使用脂肪組織衍生的干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生篩選方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的是用于鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物的方法，包括：在候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)脂肪衍生的干細(xì)胞(ADSC)，和確定ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度；以及用于鑒定神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)化合物的系統(tǒng)。還提供的是促進(jìn)ADSC中的神經(jīng)發(fā)生的方法。
【專利說明】使用脂肪組織衍生的干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生篩選方法和系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開內(nèi)容涉及用于鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物（例如促進(jìn)或抑制神經(jīng)發(fā)生的化 合物）的方法。更具體地講，本公開內(nèi)容涉及使用脂肪衍生的干細(xì)胞（ADSC)、更尤其是人脂 肪衍生的干細(xì)胞（hADSC)鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦營(yíng)養(yǎng)素在嬰兒、兒童以及孕婦和哺乳期婦女的飲食中已經(jīng)成為日益重要的添加 齊U，因?yàn)樗鼈兡軌虼龠M(jìn)早期腦發(fā)育。另外，一直都在尋找用于治療神經(jīng)變性性疾病或腦損傷 的化合物。需要鑒定神經(jīng)毒性化合物，例如環(huán)境毒素、工業(yè)毒素或飲食毒素，以便除去或減 少對(duì)這類化合物的暴露。發(fā)現(xiàn)這樣的營(yíng)養(yǎng)素和毒素的方法通常特別耗時(shí)和低效。因此，需 要提供用于鑒定具有神經(jīng)學(xué)開發(fā)效益的化合物的可靠、穩(wěn)定而快速的方法。另外，需要鑒定 對(duì)神經(jīng)有害的化合物。
[0003] 已經(jīng)證明了干細(xì)胞（例如脂肪衍生的干細(xì)胞（ADSC))可以以可復(fù)制的方式分化為 多種成熟細(xì)胞表型，包括神經(jīng)元細(xì)胞。具體地講，在人類脂肪衍生的干細(xì)胞（hADSC)中已經(jīng) 證明了這一點(diǎn)。hADSC是特別有用的研究工具，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀椎米陨虡I(yè)來源或抽脂術(shù)，并且 它們并不牽涉使用胚胎干細(xì)胞所產(chǎn)生的相同可能的爭(zhēng)議。此外，hADSC容易得自單個(gè)患者， 因而提供個(gè)性化醫(yī)療的機(jī)會(huì)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本公開內(nèi)容一方面提供使用ADSC來鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物的方法。所述方 法用于鑒定可用于補(bǔ)充嬰兒、兒童、孕婦和哺乳期婦女的飲食的潛在的腦營(yíng)養(yǎng)素。本方法還 用于鑒定用于治療神經(jīng)病和神經(jīng)損傷的潛在藥物候選物。最后，本方法用于鑒定可能具有 神經(jīng)毒性的化合物，例如對(duì)胎兒、嬰兒和兒童的神經(jīng)發(fā)育有害的化合物。神經(jīng)毒性化合物還 可能促成神經(jīng)病或可能干擾對(duì)神經(jīng)病和損傷的治療和康復(fù)。
[0005] 因此，在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供用于鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物的方 法，包括：在候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)脂肪衍生的干細(xì)胞（ADSC);和確定ADSC中的神經(jīng)發(fā)生 程度。前述方法可以進(jìn)一步包括在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)ADSC，確定在所述候選 化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度，并且將在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的 ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度進(jìn)行 比較。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪衍生的干細(xì)胞是人脂肪衍生的干細(xì)胞（hADSC)。
[0006] 不受任何具體理論的束縛，認(rèn)為與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的 神經(jīng)發(fā)生程度相比，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度增加，表明所 述候選化合物是神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合物。另一方面，與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的 ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度相比，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度減 少，表明所述候選化合物是神經(jīng)發(fā)生-抑制化合物。
[0007] 在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在已知神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合物例如 二十二碳六烯酸（DHA)存在時(shí)培養(yǎng)ADSC，確定在DHA存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC的神經(jīng)發(fā)生程度， 并且將在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度與在DHA存在時(shí)培養(yǎng)的 ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度進(jìn)行比較，其中與在DHA存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度相 t匕，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度增加，表明所述候選化合物是 神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合物。
[0008] 在某些實(shí)施方案中，神經(jīng)發(fā)生程度是通過觀測(cè)ADSC的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化而確定。細(xì) 胞形態(tài)學(xué)的變化包括但不限于細(xì)胞質(zhì)收縮、神經(jīng)突形成、樹突樣突出的形成、軸突形成或其 任何組合。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化可通過細(xì)胞分析或目測(cè)的任何方法而確定。例如，細(xì)胞形態(tài) 學(xué)的變化可通過顯微鏡例如相差顯微術(shù)而觀測(cè)。在其它實(shí)施方案中，神經(jīng)發(fā)生程度通過觀 測(cè)指示神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞生物標(biāo)記而確定。
[0009] 在任何前述方法中，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)ADSC足以發(fā)生神經(jīng)發(fā)生的一 段時(shí)間，例如大約1至大約5天。此外，可以在升高的溫度例如大約25至大約45°C下培養(yǎng) ADSC。
[0010] 用于培養(yǎng)ADSC的培養(yǎng)器皿可包含促進(jìn)或支持神經(jīng)發(fā)生的涂層（coating)，例如模 擬中樞神經(jīng)環(huán)境的涂層。例如，培養(yǎng)器皿可包含包括多聚-L-鳥氨酸和牛纖連蛋白的涂層。 [0011] 在某些實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)ADSC的培養(yǎng)基促進(jìn)或支持神經(jīng)發(fā)生。例如，所述培 養(yǎng)基可包含神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、表皮生長(zhǎng)因子（EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（b-FGF)、N2 補(bǔ)充物和L-谷氨酰胺。
[0012] 在某些實(shí)施方案中，所述方法包括在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)胞之前， 在啟動(dòng)培養(yǎng)基（priming medium)中啟動(dòng)ADSC大約1至大約5天。所述啟動(dòng)培養(yǎng)基可包含 神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、EGF、b-FGF和N2補(bǔ)充物。啟動(dòng)之后，ADSC可以在包含完全MesenPRO和 所述候選化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約1至大約5天。
[0013] 本公開內(nèi)容的另一方面提供促進(jìn)ADSC中的神經(jīng)發(fā)生的方法，包括：在神經(jīng)發(fā)生促 進(jìn)化合物存在時(shí)培養(yǎng)ADSC。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括確定ADSC中的神經(jīng)發(fā) 生程度。
[0014] 本公開內(nèi)容的再一方面涉及用于鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物的系統(tǒng)，包括：ADSC ; 包含模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)的涂層的培養(yǎng)器皿；和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的培養(yǎng)基。用于培養(yǎng)器皿的涂 層可包含例如，牛纖連蛋白和多聚-L-鳥氨酸。所述培養(yǎng)基可包含神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、EGF、 b-FGF、N2補(bǔ)充物和L-谷氨酰胺。在其它實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括:ADSC、包含模擬中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的涂層的培養(yǎng)器皿、啟動(dòng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基。所述啟動(dòng)培養(yǎng)基可包含神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng) 基、EGF、b-FGF和N2補(bǔ)充物，而所述培養(yǎng)基可包含完全MesenPRO。
[0015] 附圖簡(jiǎn)沭 圖1是描繪根據(jù)本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的快速神經(jīng)元分化平臺(tái)（RNDP)的圖解。將 hADSC在合適的培養(yǎng)基和合適量的候選化合物中（處理）培養(yǎng)24-72小時(shí)。然后評(píng)價(jià)hADSC 以確定神經(jīng)發(fā)生程度。
[0016] 圖2是描繪根據(jù)本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的擴(kuò)展的神經(jīng)元分化平臺(tái)（ENDP)的圖解。 將hADSC在合適的啟動(dòng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至多3天。然后將啟動(dòng)培養(yǎng)基更換為合適的培養(yǎng)基 (分化培養(yǎng)基）和合適量的候選化合物并培養(yǎng)1-5天。然后評(píng)價(jià)hADSC以確定神經(jīng)發(fā)生程 度。
[0017] 圖3A描繪了對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的ADSC的相差圖像。圖3B描繪了腦營(yíng)養(yǎng)素處理后的ADSC 的相差圖像。
[0018] 圖4A是來自細(xì)胞表達(dá)研究的對(duì)照?qǐng)D像，其中細(xì)胞用針對(duì)微管相關(guān)蛋白2 (MAP2) (一種神經(jīng)元標(biāo)記）的抗體染色。圖4B是在MAP2表達(dá)研究中的腦營(yíng)養(yǎng)素處理后圖像。紅 色熒光（用白色條紋指示）顯示MAP2的表達(dá)。
[0019] 圖5A是來自細(xì)胞表達(dá)研究的對(duì)照?qǐng)D像，其中細(xì)胞用針對(duì)巢蛋白（一種神經(jīng)元標(biāo) 記）的抗體染色。圖5B是在巢蛋白表達(dá)研究中的腦營(yíng)養(yǎng)素處理后圖像。紅色熒光（用白 色條紋指示）顯示巢蛋白的表達(dá)。
[0020] 圖6A是來自細(xì)胞表達(dá)研究的對(duì)照?qǐng)D像，其中細(xì)胞用針對(duì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (GFAP)(-種神經(jīng)元標(biāo)記）的抗體染色。圖6B是在GFAP表達(dá)研究中的腦營(yíng)養(yǎng)素處理后圖 像。紅色熒光（用白色條紋指示）顯示GFAP的表達(dá)。
[0021] 圖7A是來自細(xì)胞表達(dá)研究的對(duì)照?qǐng)D像，其中細(xì)胞用針對(duì)β III微管蛋白（一種神 經(jīng)元標(biāo)記）的抗體染色。圖7Β是在β III微管蛋白表達(dá)研究中的腦營(yíng)養(yǎng)素處理后圖像。紅 色熒光（用白色條紋指示）顯示β III微管蛋白的表達(dá)。
[0022] 實(shí)施本發(fā)明的最伴方式 本公開內(nèi)容提供用于鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物的方法，包括：在候選化合物存在時(shí) 培養(yǎng)脂肪衍生的干細(xì)胞（ADSC)，和確定ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度。
[0023] "神經(jīng)發(fā)生"是指在體外或體內(nèi)自干細(xì)胞或祖細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化、產(chǎn)生或增 殖。神經(jīng)發(fā)生程度可通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來確定，例如通過觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。細(xì) 胞分析或目測(cè)的任何方法都適用于本方法。例如，可使用顯微鏡技術(shù)例如相差顯微術(shù)觀測(cè) ADSC的形態(tài)學(xué)變化。指示神經(jīng)發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化包括但不限于細(xì)胞質(zhì)收縮以及神經(jīng)突、軸 突和樹突的存在。在其它實(shí)施方案中，通過觀測(cè)指示神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞生物標(biāo)記，例如通過使 用生物標(biāo)記表達(dá)實(shí)驗(yàn)，確定神經(jīng)發(fā)生程度。這樣的生物標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)例 如神經(jīng)絲、髓鞘堿性蛋白、微管相關(guān)蛋白2(MP2)、巢蛋白、β-III微管蛋白、膠質(zhì)纖維酸性 蛋白（GFAP)、S100 (-種鈣結(jié)合蛋白）、CNPase和GABA受體。
[0024] "神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物"是指通過促進(jìn)或抑制神經(jīng)發(fā)生而影響神經(jīng)發(fā)生的化合 物。因此，在某些實(shí)施方案中，神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生（"神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合 物"），而在其它實(shí)施方案中，神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物抑制或減少神經(jīng)發(fā)生（"神經(jīng)發(fā)生-抑 制化合物")。鑒定為促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的化合物可以有利地用作嬰兒、兒童、孕婦和哺乳母親的 飲食補(bǔ)充物，以促進(jìn)和支持早期腦發(fā)育。這些化合物也可用于治療神經(jīng)變性疾病或神經(jīng)損 傷。鑒定為抑制神經(jīng)發(fā)生的化合物可以是從嬰兒、兒童、孕婦和哺乳期婦女的飲食和環(huán)境中 需要避免或去除的潛在毒素。這些化合物還可能干擾神經(jīng)病或損傷的治療和康復(fù)。因此， 在患有神經(jīng)病或損傷的個(gè)體的飲食和環(huán)境中也可避免神經(jīng)發(fā)生-抑制化合物。
[0025] "候選化合物"是指用本文所述的方法來測(cè)試神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)特性的任何化合物。 所述候選化合物包括但不限于天然存在的物質(zhì)、合成的化合物或提取物，例如植物或動(dòng)物 組織、真菌或細(xì)菌的提取物?？梢詥为?dú)測(cè)試所述候選化合物或可與其它候選化合物或已知 的神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物組合測(cè)試，以觀測(cè)協(xié)同效應(yīng)或達(dá)到更高通量的化合物篩選。
[0026] 在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括提供ADSC的陰性對(duì)照培養(yǎng)物，用于與候 選化合物進(jìn)行比較。因此，所述方法進(jìn)一步包括在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)ADSC，確 定在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度，和將在所述候選化合物存 在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā) 生程度進(jìn)行比較。與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度相比，在所 述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度增加，表明所述候選化合物是神經(jīng)發(fā) 生-促進(jìn)化合物。另一方面，與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度 相比，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度減少，表明所述候選化合物 是神經(jīng)發(fā)生-抑制化合物。陰性對(duì)照培養(yǎng)物提供了所述候選化合物的神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)性質(zhì)的 額外的相關(guān)信息。
[0027] 在其它實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括提供陽性對(duì)照培養(yǎng)物。因此，所述方法進(jìn) 一步包括在已知神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合物存在時(shí)培養(yǎng)ADSC，和確定在所述神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化 合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度。例如，DHA已知能促進(jìn)早期腦發(fā)育并且可用作 陽性對(duì)照。因此，所述方法可以進(jìn)一步包括在DHA存在時(shí)培養(yǎng)ADSC。與在DHA存在時(shí)培養(yǎng) 的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度相比，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度 增加，表明所述候選化合物是優(yōu)于DHA的神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合物。
[0028] 在神經(jīng)發(fā)生期間，ADSC可以分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞的祖細(xì)胞和具有神經(jīng) 元性能的細(xì)胞。因此，神經(jīng)發(fā)生程度可通過觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化而確定。指示神經(jīng)發(fā)生的 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化包括但不限于細(xì)胞質(zhì)收縮、神經(jīng)突形成、樹突樣突出形成、軸突形成或其 組合。指示神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的其它變化包括類似于兩極、三極和多極神經(jīng)元細(xì)胞的 形態(tài)學(xué)發(fā)育。
[0029] 前述細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化可通過顯微鏡技術(shù)例如通過相差顯微術(shù)來觀測(cè)。ADSC的相 差顯微術(shù)圖像可在ADSC培養(yǎng)期間多次采集。例如，可在與候選化合物培養(yǎng)之前、在加入候 選化合物之后一次或多次例如之后3小時(shí)、和此后每天一次采集圖像。
[0030] 神經(jīng)發(fā)生程度可以進(jìn)一步通過測(cè)定顯示神經(jīng)元分化的ADSC百分率和細(xì)胞中的細(xì) 胞質(zhì)突出例如神經(jīng)突、軸突和樹突的長(zhǎng)度而確定?？墒褂镁哂泻线m插件的Image J開放軟 件測(cè)定顯示神經(jīng)元分化的ADSC百分率和細(xì)胞質(zhì)突出的長(zhǎng)度。
[0031] 在神經(jīng)發(fā)生期間發(fā)生細(xì)胞生物標(biāo)記的變化。因此，在某些實(shí)施方案中，神經(jīng)元標(biāo)記 的細(xì)胞表達(dá)研究用于確定神經(jīng)發(fā)生程度。這樣的生物標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)例如 神經(jīng)絲、髓鞘堿性蛋白、巢蛋白、β-ΙΙΙ微管蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP)、S100 (-種 鈣結(jié)合蛋白）、微管相關(guān)蛋白2 (MAP2)、CNPase和GABA受體。確定神經(jīng)元分化的其它技術(shù) 包括神經(jīng)元標(biāo)記的免疫組織染色、神經(jīng)元興奮性測(cè)定和用于神經(jīng)蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。
[0032] 在某些實(shí)施方案中，所述ADSC是人脂肪衍生的干細(xì)胞（hADSC)。hADSC可以有利 地維持在培養(yǎng)基中并且容易傳代，以提供多個(gè)傳代培養(yǎng)物。此外，hADSC容易得到，因?yàn)樗?們可分離自在常規(guī)抽脂術(shù)期間采集的人脂肪組織并可冷凍保存。hADSC具有容易得自個(gè)體 患者的額外優(yōu)勢(shì)。這樣獲得的hADSC可用于本文所述的方法以篩選候選化合物，用于個(gè)性 化使用。因此，使用本公開內(nèi)容的方法可以實(shí)現(xiàn)個(gè)性化和優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)、藥物治療或?qū)ι窠?jīng)毒素 的敏感性的測(cè)定。
[0033] 可以培養(yǎng)ADSC足以發(fā)生神經(jīng)發(fā)生的時(shí)間。神經(jīng)發(fā)生可在不同時(shí)間觀測(cè)，這取決于 所測(cè)的腦營(yíng)養(yǎng)素。因此，在某些實(shí)施方案中，神經(jīng)發(fā)生可以在培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后觀測(cè)，而在其它 實(shí)施方案中，神經(jīng)發(fā)生可以在培養(yǎng)若干天后觀測(cè)。例如，ADSC可以培養(yǎng)大約1小時(shí)至大約5 天、大約1小時(shí)至大約3天、大約3小時(shí)至大約36小時(shí)、大約12小時(shí)至大約24小時(shí)、或大 約24至大約36小時(shí)。此外，ADSC的培養(yǎng)可以持續(xù)1、2、3或4周，以達(dá)到更完全的神經(jīng)元 分化。ADSC的培養(yǎng)可以進(jìn)一步在升高的溫度例如高于室溫的溫度下進(jìn)行。這樣的溫度包括 大約25至大約45°C、大約30至大約40°C、或大約37°C。
[0034] 在前述方法中，ADSC可以在支持或促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生（例如通過引導(dǎo)ADSC分化為神 經(jīng)元細(xì)胞）的培養(yǎng)基中有利地培養(yǎng)。在某些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、 表皮生長(zhǎng)因子（EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子b-FGF、N2補(bǔ)充物和L-谷氨酰胺。培養(yǎng)基 的成分是市售來源可得的。例如，神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是Neurobasal?培養(yǎng)基，其可得自 Invitrogen。神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基?可包括下表1所列出的成分： 表 1 :Neurobasal? 培養(yǎng)基
【權(quán)利要求】
1. 用于鑒定神經(jīng)發(fā)生-調(diào)節(jié)化合物的方法，包括： 在候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)脂肪衍生的干細(xì)胞（ADSC);和 確定ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度。
2. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括： 在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)ADSC， 確定在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度，和 將在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度與在所述候選化合物不存 在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度進(jìn)行比較。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生 程度相比，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度增加，表明所述候選化 合物是神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合物。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中與在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生 程度相比，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度減少，表明所述候選化 合物是神經(jīng)發(fā)生-抑制化合物。
5. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括： 在二十二碳六烯酸（DHA)存在時(shí)培養(yǎng)ADSC， 確定在DHA存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC的神經(jīng)發(fā)生程度；和 將在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度與在DHA存在時(shí)培養(yǎng)的 ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度進(jìn)行比較，其中與在DHA存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度相 t匕，在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)的ADSC中的神經(jīng)發(fā)生程度增加，表明所述候選化合物是 神經(jīng)發(fā)生-促進(jìn)化合物。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)發(fā)生程度通過觀測(cè)ADSC的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化而確定。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化是細(xì)胞質(zhì)收縮、神經(jīng)突形成、樹突樣突 出的形成、軸突形成或其組合。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化通過顯微鏡術(shù)觀測(cè)。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化通過相差顯微術(shù)觀測(cè)。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪衍生的干細(xì)胞是人脂肪衍生的干細(xì)胞（hADSC)。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述ADSC在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)大約1至大約5 天。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述ADSC在包含神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、EGF、b-FGF、N2補(bǔ)充物 和L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
13. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括：在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)胞之前，在 啟動(dòng)培養(yǎng)基中啟動(dòng)ADSC大約1至大約5天。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述啟動(dòng)培養(yǎng)基包含神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、EGF、b-FGF和N2 補(bǔ)充物。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中所述ADSC在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)大約1至大約 5天。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述ADSC在包含完全MesenPRO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞在包被有多聚-L-鳥氨酸和牛血漿纖連蛋白的 培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。
18. 促進(jìn)ADSC中的神經(jīng)發(fā)生的方法，包括： 在神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)化合物存在時(shí)培養(yǎng)ADSC。
19. 用于培養(yǎng)干細(xì)胞的系統(tǒng)，包括： 干細(xì)胞； 干細(xì)胞的培養(yǎng)器皿，所述培養(yǎng)器皿上已包被包含多聚-L-鳥氨酸和牛纖連蛋白的涂 層；和 培養(yǎng)基。
20. 權(quán)利要求19的系統(tǒng)，進(jìn)一步包含啟動(dòng)培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK104285147SQ201380011780
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】C.鄺, Y.肖, Z.朱尼, E.K.佩爾斯, D.洪曼 申請(qǐng)人:Mjn 美國(guó)控股有限責(zé)任公司