕獲區域提前被吸收的三條線條（PA線條）的形式存在，和包括對應于第二捕獲區域的第 二羊抗體的第二捕獲區域，作為橫穿試劑條的流體路徑的檢測線條。
[0290] 5)放置由測試樣本和指示分子的微孔盤，
[0291] 6)指示分子。該指示分子包括含有MMP-8對應的氨基酸序列的肽段。序列 GPQGIFGQ(SEQ ID ΝΟ:1)為特別適合的，但是也可以是其它的序列，這些序列可以從科學實 驗室中獲得。該肽段帶有在N端含有半胱氨酸（cysteine)并允許他使用標準的基于化學 原理與BSA連接。該肽包括能夠被固定在被隱藏捕獲區域中的羊抗體識別的捕獲區域。第 二個肽另外也使用同樣的化學方法與BSA運轉蛋白共軛，該肽能夠被固定在檢查線中的羊 抗體識別并且與金報告顆粒連接。
[0292] A.生產雙重功能的肽百蛋白共軛物.
[0293] I 5mg的牛血清白蛋白（BSA) (VWR，44155J)被溶解在ρΗ7· 4, 2. 375ml的磷酸鹽緩 沖溶液中（PBS)。
[0294] 2 125 μ 1 的溶解在二甲亞諷（Dimethyl sulfoxide) (sigma, 154938))中的濃度 為2mg/ml的SMCC (克卡科技，M-6035)被加入含有BSA的PBS溶液中。
[0295] 3該反應混合物在室溫下孵育30分鐘T.
[0296] 4 一個 PD-10 柱（GE Healthcare, 17-0851-01)用 4040ml PBS+lmM EDTA 平衡.
[0297] 5孵育后，2. 5暈升上樣量被加入到柱子上.
[0298] 6柱子用3. 5ml PBS/EDTA的洗滌洗脫活性的BSAT.
[0299] 7按照要求的兩種多肽被加入并孵育2小時
[0300] 3:1 比率
[0301] M0L120 0. 8mg
[0302] M0L038C 0. 5mg
[0303] 8溶液經過PBS緩沖液透析過夜（30, 000MWC0透析管）來去除過量的多肽。
[0304] B.制備CF1058:40nm的金共軛物
[0305] 1 18. 5 μ 1的CF1058 (濃度為I. 35mg/ml)原液（摩洛克，CF1058)被加入到 181. 5 μ 1的20mM TAPS緩沖溶液中（pH8. 5)，從而獲得濃度為25 μ g/ml的抗體.
[0306] 2 Iml 40nm金0D5(BBI，GC40)被加入和在旋轉儀器中混合5-10秒·
[0307] 3混合溶液在室溫下被共軛10分鐘.
[0308] 4 最后，12. 5 μ 1 的 50mg/ml 的 β -酪蛋白溶液加入（Sigma, C6905) ·
[0309] C.含有抗體的硝酸纖維素膜的準備
[0310] 所有試劑使用圖像平滑流噴灑器處理在CN140膜上（Sartorius，CN140)。在距 離膜的底部的4, 6, 8毫米的地方以0. 2 μ Ι/mm的噴灑處理的速度處理包括0. 93mg/ml的 CF1060羊抗體（莫洛克，CF1060)的PA線條。檢測線條的CF1058羊抗體（莫洛克，CF1058) 以0. 1 μ Ι/mm的噴灑處理速度處理在距離膜底部13毫米的地方。處理過的膜在紅外線干 燥設備中的45°C下干燥。干燥好的帶有抗體的膜帶有干燥劑的密封鋁箔袋中并放置于室溫 下。
[0311] D.試劑條的制造.
[0312] · 1. 一片60X300mm的干凈的，帶有易撕線并由粘合保護的塑料片材作為背襯片 (G&L Precision Die Cutting, 48077)并放置與工作臺上.撕開易撕線并暴露出粘合的邊。
[0313] · 2.在C部分準備的反應膜被黏在背襯片的底邊沿著粘合邊的上部進行粘合。
[0314] ?吸收墊也被粘接在背襯片上，產生相互重疊2mm的NC膜.
[0315] ?粘合的卡片被生物點公司（Biodot)切割器切成4mm的試劑條并儲存在帶有干燥 劑的鋁箔袋中。
[0316] E.反應緩沖液
[0317] 含有50禮1^8，1501111氯化鈉，201111疊氮鈉，1%￥〇1八〇1的吐溫20邛!18.0的水 溶液。
[0318] F.濕法分析反應過程：
[0319] I. MMP-8 催化結構域（catalytic domain) (ΕΝΖ0生命科學，BML-SE-255)從開始濃 度100 μ g/ml成倍稀釋為0. 78 μ g/ml的反應緩沖液中（(20 μ 1體積），每一個微孔中的體 積為20 μ I.
[0320] 2· 4 μ 1的20 μ g/ml的指示分子（稀釋在TBST溶液中）被添加在每一個20 μ I MMP-8溶液的孔中.
[0321] 3.在室溫中孵育10分鐘.
[0322] 4.向微孔中插入試劑條，讓溶液沿著試劑條流動并吸收微孔中所有的溶液.
[0323] 5.試劑條被轉移到含有20 μ I ODl的金共軛物中（稀釋在反應緩沖溶液中），讓 運行完成
[0324] 6.試劑條被轉移到并含有20 μ 1的反應緩沖溶液的系列孔中并且讓運行完 成·
[0325] 在孵育10分鐘后，試劑條被插入一定體積的液體中（測試樣本）。在孵育前，被加 入測試樣本的指示分子能夠與隱藏的第一捕獲區域中的羊抗體（CF1060)結合.任何測試 樣本中的ΜΜΡ-8裂解指示分子的裂解位點，并允許從隱藏的捕獲區域釋放的裂解片段與測 試線抗體（CF1058)結合。這種復合物與其他的連接在BSA轉運蛋白上的縮氨酸共同作用 下，在第二捕獲區域中形成.
[0326] -旦在吸收墊作為吸收作用下，樣本流至所有測試條的時候，測試條被進入到金 共軛物中CF1058:40nm。當金共軛物顆粒進入隱藏的捕獲區域中，任何完整的并結合到PA 線的，任然帶有縮氨酸M0L120的指示分子被標記。由于酶解作用下，哪些帶有M0L120的縮 氨酸的裂解片段通過金共軛物在測試條上被檢測到。
[0327] 基于相對濃度形成這些線條。檢測線條的存在表示蛋白酶存在于測試樣本中。陰 性測試條表示沒有或處于可被檢測水平之下的低水平的蛋白酶存在。在這兩種極端情況下 的狀態表示不同水平的酶存在于測試樣本中。形成的顏色線條的濃度使用半定量的等分系 統（刻度為0-10)進行測量，其中1表示最低可檢測的顏色濃度，10為最高可檢測的顏色濃 度。考慮到背景信號，以上含有MMP-8樣本的緩沖系統的靈敏度大約為12. 5 μ g/ml。
[0328] 圖7表示MMP-8稀釋下的信號值圖（1表示最低可檢測的信號，10為最高可檢測的 信號）.
[0329] 實施仞I子2 :使用聚乙條鏈.球菌親矛口素（Dolystreptavidin):縮氨酸復合物f旨示 分子的相反ELTABA平臺檢測陣列金屬蛋白酶-9 (MMP-9)
[0330] 包括如下組分的試劑盒：
[0331] 1)用于收集樣本（例如尿）的裝置。
[0332] 2)用于在水合化含有Tris鹽（TBS)緩沖液的金共軛物的緩沖液，pH 8. 0和1% 的吐溫20。
[0333] 3)放置在塑料殼體中的橫向流動試劑條。試劑條隱藏了含有羊抗體的捕獲區域， 該羊抗體以位于第一捕獲區域提前被吸收的四條線條（PA線條）的形式存在，和包括對應 于第二捕獲區域的與轉運蛋白耦合的生物素，作為橫穿試劑條的流體路徑的檢測線條；和 包括抗小雞抗體的第三捕獲區域，作為橫穿試劑條的流體路徑的并位于檢測線條下游的控 制線條。還有與測試條合為一體的，位于第一檢測線上游的樣本接收墊。另外，試劑條包括 位于樣本接收墊上游的，以干的形式存在的與生物素耦合的金顆粒，該顆粒可以被用來接 收金共軛物墊上游的緩沖溶液溶解。
[0334] 4)試管，在試管中放置有樣本收集裝置和指示分子。
[0335] 5)指示分子（an indicator molecule)，（也可以處理在樣本收集裝置中）·指示 分子包括含有對應于MMP-9的氨基酸序列的肽.該序列GPQGIFGQ(SEQ ID N0:1)特別適 合，但是還有其他可以合適的序列可以用，這些可以從科學文獻中獲得。該指示分子帶有 生物素的基團，允許它與適配子分子，聚乙烯鏈球菌親和素，形成復合物的通過聚乙烯乙二 醇/連接器連接。也被處理在第一捕獲區域，并可以被固定在隱藏捕獲區域上的羊抗體識 別。
[0336] 6)適配子分子，例如聚乙烯鏈球菌親和素寶庫偶多個結合基團，它們可以與包含 裂解位點的指示分子形成復合物。
[0337] 試劑備
[0338] 根據本發明構建用于檢測液體樣品中蛋白酶活性的測試條。所述分析基于在 MMP-9中存在的指示分子的裂解而產生片段，這使該片段與測試線結合。用試條測試了包括 創傷液樣品的各種樣品，用于檢測蛋白酶活性。
[0339] A.制備金-浸漬共軛物墊
[0340] 使用Isoflow分樣儀（噴射高度7mm)以0· 9 μ Ι/mm用稀釋于金干燥緩沖液（50mM Tris，150mM 氯化鈉，20mM 疊氮鈉，1 % BSA，10 % 海藻糖，1 % Tween20, ρΗ8· 0)的 0D4 生物 素：40nm 金共輒物（Innova Bioscience)和 0D2 雞 IgY 金共輒物（Mologic)噴射 Whatman 玻璃纖維墊（Whatman, Rapid 24Q，12mmX300mm)。處理的共軛物物條在隧道式干燥室內在 60°C以5mm/sec的速度干燥。在室溫，將干燥的金共軛物-浸漬共軛物墊干燥保存于有干 燥劑的密封鋁箔袋。
[0341] B.制備抗體-浸漬的硝酸纖維素膜
[0342] 以0. 05 μ Ι/mm的分配速率將所有試劑條帶化于Millipore HF090膜 (Millipore，HF09004S40,40X300mm)上。PA 線由距離膜的基線 10、12、14 和 16mm 處的 lmg/ml CF1060 (Mologic)構成，測試線由距離膜的基線23mm處的濃度為0· 4mg/mlBSA 的生物素（Mologic)構成，控制線由距離膜的基線28mm處的濃度為0.5mg/ml的羊抗雞 IgY (Lampire，7455207)構成。處理的膜在隧道式干燥室內在60°C以10mm/sec的速度干燥。 干燥的抗體-浸漬的硝酸纖維素膜室溫保存于有干燥劑的密封鋁箔袋。
[0343] C. chase 緩沖液
[0344] 50mM Tris、150mM氯化鈉、20mM疊氮鈉、1% vol/vol Tween 20，pH 8. 0 的水溶液。
[0345] D.卡裝配
[0346] 根據詳細說明了每個卡部件的確切縱向維度和位置的如下步驟和圖8裝配測試 卡。準備后，修剪所述卡，獲得多個用于蛋白酶分析的試條。
[0347] · 1. 一張75X300mm的清潔的具有離型膜保護膠的塑料膜作為襯片（81) (G&L Precision Die Cutting, 28840)，放置于工作臺上。撕去離型膜以暴露膠帶的粘性面。
[0348] · 2.將按照B部分準備的反應膜（82)附著于底襯（81)的粘性面上，距離低末端 16mm〇
[0349] ·3.將按照A部分準備的浸漬的共軛物墊（83)附著于底襯（81)上，在反應膜（82) 上交疊 lrnm。
[0350] · 4.將緩沖墊（54，Whatman，CF5, llX300mm)放置于底襯（81)上，于共軛物墊 (83)上交疊6mm〇
[0351] ·5·雙面膠（55,（G&L Precision Die Cutting, GL-187)附著覆蓋于共軛物墊（83) 上，距離低末端15mm。
[0352] ·6·樣品接收墊/血液分離膜（86, Spectral SG膜，Primecare)覆蓋放置于去掉 覆蓋層的膠帶（85)上，距離低末端15mm〇
[0353] · 7.吸收墊（87, Gel blotting 紙，Ahlstrom，登記 222, 23 X 300mm)放置于底襯 (81)上側上，于反應膜（82)上交疊3mm。
[0354] 使用自動化沖壓裁剪機（Kinematic, 2360)修剪所述卡至4mm寬的試條，并組裝進 入2孔塑料殼體（BBI Dundee, vision)。使用在Mologic專門為該裝置生產的氣動壓板裝 置封閉所述裝置。
[0355] 在以下描述的實施例中，制備緩沖液標準品，含有從2000ng/ml低至62. 5ng/m的 不同濃度的MPP-9 (Mologic)。
[0356] 步驟1 :液體樣品（測試樣品）放于具有固定量的多肽（6ng/test)的收集裝置中。 劇烈旋轉所述收集裝置以使樣品與底物溶液充分混合。在室溫下孵育該反應混合物固定的 時間段（例如10分鐘）后，指示分子上的生物素與適配分子（lOOng/test)形成的復合物 被隨后加入。
[0357] 步驟2 :在孵育期結束時，滴加固定體積的液體至樣品接收墊（86)。當在孵育前， 被加入到測試樣本中的指示分子能夠結合被隱藏在第一捕獲區域中的捕獲帶中的羊抗體 (CF1060)。在那里，樣品中的任何MMP-9在裂解位點裂解指示分子，從而從隱藏的捕獲區域 中釋放出片段。裂解的片段向親和素測試線移動，在測試線上，裂解片段通過聚合鏈球菌生 物素適配子分子被固定。
[0358] 步驟3 :-旦樣品在用作儲存池的吸收墊（87)幫助下已經通過測試條（82)，加入 兩滴試劑盒中提供的chase緩沖液至緩沖墊（84)，與干燥的附著于金顆粒的生物素接觸并 使其復水。當共軛物的金顆粒進入隱藏的捕獲帶，任何結合至預吸附線的完整的指示分子 籍由多聚鏈霉親和素適配子蛋白質被標記。那些沒有在隱藏的捕獲帶結合至完整指示分子 的沿試條向下迀移，并標記任何被測試線捕獲的指示分子。使用單獨的控制系統，其包含結 合至羊抗雞IgY控制線的連接于金顆粒的雞IgY。存在線表示測試完成。
[0359] 通過其相對強度評估形成的線。存在測試線并且存在完全強度的控制線表示在測 試樣品內存在蛋白酶。陰性測試線指示沒有或低于檢測限的低水平的蛋白酶。這兩項極端 之間的階段指示測試樣品內不同水平的蛋白酶。用視覺和NES側流裝置讀取儀測量產生的 有顏色的線的強度。具有0-10數值范圍的半定量評分系統用于視覺讀取，其中1是最低的 可檢測顏色強度，10是觀測到的最高顏色強度。
[0360] 當用混合的MMP-9緩沖液的樣本進行測試的時候，圖9顯示了分析的靈敏度。用 20 μ 1體積的樣本可以被檢測的MMP-9的極限大約為250-500ng/ml。讀取器單位被顯示， 當值大于1的時候為陽性結果，從而通過讀取器被顯示出來。
[0361] 實施例3伸用具有3個表位和一個裂解位點的合成多肽指示分子的反相ELTABA 平臺用于檢測金屬蛋白酶-9 (MMP-9)和人嗜中件粒細朐腠肽酶（HNE)
[0362] 包含如下成分的試劑盒：_
[0363] 1)用于收集樣品的裝置（例如用于尿液）
[0364] 2)用于使金共軛物物復水的chase緩沖液，由pH 8. 0的tris鹽緩沖液（TBS)和 1% Tween?20 組成。
[0365] 3)側流測試條，其固定在塑料盒內。測試條具有隱藏的捕獲帶，捕獲帶包含四條預 吸附線（PA線），第二捕獲帶，包含抗-DNP作為橫穿測試條流動路徑的第一測試線，和第三 捕獲帶，在測試線的下游，包含吸附的抗雞抗體，作為橫穿測試條流動路徑的控制線。在塑 料盒中有觀察窗，通過觀察窗觀察測試和控制線。在第一測試線的上游，還有整合的樣品接 收墊。此外，測試條有帶有抗-FITC的金顆粒，干燥進入測試條的樣品接收墊上游，其可以 通過在金共軛物墊上游接收chase緩沖液的第二孔中加入緩沖液而被復原。
[0366] 4)管，其中可設置樣品收集裝置，和指示分子。
[0367] 5)指示分子（其可以合并進樣品收集裝置）。指示分子由包含MMP-9偏好的氨基 酸序列，例如GPQGIFGQ(SEQ ID ΝΟ:1)和基于HNE的氨基酸序列，例如GAAPVA(SEQ ID NO:2) 組成，一 DNP作為第二捕獲位點和最后一熒光標記作為可檢測的位點。多肽攜帶末端生物 素基團，通過聚乙二醇甘油間隔子/連接子連接，這允許其與隱藏在捕獲區域中的適鏈霉 親和素識別和固定。
[0368] 測試備
[0369] 如下所述，根據本發明構建用于檢測液體樣品中蛋白酶活性的測試條。所述分析 基于在MMP-9和HNE存在時指示分子中的裂解產生將結合至測試線的片段。用試條測試了 包括創傷面積液樣品的各種樣品，用于檢測蛋白酶活性。
[0370] A.制各金-浸漬共軛物物墊
[0371] 使用Isoflow分樣儀（噴射高度7mm)以0· 6 μ Ι/mm用稀釋于金干燥緩沖液 (50禮1^8，1501111氯化鈉，201111疊氮鈉，1%854，10%海藻糖，1%了￥661120，？!18.0)的 0D4FITC金共軛物（Mologic)、0D2雞IgY金共軛物（Mologic)噴射Whatman玻璃纖維墊 (Whatman, Rapid 24Q, 12mmX 300mm)。處理的共軛物條在隧道式干燥室內在60°C以5mm/ sec的速度干燥。在室溫，將干燥的金共軛物-浸漬共軛物墊干燥保存于有干燥劑的密封鋁 箔袋。
[0372] B.制各抗體-浸漬的硝酸纖維素臘
[0373] 以0. 05 μ Ι/mm的分配速率將所有試劑條帶化于Millipore HF090膜 (Millipore，HF09004S40, 40X300mm)上。PA線由距離膜的基線 10、12、14和 16mm處的 Img/ ml的鏈球菌親和素（BBI，Dundee，01041049L)構成，測試線由距離膜的基線23mm處的濃度 為lmg/ml羊抗DNP抗體（(Bethyl labs，A150117A))構成，控制線由距離膜的基線28mm處 的濃度為〇. 5mg/ml的羊抗雞IgY(Lampire，7455207)構成。處理的膜在隧道式干燥室內在 60°C以10mm/sec的速度干燥。干燥的抗體-浸漬的硝酸纖維素膜室溫保存于有干燥劑的 密封鋁箔袋。
[0374] C. Chase 緩沖液
[0375] 50mM Tris，150mM 氯化鈉，20mM 疊氮鈉，1% vol/vol Tween 20，pH 8. O 的水溶液。
[0376] D.裝配卡
[0377] 根據詳細說明了每個卡成分的確切縱向維度和位置的如下步驟和圖8組裝測試 卡。準備后，修建所述卡，獲得多個用于蛋白酶分析的試條。
[0378] · 1. -張75X300mm的清潔的具有離型膜保護膠的塑料膜作為襯片（81) (G&L Precision Die Cutting, 28840)，放置于工作臺上。撕去離型膜以暴露膠帶的粘性面。
[0379] · 2.將按照B部分準備的反應膜（82)附著于底襯（81)的粘性面上，距離低末端 16mm〇
[0380] ·3.將按照A部分準備的浸漬的共軛物墊（83)附著于底襯（81)上，在反應膜（82) 上交疊1mm。
[0381] · 4.將緩沖墊（84，Whatman，CF5, llX300mm)放置于底襯（81)上，于共軛物墊 (83)上交疊6mm〇
[0382] ·5·雙面膠（85, G&L Precision Die Cutting, GL-187)附著覆蓋于共軛物墊（83) 上，距離低末端15mm。
[0383] ·6·樣品接收墊 / 血液分離膜（86, Spectral SG membrane, Primecare)覆蓋放置 于去掉覆蓋層的膠帶（85)上，距離低末端15mm。
[0384] · 7.吸收墊（87, Gel blotting paper, Ahlstrom, grade 222, 23 X 300mm)放置于 底襯（81)上側上，于反應膜（82)上交疊3mm。
[0385] 使用自動化沖壓裁剪機（Kinematic, 2360)修剪所述卡至4mm寬的試條，并組裝進 入2孔塑料殼體（BBI Dundee, vision)。使用在Mologic專門為該裝置生產的氣動壓板裝 置封閉所述裝置。
[0386] 在以下描述的實施例中，制備緩沖液標準品，含有從2000ng/ml低至31. 25ng/m的 不同濃度的 MMP-9 (Mologic)和 HNE (Lee biotech, 342-40) 〇
[0387] 步驟I :液體樣品（測試樣品）放于具有固定量指示分子（400pg/teSt)的收集裝 置中。劇烈旋轉所述收集裝置以使樣品與指示分子充分混合。在室溫下孵育該反應混合物 固定的時間段（例如10分鐘）。
[0388] 步驟2 :在孵育期結束時，滴加固定體積的液體至樣品接收墊（86)。孵育期前，加 入至樣品的指示分子能夠通過第1捕獲區域結合至隱藏的捕獲帶中的聚合鏈球菌生物素。 存在于樣品中的任何MMP-9和/或HNE在裂解位點裂解指示分子，使裂解的片段從隱藏的 捕獲帶釋放。裂解的片段超抗-DNP測試線迀移，通過DNP捕獲位點被固定在那里。
[0389] 步驟3 :-旦樣品在用作儲存池的吸收墊（87)幫助下已經通過測試條（82)，加入 兩滴試劑盒中提供的chase緩沖液至緩沖墊（84)，與干燥的連接于金顆粒的抗FITC接觸并 使其復水。當共軛物的金顆粒進入隱藏的捕獲帶，任何結合至預吸附線的完整的指示分子 籍由熒光標記檢測位點被標記。那些沒有在隱藏的捕獲帶結合至完整指示分子的沿試條向 下迀移，并標記任何被測試線捕獲的裂解指示分子。使用單獨的控制系統，其包含結合至羊 抗雞IgY控制線的連接于金顆粒的雞IgY。存在線表示測試完成。
[0390] 通過其相對強度評估形成的線。存在測試線并且存在完全強度的控制線表示在測 試樣品內存在蛋白酶。陰性測試線指示沒有或低于檢測限的低水平的蛋白酶。這兩項極端 之間的階段指示測試樣品內不同水平的蛋白酶。用視覺和NES側流裝置讀取儀測量產生的 有顏色的線的強度。具有0-10數值范圍的半定量評分系統用于視覺讀取，其中1是最低的 可檢測顏色強度，10是觀測到的最高顏色強度。
[0391] 當用混合的MMP-9緩沖液的樣本進行測試的時候，圖10顯示了分析的靈敏度。用 30 μ 1體積的樣本可以被檢測的MMP-9的極限大約為125-250ng/ml。讀取器單位被顯示， 當值大于1的時候為陽性結果，從而通過讀取器被顯示出來。
[0392] 當用混合的HNE緩沖液的樣本進行測試的時候，圖11顯示了分析的靈敏度。用 30 μ 1體積的樣本可以被檢測的HNE的極限大約為62. 5-125ng/ml。讀取器單位被顯示，當 值大于1的時候為陽性結果，從而通過讀取器被顯示出來。
[0393] 實施例4伸用具有多個裂解位點的合成多肽指示分子反相ELTABA平臺用于檢測 基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)
[0394] 使用包括含有MMP9裂解位點的氨基酸序列，GPQGIFGQ(SEQ ID ΝΟ:1)，的指示分 子，和另外的包括2, 3, 5, 7MMP9裂解位點的多肽的指示分子，并采用施例子2中的測試條和 試劑盒和帶有多肽的指示分子被用在本實施例子中。帶有多個MMP9裂解位點的指示分子 與實施例子2中的指示分子一樣帶有在PA線上能夠結合CF1060第一捕獲區域（ALP)，和通 過聚乙二醇間隔子/連接子連接的生物素基團的一端。這些實驗被進行來測試具有多個裂 解位點的指示分子的靈敏度。
[0395] 這些實驗使用具有范圍從2000ng/ml到31. 25ng/ml的不同濃度的MMP9的緩沖溶 液，并依照實施例子2中的步驟1到3進行。結果顯示在表1和圖12中。
[0396] 表 1

【權利要求】
1. 用于測試樣本中具有裂解底物的酶的裂解活性存在的酶檢測裝置，該裝置包括： (i) 用于加入樣本中的指示分子，該指示分子包括： (a) 裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解； (b) 第一捕獲位點；和 (c) 包括第二捕獲位點的檢測區域： 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放； (ii) 用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的第一 捕獲位點的第一捕獲分子，但并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解片段，和其中，通 過第一捕獲位點的結合，指示分子被捕獲到第一捕獲分子上從而實質防止任何隨后被該酶 引起的裂解位點的裂解；和 (iii) 用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕獲區 域包括能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第一捕 獲區域處于空間上的分離；和其中，在檢測區域對通過第二捕獲位點被結合到第二捕獲分 子上的任何被裂解的指示分子的檢測，表示測試樣本中酶裂解活性的存在。
2. 根據權利要求1所述的裝置，其中被檢測的酶選自如下種類：氧化還原酶；水解酶和 裂解酶，和包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神經氨酸苷酶，唾 液酸苷酶、脂酶，脫氧核糖核酸酶（DNAse)和核糖核酸酶（RNAse)的亞種。
3. 根據權利要求1所述的裝置，其中，被檢測的酶為金屬蛋白酶或者人類衍生的中性 粒細胞彈性蛋白酶。
4. 根據權利要求1-3之一所述的裝置，其中，指示分子包括多個裂解位點，和其中在任 何一個裂解位點的裂解引起包括有檢測區域的指示分子的片段的釋放。
5. 根據權利要求1-4之一所述的裝置，其中，指示分子的第一捕獲位點和第一捕獲區 域中的第一捕獲分子為結合對中的兩半，其中所述的結合對選自如下的結合對抗原和 抗體或者他們的結合片段；生物素和親和素，鏈霉親和素，中性或凱普親和素；免疫球蛋白 (或者片段）和蛋白A或G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸序列互補的序列；配體和受體 分子；激素和激素結合蛋白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素結合區域和纖維素 纖維；固定的氨基苯基硼酸和順式-二醇軸承分子；葡聚糖和纖維素纖維和他們的類似物， 衍生物以及片段。
6. 根據權利要求1-4之一所述的裝置，其中，指示分子的復數可以結合每一個第一結 合分子。
7. 根據權利要求1-6之一所述的裝置，其中，指示分子的第二捕獲位點和第二捕獲分 子為結合對中的兩半，其中，所述的結合對選自如下的結合對抗原和抗體或者他們的結 合片段；生物素和親和素，鏈霉親和素，中性或凱普親和素；免疫球蛋白（或者片段）和蛋 白A或G ;碳水化合物和血凝素；與核苷酸序列互補的序列；配體和受體分子；激素和激素 結合蛋白；酶輔助因子和酶；酶的抑制劑和酶；纖維素結合區域和纖維素纖維；固定的氨基 苯基硼酸和順式-二醇軸承分子；葡聚糖和纖維素纖維和他們的類似物，衍生物以及片段。
8. 根據權利要求1-7之一所述的裝置，其中，另外包括報告分子，該報告分子被結合或 者能夠結合到指示分子的檢測區域上。
9. 根據權利要求8所述的裝置，其中，報告分子通過第二捕獲位點結合到檢測區域上， 其中，報告分子與第二捕獲位點的結合不會消弱第二捕獲位點結合到第二捕獲分子的結合 能力。
10. 根據權利要求8或9所述的裝置，其中，報告分子包括選自如下的報告半族：金顆 粒；染料；發光物質；熒光分子；放射性物質；可見物質；脂質體或其他包括產生信號底物 的囊；電子活化粒子；或者酶其底物的組合。
11. 根據權利要求8-10之一所述的裝置，其中，報告分子與檢測區域的結合為通過同 時結合檢測區域和報告分子的適配子進行間接和媒介的結合。
12. 根據權利要求8-11之一所述的裝置，其中，多個報告分子可以結合到每一指示分 子。
13. 根據權利要求8-12之一所述的裝置，其中，該裝置為流體裝置，和第一捕獲區域和 第二捕獲區域沿著層析介質以連續的位置存在。
14. 在用于如權利要求1-13所述的酶檢測裝置中的指示分子。
15. 在用于檢測測試樣本中具有裂解底物的酶的裂解活性存在的指示分子，該指示分 子包括： (a) 裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解； (b) 第一捕獲位點；和 (c) 包括第二捕獲位點的檢測區域： 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子的片段的釋放。
16. 根據權利要求15所述的指示分子，包括多個裂解位點，其中任何一個裂解位點的 裂解導致包括檢測區域的指示分子的片段的釋放。
17. 根據權利要求16所述的指示分子，包括2-15個裂解位點。
18. 根據權利要求15-17所述的指示分子，其中，檢測區域通過轉運蛋白與裂解位點連 接。
19. 根據權利要求18所述的指示分子，其中，多個檢測區域被連接在轉運蛋白上。
20. 用于檢測測試樣本中具有裂解底物的酶的方法，該方法包括以下步驟： (i) 提供一種酶檢測裝置，該裝置包括： 用于加入樣本中的指示分子，該指示分子包括： (a) 裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解； (b) 第一捕獲位點；和 (c) 包括第二捕獲位點的檢測區域： 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放； 用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的第一捕獲 位點的第一捕獲分子，但并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解片段，和 用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕獲區域包括 能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，和其中，第二捕獲區域與第一捕獲區 域處于空間上的分離； (ii) 提供測試樣本； (iii) 向測試樣本施加所述裝置的指示分子，在一定條件下，如果酶存在，該酶能夠裂 解底物的區域； (iv)讓測試樣本與檢測裝置的第一捕獲區域接觸，從而讓完整無缺的指示分子，如果 存在，與在第一捕獲區域中的第一捕獲分子結合，和其中，指示分子與第一捕獲分子的結合 實質防止任何隨后被該酶引起的指示分子的裂解位點的裂解； (V)讓測試樣本與檢測裝置的第二捕獲區域接觸，從而讓包括有檢測區域的裂解指示 分子的任何片段通過第二捕獲位點被第二捕獲分子結合；和 (Vi)檢測包括有檢測區域的裂解指示分子的片段的存在、不存在或水平來確定測試樣 本中酶的存在。
21. 根據權利要求20所述的方法，其中該酶檢測裝置為權利要求1 -13之一所述的裝置 或者該指示分子為權利要求15-19之一所述的指示分子。
22. 根據權利要求20或21所述的方法，其中，完整指示分子或者在第二捕獲區域中進 行指示分子片段的檢測為通過另外能夠結合檢測區域的報告分子來進行的。
23. 根據權利要求20-22所述的方法，其中，與第二獲取區域中的指示分子片段結合的 報告分子的存在表示能夠裂解指示分子的裂解位點的酶存在于測試樣本中。
24. 根據權利要求20-22所述的方法，其中，在第一獲取區域中但不在第二區域中的報 告分子的存在表不沒有酶存在于測試樣本中。
25. 相對于另外一個或多個樣本中所述酶的量，用于檢測第一測試樣本中具有裂解底 物的酶的量的方法包括以下步驟： (i) 提供一種酶檢測裝置，該裝置包括： 用于加入樣本中的指示分子，該指示分子包括： (a) 裂解位點，如果該酶的裂解活性存在，該裂解位點能夠被所述的酶裂解； (b) 第一捕獲位點；和 (c) 包括第二捕獲位點的檢測區域： 其中，裂解位點的裂解導致包括有檢測區域的指示分子片段的釋放； 用于接收樣本的第一捕獲區域，其中第一捕獲區域包括能夠結合指示分子的第一捕 獲位點的第一捕獲分子，但該第一捕獲分子并不結合包括有檢測區域的指示分子的裂解片 段，和 用于接收與第一捕獲區域接觸后的測試樣本的第二捕獲區域，其中第二捕獲區域包括 能夠結合指示分子的第二捕獲位點的第二捕獲分子，其中，第二捕獲區域與第一捕獲區域 處于空間上的分離； (ii) 提供第一測試樣本； (iii) 向第一測試樣本施加所述裝置的指示分子，在一定條件下，如果酶存在，該酶能 夠裂解底物的區域； (iv) 讓第一測試樣本與檢測裝置的第一捕獲區域接觸，從而讓完整無缺的指示分子， 如果存在，與在第一捕獲區域中的第一捕獲分子結合，和其中，指示分子與第一捕獲分子的 結合實質防止任何隨后被該酶引起的指示分子的裂解位點的裂解； (v) 讓第一測試樣本與檢測裝置的第二捕獲區域接觸，從而讓包括有檢測區域的裂解 指示分子的任何片段通過第二捕獲位點被第二捕獲分子結合；和 (Vi)檢測包括有檢測區域的裂解指示分子的片段的存在、不存在或水平來確定第一測 試樣本中酶的存在； (vii) 對另外的一個或多個樣本重復（i)到（vi)的步驟； (viii) 把從第一樣本中獲得水平與另外的一個或多個樣本獲得的水平進行比較，從而 確定在每一個樣本中酶的相對水平。
26. 根據權利要求25所述的方法，其中酶檢測裝置為如權利要求1-13之一所述的裝 置，或其中指示分子為如權利要求15-19之一所述的指示分子。
27. 根據權利要求25或26所述的方法，其中至少一個用于比較的樣本包括已知數量的 酶。
28. 如權利要求1-13之一所述的酶檢測裝置在測試樣本具有裂解底物的酶存在的用 途。
【文檔編號】G01N33/543GK104487590SQ201380021021
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年4月22日 優先權日:2012年4月20日
【發明者】保羅·大衛, 凱特·帕克 申請人:莫洛克有限公司