用于檢測多特異性結合物的結合搭檔的方法

用于檢測多特異性結合物的結合搭檔的方法
【專利摘要】本發明報道了用于檢測樣品中的多特異性抗體的游離抗原的方法，其中待檢測的抗原可以被多特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括步驟：孵育包含游離抗原和多特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固相結合。
【專利說明】用于檢測多特異性結合物的結合搭檔的方法
[0001] 本發明涉及用于檢測/確定樣品中的游離的（即，未復合的）多特異性結合物 的結合搭檔的方法，所述結合搭檔（binding partner)可以被樣品中的多特異性結合物 (multispecific binder)特異性結合，其中在檢測游離的結合搭檔之前，從樣品中耗盡了與 多特異性結合物結合的結合搭檔。耗盡的多特異性結合物可用于檢測/確定復合的結合搭 檔。
[0002] 發明背景
[0003] 含有抗體的標準固相免疫測定涉及在固相上吸附/固定的抗體（捕獲抗體）、抗 原和針對與酶或可檢測的標記（示蹤抗體）綴合的抗原的另一表位的抗體之間形成復合 物。在測定中，形成夾心物（sandwich):固相/捕獲抗體/抗原/示蹤抗體。在夾心物等 催化的反應中，抗體-綴合酶的活性與孵育基質中的抗原濃度成比例。抗獨特型抗體測定 提及在例如US5,219,730 ;TO87/002778;EP0 139 389和EP0 170 302 中。Wadhwa，M·等人 (J. Immunol. Methods278 (2003) 1-17)報道了用于檢測、測量和表征由生物治療劑誘導的不 理想抗體的對策。EP1 917 854中報道了用于生產抗獨特型抗體的方法。
[0004] Chen，Υ· -P.等人（Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725)報道了通過同時針 對人紅細胞和乙肝病毒表面抗原的雙特異性雙抗體介導的凝集測定快速檢測乙肝病毒 表面抗原。Porter，R.等報道了利用自我裝配的單層修飾電極的電活性免疫測定系統 (EASI 測定）（Biosensors Bioelec· 16(2001)9-12)。Berkova，，N.等（Biotechnol.Appl. Biochem. 23(1996) 163-171)報道了利用hTNF-α和辣根過氧化物酶的雙特異性抗體，測量 人腫瘤壞死因子-a(hTNF-a)的酶免疫測定法的發展。在ΕΡ0 962 771中，還報道了用 于相同目的的檢測裝置和方法。Reinhartz，H.W.等（Analystl21 (1996) 767-771)報道了 通過實時相互作用分析研究的雙特異性多價抗體，用于研發抗原-抑制的酶聯免疫吸附測 定。Doppalapudi，V.R.等（Proc.Natl.Acad.Sci. 107(2010)22611-22616)報道了化學生 成雙特異性抗體。
[0005] 發明概沭
[0006] 本文報道了用于檢測樣品中的游離（S卩，未復合的）結合搭檔的存在，或用于確定 樣品中的游離（即，未復合的）結合搭檔的量的方法，所述結合搭檔可以被多特異性結合物 至少一個結合特異性，即，第一結合特異性特異的結合。
[0007] 已發現，在確定游離的結合搭檔的量之前，從樣品中耗盡被多特異性結合物特異 的結合的結合搭檔，即，結合搭檔-多特異性結合物-復合物，是有利的。
[0008] 本文報道的方法通過如下孵育樣品，實現耗盡多特異性結合物，所述樣品或者與 結合搭檔（即，第二結合搭檔）孵育，所述結合搭檔可以被多特異性結合物的不同（即，第 二）結合特異性所特異的結合，所述結合特異性不結合待確定的結合搭檔（即，第一結合搭 檔）；所述樣品或者與單特異性結合物結合，所述單特異性結合物特異的結合多特異性結 合物的一個結合特異性，借此，單特異性結合物特異結合多特異性結合物的結合特異性，該 結合特異性不結合待確定的結合搭檔（參見圖2)。
[0009] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中的雙特異性抗體的（第一）抗原的存在和 /或量的體外方法，借此待檢測的抗原可以被雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合， 從而使抗原與雙特異性抗體復合（抗原-雙特異性抗體-復合物），包括步驟：
[0010]-孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異 的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固 相結合。
[0011] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0012] -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異 的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固 相結合，和
[0013] -檢測抗原-雙特異性抗體-抗獨特型抗體的復合物，從而確定雙特異性抗體的抗 原的存在和/或量。
[0014] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0015] -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異 的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固 相結合，和
[0016] -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特 異的結合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量。
[0017] 在一個實施方案中，方法用于確定與雙特異性抗體復合的雙特異性抗體的抗原的 存在和/或量。
[0018] 在一個實施方案中，方法包括下列步驟：
[0019] -提供包含抗原和雙特異性抗體的樣品，其中至少90%的抗原與雙特異性抗體復 合，
[0020] -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異 的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固 相結合，和
[0021] -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特 異的結合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量。
[0022] 在一個實施方案中，方法包括下列步驟：
[0023] -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與一定量的雙特異性抗體，以提供其中至 少90%的抗原被雙特異性抗體復合的樣品，
[0024] -孵育包含被雙特異性抗體復合的抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗 體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗 體被固相結合，和
[0025] -孵育在前一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特 異的結合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量。
[0026] 在一個實施方案中，雙特異性抗體的量為約1 μ g/ml至10 μ g/ml，優選約1. 5 μ g/ ml 〇
[0027] 在一個實施方案中，雙特異性抗體的量是lmg/ml樣品。
[0028] 在一個實施方案中，至少95%的抗原是與雙特異性抗體復合的。在一個實施方案 中，至少98%的抗原是與雙特異性抗體復合的。
[0029] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中的雙特異性抗體的結合抗體的（第一）抗 原的量的體外方法，借此抗原可以被雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括步 驟：
[0030] -孵育第一等份的包含抗原和雙特異性抗體的樣品與一定量的雙特異性抗體，以 提供其中至少90%的抗原被雙特異性抗體復合的樣品，
[0031] -孵育包含被雙特異性抗體復合的抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗 體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗 體被固相結合，和
[0032] -孵育在前一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特 異的結合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量，和確定樣 品中存在的抗原總量，
[0033] -孵育第二等份的包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特 型抗體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特 型抗體被固相結合，和
[0034]-孵育形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特異的結合抗 原的抗體，從而確定樣品中存在的雙特異性抗體的游離抗原的量，和
[0035] -通過在樣品中存在的抗原總量與樣品中存在的游離抗原的量之間的差異，確定 雙特異性抗體的抗體結合型抗原的量。
[0036] 在一個實施方案中，雙特異性抗體的量為約1 μ g/ml至10 μ g/ml，優選約1. 5 μ g/ ml 〇
[0037] 在一個實施方案中，雙特異性抗體的量是lmg/ml樣品。
[0038] 本文報道的一個方面是用于體外確定結合搭檔（抗原、靶、被分析物）的存在和/ 或量的方法，所述結合搭檔可以被多特異性結合物的第一結合特異性特異的結合，其中，在 檢測結合搭檔前，通過孵育樣品與第二結合搭檔或特異結合多特異性結合物的第二結合特 異性的單特異性結合物，耗盡存在于樣品中的與多特異性結合物結合的結合搭檔部分，所 述第二結合搭檔可以被多特異性結合物的第二結合特異性特異的結合。
[0039] 在一個實施方案中，待檢測的結合搭檔是未復合的結合搭檔或游離結合搭檔。
[0040] 因此，本文報道的一個方面是用于確定多特異性結合物的（第一）結合搭檔的存 在和/或量的體外方法，其中所述結合搭檔可以被多特異性結合物的第一結合特異性特異 的結合，包括步驟：
[0041] -孵育包含（第一）結合搭檔和多特異性結合物的樣品與第二結合搭檔，所述第二 結合搭檔可以被多特異性結合物的不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合。
[0042] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0043]-孵育包含（第一）結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單 特異性結合物特異結合多特異性結合物的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，和
[0044] -確定耗盡了多特異性結合物的樣品中的（游離的第一）結合搭檔的量。
[0045] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0046] -孵育包含（第一）結合搭檔和多特異性結合物的樣品與單特異性結合物，所述單 特異性結合物特異結合多特異性結合物的不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異，
[0047]-在確定游離結合搭檔的存在或量之前，從樣品中耗盡單特異性結合物-多特異 性結合物復合物，和
[0048]-確定耗盡了多特異性結合物的樣品中的（游離的第一）結合搭檔的量。
[0049] 通過與被多特異性結合物的第二結合特異性特異結合的第二結合搭檔孵育，從樣 品中去除/耗盡多特異性結合物。同時，還從樣品中去除（第一）結合搭檔-多特異性結 合物-復合物。
[0050] 在一個實施方案中，多特異性結合物選自抗體、包含抗體或抗體片段與非抗體多 肽的融合多肽，包含抗體或抗體片段與可溶性受體的融合多肽，或包含抗體或抗體片段與 肽結合分子的融合多肽。
[0051] 在一個實施方案中，多特異性結合物是抗體。在一個實施方案中，抗體是雙特異性 抗體，或三特異性抗體，或四特異性抗體，或五特異性抗體，或六特異性抗體。在一個實施方 案中，抗體是雙特異性抗體。
[0052] 在一個實施方案中，單特異性結合物是抗獨特型抗體。
[0053] 在一個實施方案中，結合特異性是結合位點或成對的抗體重鏈可變結構域和抗體 輕鏈可變結構域。
[0054] 在一個實施方案中，第二結合搭檔或單特異性結合物是與固相結合的。
[0055] 在一個實施方案中，第二結合搭檔是生物素化的，而固相包被了鏈霉抗生物素。在 一個實施方案中，固相是包被了鏈霉抗生物素的順磁珠或包被了鏈霉抗生物素的瓊脂糖 珠。
[0056] 本文報道的一個方面是使用免疫測定用于免疫學確定樣品中的多特異性結合物 的結合搭檔的存在和/或量的方法，其中在確定結合搭檔之前，從樣品中耗盡多特異性結 合物。
[0057] 在本文報道的所有方面的一個實施方案中，結合搭檔是游離結合搭檔，S卩，結合搭 檔沒有被多特異性結合物結合或復合。
[0058] 在一個實施方案中，第二結合搭檔是生物素化的第二結合搭檔，并通過鏈霉抗生 物素與固相綴合。
[0059] 在本文報道的方法的一個實施方案中，第二結合搭檔是包含至少兩種第二結合搭 檔的混合物，所述至少兩種第二結合搭檔與固相綴合的位點不同。在一個實施方案中，位點 是第二結合搭檔的氨基酸序列的氨基酸位置。
[0060] 在一個實施方案中，第一結合搭檔是多肽。
[0061] 在一個實施方案中，第二結合搭檔是多肽。
[0062] 在一個實施方案中，多肽與其綴合搭檔的綴合是通過化學結合來實施的，所述化 學結合經由N-末端和/或ε-氨基（賴氨酸），不同賴氨酸的ε-氨基，多肽的氨基酸骨架 的羧基_、巰基_、羥基-和/或酚-官能團，和/或多肽的碳水化合物結構的糖醇基。
[0063] 在一個實施方案中，第二結合搭檔是這樣的混合物，其包含通過至少兩種不同的 氨基與固相綴合的第二結合搭檔。這類通過不同氨基的偶聯可以通過如下實施：第一步， ε_氨基的一部分與化學保護劑酰基化，例如通過朽1康酰化（citraconylation)。在第二 步，通過剩余氨基實施綴合。之后，去除檸康酰化作用，結合搭檔通過剩余的游離氨基與固 相綴合，即，獲得的結合搭檔通過未被檸康酰化保護的氨基與固相綴合。合適的化學保護劑 在未保護的側鏈胺上形成鍵，與N-末端的鍵不同且較不穩定。許多這類化學保護劑是已知 的（參見例如EPO 651 761)。在一個實施方案中，化學保護劑包括環狀二羧酸酸酐，例如馬 來酸酐或檸康酸酐。
[0064] 在一個實施方案中，第二結合搭檔通過被動吸附與固相綴合。被動吸附是例如 Butler，J.E.在 "Solid Phases in Immunoassay"（1996) 205-225 和 Diamandis，E.P.和 Christopoulos，T.K.(編者）在 "Immunoassay"（1996) Academic Press (San Diego)中描 述的。
[0065] 在一個實施方案中，第二結合搭檔通過特定的結合對綴合（固定）。在一個實施 方案中，這類結合對（第一組分/第二組分）選自鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物 素、抗體 / 抗原（參見例如，Hermanson，G.T.等人，Bioconjugate Techniques，Academic Press (1996))、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/ 蛋白A和/或G等。在一個實施方案中，第二結合搭檔與生物素綴合，且通過固定的抗生物 素蛋白或鏈霉抗生物素實施固定。
[0066] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中的多特異性抗體的（第一）抗原的存在和 /或量的方法，其中待檢測的抗原可以被多特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括 步驟：
[0067]-孵育包含多特異性抗體、結合了多特異性抗體的（第一）抗原和游離（第一）抗 原的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被多特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二 結合特異性特異的結合。
[0068] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0069]-孵育包含多特異性抗體、結合了多特異性抗體的（第一）抗原和游離（第一）抗 原的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被多特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二 結合特異性特異的結合，和
[0070] -確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的（第一）抗原的量。
[0071] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0072] -孵育包含（第一）抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被 多特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，
[0073] -在確定游離抗原的存在或量之前，從樣品中耗盡第二抗原-多特異性抗體復合 物，和
[0074]-確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的（第一）抗原的量。
[0075] 通過與可以被多特異性抗體的第二結合特異性特異結合的第二抗原孵育，從樣品 中去除多特異性抗體。同時，還從樣品中去除（第一）抗原-多特異性抗體-復合物。
[0076] 在一個實施方案中，樣品包括多特異性抗體、游離（第一）抗原和多特異性抗 體-抗原復合物，檢測多特異性抗體的游離（第一）抗原。
[0077] 在一個實施方案中，第二抗原是與順磁珠綴合的。
[0078] 在一個實施方案中，第二抗原是與固相綴合的。
[0079] 在一個實施方案中，第二抗原是生物素化的，而固相包被了鏈霉抗生物素。在一個 實施方案中，固相是包被了鏈霉抗生物素的順磁珠或包被了鏈霉抗生物素的瓊脂糖珠。
[0080] 在一個實施方案中，結合特異性是結合位點。在一個實施方案中，結合位點是成對 的抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
[0081] 在一個實施方案中，方法包括下列步驟：
[0082] -孵育包含多特異性抗體、結合多特異性抗體的（第一）抗原和游離（第一）抗原 的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被多特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結 合特異性特異的結合，形成第二抗原-多特異性抗體復合物，和
[0083]-從樣品中去除第二抗原-多特異性抗體復合物。
[0084]在一個實施方案中，第二抗原-多特異性抗體復合物是第二抗原-多特異性抗體 復合物和第二抗原-多特異性抗體_(第一）抗原復合物的混合物。
[0085] 在一個實施方案中，方法包括下列步驟：
[0086]-孵育包含（第一）抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被 多特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，形成第二抗原-多 特異性抗體復合物，和
[0087]-從樣品中去除第二抗原-多特異性抗體復合物，和 [0088]-確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的（第一）抗原的量。
[0089] 在一個實施方案中，確定（第一）抗原的量包括下列步驟：
[0090] -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，所述捕獲抗體特異的結合（第一） 抗原，形成捕獲抗體_(第一）抗原復合物，和
[0091] -關聯形成的捕獲抗體-(第一）抗原復合物與樣品中的（第一）抗原的量。
[0092] 在一個實施方案中，確定（第一）抗原的量包括下列步驟：
[0093] -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，所述捕獲抗體特異的結合（第一） 抗原，形成捕獲抗體_(第一）抗原復合物，
[0094] -孵育捕獲抗體-(第一）抗原復合物與示蹤抗體，借此捕獲抗體和示蹤抗體結合 (第一）抗原上的非重疊表位，和
[0095] -關聯形成的捕獲抗體_(第一）抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量。
[0096] 在一個實施方案中，確定（第一）抗原的量包括下列步驟：
[0097] -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與捕獲抗體，所述捕獲抗體特異的結合（第一） 抗原，形成捕獲抗體_(第一）抗原復合物，
[0098] -孵育捕獲抗體-(第一）抗原復合物與示蹤抗體，借此捕獲抗體和示蹤抗體結合 (第一）抗原上的非重疊表位，
[0099] -孵育捕獲抗體_(第一）抗原-示蹤抗體復合物與包含可檢測標記的檢測抗體， 借此檢測抗體在示蹤抗體的可變結構域以外的表位上特異的結合示蹤抗體，和
[0100]-關聯形成的捕獲抗體_(第一）抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的（第一）抗原 的量。
[0101] 在一個實施方案中，多特異性抗體是具有第一結合特異性和第二結合特異性的雙 特異性抗體，所述第一結合特異性特異的結合第一抗原或抗原上的第一表位，所述第二結 合特異性特異的結合第二抗原或抗原上的第二表位。
[0102] 在一個實施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的抗原，第一結合特異性結合抗 原上的第一表位，第二結合特異性結合抗原上的第二表位，借此第二表位是與第一表位不 重疊的表位，而與第一結合特異性的結合不干擾與第二結合特異性結合。
[0103] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0104] -在確定（第一）抗原的存在或量之前，從樣品中耗盡形成的復合物。
[0105] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中的多特異性抗體的（第一）抗原的存在和 /或量的體外方法，借此待檢測的抗原可以被多特異性抗體的第一結合特異性特異的結合， 包括步驟：
[0106] -孵育包含（第一）抗原的樣品與雙特異性抗體和第二抗原的復合物或雙特異性 抗體和抗獨特型抗體的復合物，所述抗獨特型抗體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一 結合特異性的第二結合特異性。
[0107] 在一個實施方案中，第二抗原是標記的第二抗原。在一個實施方案中，第二抗原是 通過特定的結合對固定在固相上的。在一個實施方案中，特定的結合對是生物素和鏈霉抗 生物素。
[0108] 在一個實施方案中，方法包括以下步驟作為第二步驟：
[0109] -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特 異的結合第一抗原的抗體。
[0110] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中的雙特異性抗體的（第一）抗原的存在和 /或量的體外方法，其中待檢測的抗原可以被雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合， 包括步驟：
[0111] -孵育包含（第一）抗原的樣品與雙特異性抗體和第二抗原或雙特異性抗體和抗 獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二 結合特異性，其中第二抗原或抗獨特型抗體被固相結合。
[0112] 在一個實施方案中，方法包括以下步驟作為第二步驟：
[0113] -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特 異的結合第一抗原的抗體，借此確定樣品中的雙特異性抗體的（第一）抗原的量。
[0114] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中與雙特異性抗體復合的雙特異性抗體的 (第一）抗原（第一抗原-雙特異性抗體-復合物）的存在和/或量的體外方法，其中待檢 測的抗原可以被雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括步驟：
[0115] -孵育包含（第一）抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗 體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗 體被固相結合。
[0116] 在一個實施方案中，方法包括以下步驟作為第二步驟：
[0117] -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上 特異的結合第一抗原的抗體，借此確定樣品中與雙特異性抗體復合的雙特異性抗體的（第 一）抗原（第一抗原-雙特異性抗體-復合物）的量。
[0118] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0119] -在確定（第一）抗原的存在或量之前，從樣品中耗盡形成的復合物。
[0120] 發明詳沭
[0121] 本文報道了用于預處理樣品，檢測臨床前和臨床樣品中的多特異性結合物的"游 離和/或總結合搭檔"的體外方法，所述多特異性結合物例如雙特異性抗體/藥物。
[0122] 已發現在檢測游離結合搭檔之前，從樣品中耗盡多特異性結合物是有利的。
[0123] 已發現為了將樣品中幾乎所有的結合搭檔轉化為所定義的復合物，孵育樣品和樣 品的多特異性結合物是有利的。
[0124] 已發現使用抗獨特型抗體捕獲多特異性結合物是有利的。
[0125] 本文報道了可以被治療性多特異性抗體的第二結合特異性特異結合的第二結合 搭檔的用途，用于確定（游離的第一）抗原的水平，所述抗原能夠但尚未被多特異性治療 性抗體的第一結合特異性結合。第二抗原用于從樣品中耗盡多特異性抗體和多特異性抗 體-待檢測抗原-復合物。
[0126] 因此，本文報道了用于確定多特異性結合物的游離（第一）結合搭檔（抗原、靶 和被分析物）的體外方法，所述游離結合搭檔可以被多特異性結合物的第一結合特異性 特異性地結合，其中在確定游離結合搭檔之前，通過孵育樣品和能夠被多特異性結合物的 第二結合特異性所特異性結合的并且隨之從樣品中耗盡多特異性結合物和多特異性結合 物_(第一）結合搭檔-復合物的第二結合搭檔，從樣品中耗盡多特異性結合物，其中第二 結合特異性不同于第一結合特異性。
[0127] 在下文中，用這樣的多特異性抗體和抗原示例本文報道的方法，作為多特異性結 合物的實施方案，所述多特異性抗體特異性結合多種抗原或相同抗原上的多個表位，作為 (第一）結合搭檔的實施方案，所述（第一）抗原被多特異性抗體的第一結合特異性特異的 結合。
[0128] 本文中的術語"抗體"是廣義使用的，涵蓋了各種抗體結構，包括但不限于單克隆 抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）和抗體片段，只要其表現出理想的 抗原結合活性。
[0129] 在某些實施方案中，抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對 至少兩個不同的位點具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，一個結合特異性 是針對第一抗原的，另一個結合特異性是針對不同的第二抗原的。在某些實施方案中，雙特 異性抗體可以結合相同抗原的2個不同的表位。雙特異性抗體可以被制備為全長抗體或抗 體片段。在一個實施方案中，抗體是特異性結合第一和第二抗原的雙特異性抗體。在一個 實施方案中，雙特異性抗體具有i)特異性結合第一抗原或抗原上的第一表位的第一結合 特異性，和ii)特異性結合第二抗原或相同抗原上的第二表位的第二結合特異性。在一個 實施方案中，相同抗原上的第二表位是不重疊的表位。
[0130] 多特異性抗體描述在 W02009/080251、W02009/080252、W02009/080253、 W02009/080254、W02010/112193、W02010/115589、W02010/136172、W02010/145792 或 W02010/145793 中。
[0131] "抗體片段"指不同于完整抗體的分子，所述分子包括完整抗體的一部分，該部分 結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab' -SH、 F(ab' )2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性 抗體。
[0132] 抗體的"類"指抗體重鏈具有的恒定結構域或恒定區的類型。有五大類抗體：IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，其中若干可進一步分為亞類（同種型），例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG 4、 ^?和^、。與不同類型的免疫球蛋白對應的重鏈恒定結構域分別被稱為α、δ、ε、Y 和μ。
[0133] 術語"游離抗原"表示這樣的抗原，其可以被抗體的結合特異性特異的結合，但目 前還沒有結合該結合特異性。在一個實施方案中，游離抗原是未結合抗體的抗原或未與抗 體復合的抗原。
[0134] 術語"Fc_區"在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區域，其含有恒定區 的至少一部分。術語包括天然序列Fc-區和變體Fc-區。在一個實施方案中，人IgG重 鏈Fc-區從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基末端。然而，Fc-區的C-末端賴氨酸 (Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外說明，否則Fc-區或恒定區的氨基酸殘基編號 是根據EU編號系統的，也被稱為EU指數，如Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIH Publication91_3242。
[0135] "框架"或"FR"指除超變區（HVR)殘基以外的可變結構域殘基。可變結構域的FR 一般由4個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般出現在VH(或 VL)的下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0136] "人抗體"是具有這樣的氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對應于由人或人細胞 生產的抗體的氨基酸序列，或源自利用人抗體儲庫或其他人抗體編碼序列的來自非人來源 的抗體的氨基酸序列。人抗體的這一定義具體排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗 體。
[0137] "人源化"抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌 合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個，通常2個可變結構 域，其中所有的或基本上所有的HVR(例如CDR)對應于非人抗體的HVR，而所有的或基本上 所有的FR對應于人抗體的FR。人源化抗體任選的可包括至少一部分源自人抗體的抗體恒 定區。抗體的"人源化形態"，例如非人抗體，指經過了人源化作用的抗體。
[0138] 如本文中使用的，術語"超變區"或"HVR"指抗體可變結構域中序列高度變化和/ 或形成結構定義的環（"超變環"）的每個區域。一般而言，天然的四鏈抗體包括6個HVR; 3個在VH中（H1、H2、H3)，3個在VL中（L1、L2、L3)。HVR -般包括來自超變環和/或來 自"互補決定區"（CDR)的氨基酸殘基，后者具有最高的序列可變性和/或參與抗原識別。 示例性的超變環出現在第26-32位（L1)、第50-52位（L2)、第91-96位（L3)、第26-32位 (H1)、第 53-55 位（H2)和第 96-101 位（H3)氨基酸殘基（Chothia，C.和 Lesk，A. M.，J. Mol. Biol. 196(1987)901-917)。示例性 CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3) 出現在LI的第24-34位、L2的第50-56位、L3的第89-97位、HI的第31-35B位、H2的 第 50-65 位和 H3 的第 95-102 位氛基酸殘基（Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication91-3242)。除了 VH 中的 CDR1 外，CDR-般包 括形成超變環的氨基酸殘基。CDR還包括"特異性決定殘基"或"SDR"，是接觸抗原的殘基。 包含在CDR區域中的SDR被稱為縮寫-CDR或a-CDR。示例性a-CDR(a-CDR-Ll、a-CDR-L2、 a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2 和 a-CDR-H3)出現在 L1 的第 31-34 位、L2 的第 50-55 位、 L3的第89-96位、HI的第31-35B位、H2的第50-58位和H3的第95-102位氨基酸殘基 (Almagro，J.C.和 Fransson，J.，Front. Biosci. 13(2008) 1619-1633)。除非另外指出，否 則可變結構域中的HVR殘基和其他殘基（例如，FR殘基）在本文中是根據Kabat等人，見 上文編號的。
[0139] 如本文中使用的，術語"單克隆抗體"指從基本上均質的抗體群體中獲得的抗體， 艮P，除可能的變體抗體外，包含在群體中的單個抗體是相同的和/或結合相同表位，例如含 有天然存在的突變或在生產單克隆抗體制品的過程中產生的突變，這類變體一般只以微量 存在。與通常包括針對不同決定子（表位）的不同抗體的多克隆抗體制品相反，單克隆抗 體制品的每個單克隆抗體都針對抗原上的單個決定子。因此，修飾詞"單克隆"表示從基本 均質的抗體群體中獲得的抗體的特征，而不被視為要求通過任何特定的方法生產抗體。例 如，本發明使用的單克隆抗體可以通過多種技術制備，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA 方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法， 本文中描述了這類方法和其他用于制備單克隆抗體的示例性方法。
[0140] "多肽"是由通過肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，不論其是天然或合成產生的。 少于約20個氨基酸殘基的多肽可以被稱為"肽"，而由2個或多個多肽組成的分子，或者包 含一個多于1〇〇個氨基酸殘基的多肽的分子可以被稱為"蛋白質"。多肽還可以包含非氨 基酸組分，如碳水化合物基團、金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可以由表達多肽的細胞添 力口，并可隨細胞類型改變。在本文中，按照多肽的氨基酸骨架的結構或編碼其的核酸定義多 肽。一般不具體指出添加物，如碳水化合物基團，但其可存在。
[0141] 術語"可變區"或"可變結構域"指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈的結 構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域（分別是VH和VL) -般具有相似的結構，每 個結構域包含4個保守的框架區（FR)和3個超變區（HVR)(參見例如Kindt，T. J.等人， Kuby Immunology，第 6 版，W. H. Freeman 和 Co. , Ν· Y. (2007)，第 91 頁）。單個 VH 或 VL 結 構域足以產生抗原-結合特異性。此外，可以使用結合抗原的抗體的VH或VL結構域，分別 篩選互補VL或VH結構域文庫，分離結合特定抗原的抗體（參見例如Portolano, S.等人， J. Immunol. 150(1993)880-887 ;Clackson，T.等人，Nature352 (1991) 624-628)。
[0142] 術語"抗獨特型抗體"表示特異性結合親本抗體的結合特異性（如結合位點）的 抗體，g卩，針對例如親本抗體的抗原結合位點。在一個實施方案中，抗獨特型抗體特異性結 合親本抗體的一個或多個CDR。在一個實施方案中，親本抗體是治療性抗體。在一個實施方 案中，親本抗體是多特異性抗體。在一個實施方案中，親本抗體是雙特異性抗體。
[0143] 如果通過表面等離振子共振（SPR)測定檢測到信號降低50%或更多，在一個實 施方案中，降低75%或更多，則兩個表位是重疊的，所述SPR使用固定的抗體和可溶性抗 原，或反之亦然，其中研究的表位的濃度是20-50nM，需要檢測表位重疊的抗體的濃度是 100nM。可選的，可以使用這樣的方法，其中結合相同抗原的兩個抗體的表位重疊是在競爭 性測試系統的幫助下確定的。出于該目的，例如在基于細胞的酶免疫測定（ELISA)的幫助 下，應用表達重組抗原表位的細胞，測試需要檢測表位重疊的抗體是否與其它抗體競爭結 合固定抗原。出于該目的，孵育固定抗原與標記形態的抗體和需要確定表位重疊的過量抗 體。通過檢測結合的標記，可以簡單地驗證表位重疊。如果關于已知抗體，確定了在相同濃 度下，信號降低大于70 %，在一個實施方案中，降低大于80 %，或在更高濃度下（在一種情 形中，105-倍過量的需要被測定表位重疊的抗體），替換大于80%，在一個實施方案中，替換 大于90%，貝U存在表位一致性或重疊，且兩種抗體結合相同抗原上相同的或重疊的表位。
[0144] 不同的免疫測定的原則描述在例如Hage，D. S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R) 中。Lu，B.等人（Analystl21 (1996)29R-32R)報道了定向固定抗體，用于免疫測定。例如 Wilchek，M.，和 Bayer，E.A.，在 Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469 報道了抗生物素蛋 白-生物素-介導的免疫測定。
[0145] 多肽和單克隆抗體及其恒定結構域含有多個反應性氨基酸側鏈，用于偶聯結合 搭檔，如表面、蛋白質、聚合物（例如，PEG、纖維素或聚苯乙烯）、酶或結合對的成員。氨基 酸的化學反應基是例如氨基（賴氨酸、α -氨基）、巰基（胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸）、 羧酸基（天冬氨酸、谷氨酸）和糖醇基。這類方法描述在例如Aslam Μ.和Dent，Α.的 "Bioconjugation"，MacMillan Ref. Ltd. 1999,第 50-100 頁中。
[0146] 最常見的多肽和抗體的反應基團之一是氨基酸賴氨酸的脂肪族胺。一般而 言，幾乎所有的多肽和抗體都含有豐富的賴氨酸。在高于ΡΗ8.0時（pK a = 9. 18)，賴氨酸胺 是相當好的親核基團，因此簡單完全的與多種試劑反應，形成穩定的鍵。胺-反應試劑主要 與賴氨酸和蛋白質的α-氨基反應。反應性酯，特別是N-羥基-琥珀酰亞胺（NHS)酯，是 最常應用的修飾胺基的試劑。用于在含水環境中反應的最佳pH是ρΗ8.0至9.0。異硫氰酸 鹽/酯是胺修飾試劑，與蛋白質形成硫脲鍵。它們在含水溶液中與蛋白質胺反應（最佳是 在pH9. 0至9. 5)。醛類在溫和的含水條件下與脂肪族或芳香族胺類、肼類和酰肼類反應，形 成亞胺中間物（希夫氏堿）。希夫氏堿可以用溫和的或強的還原劑（如硼氫化鈉或氰硼氫 化鈉）選擇性還原，衍生出穩定的烷基胺鍵。用于修飾胺類的其他試劑是酸酐。例如，二乙 烯三胺五乙酸酸酐（DTPA)是含有2個胺-反應性酸酐基的雙功能螯合劑。它可以與氨基 酸的N-末端和ε-氨基反應，形成酰胺鍵。打開酸酐環，生成多價的金屬螯合臂，其能夠與 配位復合物中的金屬緊密結合。
[0147] 多肽和抗體中另一種常見的反應基是來自含硫氨基酸--胱氨酸及其還原產物 半胱氨酸（或二分之一胱氨酸）的巰基殘基。半胱氨酸含有游離的巰基，比胺更親核，一般 是蛋白質中的最反應性官能團。巰基一般在中性pH下是反應性的，因此可以在存在胺的條 件下與其他分子選擇性偶聯。由于游離的巰基是相對反應性的，具有這些基團的蛋白質的 基團通常以二硫基或二硫鍵的氧化形態存在。在這類蛋白質中，用試劑如二硫蘇糖醇（DTT) 還原二硫鍵是生成反應性游離巰基必需的。巰基反應試劑是多肽上將偶聯巰基以形成硫醚 偶聯產物的試劑。這些試劑在弱酸性至中性pH下快速的反應，因此可以在存在胺基的條件 下選擇性反應。文獻報道了若干種硫醇化交聯劑的用途，如Traut試劑（2-亞氨基硫雜環 戊烷）、琥珀酰亞氨基（乙酰硫基）乙酸酯（SATA)和磺基琥珀酰亞氨基6-[3-(2-吡啶基二 硫基）丙酰胺基]己酸酯（Sulfo-LC-SPDP)，用于提供通過反應性氨基導入多個巰基的有效 方式。鹵乙酰基衍生物（例如碘乙酰胺）形成硫醚鍵，并且也是用于巰基修飾的試劑。其 他有效的試劑是馬來酰亞胺。馬來酰亞胺與巰基反應性試劑的反應基本上和與碘乙酰胺的 反應相同。馬來酰亞胺在弱酸性至中性pH下快速的反應。
[0148] 多肽和抗體中的另一類常見反應基是羧酸。多肽和抗體在C-末端位置上、在天冬 氨酸和谷氨酸的側鏈中含有羧酸基。羧酸在水中相對較低的反應性通常導致難以利用這類 基團選擇性的修飾多肽和抗體。當進行修飾時，通常利用水溶性碳二亞胺將羧酸基轉化為 反應性酯，并且所述羧酸基與親核試劑如胺、酰肼或肼反應。含胺的試劑應該是弱堿性的， 從而在存在賴氨酸的更強堿性的ε -氨基的條件下，與活化的羧酸選擇性反應，形成穩定 的酰胺鍵。當pH升高到高于8. 0時，可以發生蛋白質交聯。
[0149] 高碘酸鈉可用于將與抗體相連的碳水化合物部分中的糖的醇部分氧化為醛。每個 醛基可以與針對羧酸所述的胺、酰肼或肼反應。由于碳水化合物部分主要出現在抗體的可 結晶片段（Fc)區中，可以通過定點修飾遠離抗原結合位點的碳水化合物來實現綴合。形成 希夫氏堿中間物，可以通過用氰硼氫化鈉（溫和的和選擇性的）或硼氫化鈉（強）水溶性 還原劑還原中間物，將其還原成烷基胺。
[0150] 術語"樣品"包括但不限于來自活物或之前的活物的任意量的物質。這類活物包 括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他動物。在一個實施方案中，樣品獲得自猴子尤其食 蟹猴、或兔、或小鼠、或大鼠。在一個實施方案中，這類物質包括但不限于來自個體的全血、 血清或血漿，這是臨床常規中最普遍使用的樣品源。
[0151] 術語"固相"表示非液體的物質，包括由例如聚合物、金屬（順磁、鐵磁顆粒）、玻璃 和陶瓷的材料制成的顆粒（包括微粒和珠子）；凝膠物質，如硅石、礬土和聚合物凝膠；毛細 管，可由聚合物、金屬、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物質；電極；微滴定板；固體 條（stripe);和比色杯、試管或其他分光光度計的樣品容器。固相組分與惰性固體表面的 區別在于"固相"在其表面上含有至少一個部分預期與樣品中的物質相互作用。固相可以是 固定組分，如試管、條、比色杯或微滴定板，或者可以是不固定的組分，如珠子和微粒。可以 使用多種允許蛋白質和其他物質非共價或共價連接的微粒。這類顆粒包括聚合物顆粒，如 聚苯乙烯和聚（甲基丙烯酸酯）；金粒，如金納米顆粒和金膠體；以及陶瓷顆粒，如硅石、玻 璃和金屬氧化物顆粒。參見例如，Martin，C. R.等，Analytical Chemistry-News&Features， 70 (1998) 322A-327A，或 Butler，J. Ε·，Methods22 (2000) 4-23。
[0152] 在一個實施方案中，從色素原（熒光或發光的基團和染料）、酶、NMR-活性基、金 屬顆粒或半抗原（如地高辛配基）中選擇可檢測的標記。可檢測的標記還可以是可以光 可激活的交聯基團，例如，疊氮基或1H-氮雜環丙烯基。還在一個實施方案中，可以通過電 化學發光檢測的金屬螯合物是發出信號的基團，特別優選的是釕螯合物，例如，釕（雙吡 啶） 32+螯合物。合適的釕標記基團描述在例如EP0 580 979、W090/05301、W090/11511和 W092/14138 中。
[0153] 本文中報道了用于確定樣品中的多特異性抗體的（游離第一）抗原的存在和/或 量的方法，包括能被多特異性抗體的一個結合特異性特異結合的固相固定的第二抗原，所 述結合特異性不是多特異性抗體中特異性結合待確定的（游離第一）抗原的結合特異性， 用于在確定（游離第一）抗原的量之前，從樣品中耗盡復合形態的或非復合形態的多特異 性抗體。
[0154] 在一個實施方案中，方法包括在確定游離（第一）抗原的存在或量之前，從樣品中 耗盡第二抗原-多特異性抗體-復合物。
[0155] 在一個實施方案中，通過抗原橋接免疫測定法，確定耗盡了多特異性抗體的樣品 中的（游離第一）抗原的存在和/或量。在一個實施方案中，免疫測定法包括捕獲抗體和 示蹤抗體，其中捕獲抗體與固相綴合，而示蹤抗體與可檢測的標記綴合。
[0156] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中的多特異性抗體的（游離第一）抗原的存 在和/或量的體外方法，其中待檢測的抗原可以被多特異性抗體的第一結合特異性特異的 結合，包括步驟：
[0157] -孵育包含（第一）抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被 多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，從而從樣品中去除 多特異性抗體。
[0158] 本領域技術人員已知，由于熱動力學平衡，包含抗原和可以特異性結合抗原的抗 體的樣品包括游離抗原、結合抗體的抗原和游離抗體的混合物。
[0159] 在一個實施方案中，方法包括下列步驟：
[0160] -孵育包含（第一）抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被 多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，形成第二抗原-多 特異性抗體復合物，和
[0161] -從樣品中去除第二抗原-多特異性抗體復合物。
[0162] 在一個實施方案中，方法包括下列步驟：
[0163] -孵育包含（第一）抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被 多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，形成第二抗原-多 特異性抗體復合物，
[0164] -從樣品中去除第二抗原-多特異性抗體復合物，和
[0165] -確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的（第一）抗原的量。
[0166] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0167] -在確定游離（第一）抗原的存在或量之前，從樣品中耗盡第二抗原-多特異性抗 體-復合物。
[0168] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0169] -孵育包含（第一）抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被 多特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，
[0170] -在確定游離（第一）抗原的存在或量之前，從樣品中耗盡第二抗原-多特異性抗 體復合物，和
[0171] -確定耗盡了多特異性抗體的樣品中的（第一）抗原的量。
[0172] 在一個實施方案中，通過抗原橋接免疫測定法，確定（第一）抗原的存在和/或 量。
[0173] 在一個實施方案中，確定（第一）抗原的存在和/或量是確定游離（第一）抗原 的量。
[0174] 在一個實施方案中，確定（第一）抗原的存在和/或量包括下列步驟：
[0175] -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異結合（第一）抗原的捕獲抗體，形成捕獲 抗體-抗原復合物，和
[0176] -關聯所形成的捕獲抗體_(第一）抗原復合物的量與樣品中的抗原的量。
[0177] 在一個實施方案中，確定（第一）抗原的存在和/或量包括下列步驟：
[0178] -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異結合（第一）抗原的捕獲抗體，形成捕獲 抗體_(第一）抗原復合物，
[0179] -孵育捕獲抗體_(第一）抗原復合物與示蹤抗體，其中所述捕獲抗體和示蹤抗體 結合（第一）抗原上的非重疊表位，和
[0180] -關聯所形成的捕獲抗體_(第一）抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的（第一）抗 原的量。
[0181 ] 在一個實施方案中，示蹤抗體包括可檢測的標記。
[0182] 在一個實施方案中，確定（第一）抗原的存在和/或量包括下列步驟：
[0183] -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異結合（第一）抗原的捕獲抗體，形成捕獲 抗體_(第一）抗原復合物，
[0184] -孵育捕獲抗體_(第一）抗原復合物與示蹤抗體，其中所述捕獲抗體和示蹤抗體 結合（第一）抗原上的非重疊表位，
[0185] -孵育捕獲抗體_(第一）抗原-示蹤抗體復合物與包含可檢測標記的檢測抗體， 其中檢測抗體在示蹤抗體的可變結構域以外的表位上特異的結合示蹤抗體，和
[0186] -關聯所形成的捕獲抗體_(第一）抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的（第一）抗 原的量。
[0187] 在一個實施方案中，捕獲抗體和示蹤抗體結合位于（第一）抗原上的非重疊表位。
[0188] 在本文報道的方法的一個實施方案中，（第一）抗原是游離的（第一）抗原。
[0189] 在一個實施方案中，第二抗原和/或捕獲抗體是與固相綴合的。
[0190] 用于本文報道的方法中的第二抗原和/或捕獲抗體可以與固相綴合。在一個實 施方案中，綴合是通過化學結合來實施的，所述化學結合經由N-末端和/或ε_氨基（賴 氨酸）、不同賴氨酸的ε -氨基、抗原或抗體的氨基酸骨架的羧基-、巰基-、羥基-和/或 酚-官能團，和/或抗原和/或抗體的碳水化合物結構的糖醇基。在一個實施方案中，第二 抗原和/或捕獲抗體是至少兩種與固相綴合的第二抗原和/或抗體的混合物，其中至少兩 種與固相綴合的第二抗原和/或抗體與固相綴合的位點不同。例如，與固相綴合的至少兩 種第二抗原和/或兩種抗體的混合物可包括通過氨基酸骨架的氨基酸與固相的綴合，和通 過碳水化合物結構的糖醇基與固相的綴合。此外，例如，與固相綴合的至少兩種第二抗原和 /或兩種抗體的混合物可包括通過其氨基酸骨架的不同氨基酸殘基與固相綴合的第二抗原 和/或抗體。表述方式"不同的氨基酸殘基"表示兩種不同類型的氨基酸，如賴氨酸和天冬 氨酸，或酪氨酸和谷氨酸，或氨基酸骨架中在第二抗原和/或抗體氨基酸序列中不同位置 上的兩個氨基酸殘基。在后一種情況下，氨基酸可以是相同種類或不同種類的。表述方式 "抗體位點不同"表示位點類型的不同，例如氨基酸或糖醇基，或（例如第二抗原和/或抗體 與固相綴合的位置上）氨基酸骨架的氨基酸數不同。相同的應用也可以用于本文報道的方 法中使用的示蹤抗體。
[0191] 在方法的一個實施方案中，免疫測定包括捕獲抗體、示蹤抗體和檢測抗體，其中捕 獲抗體是針對通過鏈霉抗生物素與固相綴合的抗原的生物素化抗體，示蹤抗體是針對與地 高辛配基綴合的抗原的抗體，和檢測抗體是針對與辣根過氧化物酶綴合的地高辛配基的抗 體。
[0192] 用于從包含抗原X和/或抗原Υ的樣品中耗盡由特異結合抗原X和抗原Υ的雙特 異性抗體組成的復合物的一般方法（分別用于確定抗原X或抗原Υ)，包括下列步驟：
[0193] -裝配特異性結合抗原X和抗原Υ的雙特異性抗體（抗Χ/Υ抗體）的復合物：
[0194] 室溫孵育恒定濃度的抗原X與遞增量的雙特異性單克隆抗體1小時，所述抗體的 第一結合特異性特異的結合抗原X，第二結合特異性特異的結合抗原Υ(抗Χ/Υ抗體）。之 后，使用該樣品作為耗盡步驟中的陽性對照。
[0195] -耗盡步驟：
[0196] 為了耗盡與抗X/Y抗體結合的抗原X，將生物素化的抗原Y-BI與約10μ g/ml包被 了磁性鏈霉抗生物素的珠子（SA-beads)結合。每個樣品洗滌600μ1 SA-beads，并用磁性 分離器從上清液中分離。將600 μ 1含有生物素化的抗原Y的溶液與SA-beads混合，室溫 孵育約1小時。通過用磁性分離器洗滌珠子3次，去除過多的未結合的抗原。然后，孵育包 被了抗原Y的珠子和約250 μ 1含有抗X/Y抗體與抗原X的復合物的樣品。混合物在室溫 下孵育振蕩約1小時。在孵育后，用磁性分離器分離樣品與珠子。采集上清液用于在ELISA 中分析"游離"抗原X(參見例如實施例2)。將剩余的珠子轉移到ELECSYS容器中，根據標 準的用戶指導性操作規程，用ELECSYS2010分析儀分析與珠子結合的抗原X (結合雙特異性 抗體的抗原X)。
[0197] 為了耗盡與抗X/Y抗體結合的抗原Y，將生物素化的抗原X(X-BI)與約10 μ g/ml 包被了磁性鏈霉抗生物素的珠子（SA-beads)結合。每個樣品洗漆600 μ 1 SA-beads,并用 磁性分離器從上清液中分離。將600 μ 1含有生物素化的抗原X的溶液與SA-beads混合， 室溫孵育約1小時。通過用磁性分離器洗滌珠子3次，去除過多的未結合的抗原X。然后， 孵育抗原X珠子和約250 μ 1含有抗X/Y抗體與抗原Y的復合物的樣品。混合物在室溫下 孵育振蕩約1小時。在孵育后，用磁性分離器分離樣品與珠子。采集上清液用于在ELISA 中分析"游離"抗原Y(參見例如實施例2)。將剩余的珠子轉移到ELECSYS容器中，根據標 準的用戶指導性操作規程，用ELECSYS2010分析儀分析與珠子結合的抗原Y (結合雙特異性 抗體的抗原Y)。
[0198] 為了確定多特異性抗體在體內的藥物動力學特性，可以確定游離第一抗原、游離 第二抗原、游離多特異性抗體，以及多特異性抗體-第一和/或第二抗原-復合物的分布或 量。
[0199] 本文報道的一個方面是適用于確定雙特異性抗體的游離（第一）抗原的存在和/ 或量的體外方法，其中（第一）抗原可以被雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包 括步驟：
[0200]-孵育包含（第一）抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗 體特異的結合雙特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性。
[0201] 在一個實施方案中，方法包括步驟：
[0202] -孵育包含（第一）抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗 體特異的結合雙特異性抗體中不同于第一結合特異性的第二結合特異性，
[0203] -從樣品中去除抗獨特型抗體-雙特異性抗體復合物，和
[0204] -確定耗盡了雙特異性抗體的樣品中的抗原的量。
[0205] 抗獨特型抗體可以與固相結合。
[0206] 可以通過使用包含捕獲分子、示蹤分子和檢測分子的橋接測定的免疫學確定，實 施對雙特異性抗體的檢測。
[0207] 捕獲分子可以與固相結合。捕獲分子一般可以是雙特異性抗體的任何結合搭檔 (例如，一種抗原）、雙特異性抗體的一般性復合劑（例如，在全長抗體的情況下，是Fc_受 體或抗Fc_區抗體），或特異的結合雙特異性抗體的一個結合特異性的抗獨特型抗體。
[0208] 示蹤分子可以是多特異性結合物的任何結合搭檔（例如，雙特異性抗體的一種抗 原，但如果一種抗原用作捕獲分子，則使用不同抗原作為示蹤分子）、雙特異性抗體的一般 性復合劑（例如，在全長抗體的情況下，是Fc-受體，條件是該分子還沒有用作捕獲分子，或 者在全長抗體的情況下，是抗Fc-區抗體，條件是如果相同類型的抗體還用作捕獲分子，則 該抗體結合不同表位）、或結合對的第一搭檔（如果雙特異性抗體是用結合對的第二搭檔 衍生的）（條件是使用與固定捕獲分子所用的結合對不同的結合對）、或特異的結合雙特異 性抗體的結合特異性的抗獨特型抗體（條件是其與如果作為捕獲分子使用的抗獨特型抗 體結合不同的結合特異性）。
[0209] 本文報道的一個方面是用于確定樣品中與雙特異性抗體復合的雙特異性抗體的 (第一）抗原（第一抗原-雙特異性抗體-復合物）的存在和/或量的體外方法，其中待檢 測的抗原可以被雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括步驟：
[0210] -孵育包含（第一）抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗 體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗 體被固相結合。
[0211] 在一個實施方案中，抗獨特型抗體-雙特異性抗體-(第一）抗原-復合物是在方 法的第一步驟中形成的。
[0212] 在一個實施方案中，方法包括以下步驟作為第二步驟：
[0213] -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上 特異的結合（第一）抗原的抗體，從而確定樣品中與雙特異性抗體復合的雙特異性抗體的 (第一）抗原（（第一）抗原-雙特異性抗體-復合物）的存在和/或量。
[0214] 確定總抗原、結合抗體的抗原和游離抗原有助于監控治療性抗體的治療。例如，在 特異結合ANG2和VEGF的雙特異性抗體的情況下，作用機制是阻斷兩種抗原結合其相應的 受體。在缺少游離配體的條件下，阻斷信號通路。因此，確定游離抗原和結合抗體的抗原的 分數的可能性對治療有影響，特別是對于確定劑量和給藥頻率。總抗原代表游離的和結合 (抗體）的抗原的總和。
[0215] 在治療患者的過程中，患者中平行的存在抗原和治療性抗體，并形成其復合物。因 此，在體內存在結合抗體的抗原與游離抗原之間的平衡。在體外，可以通過例如稀釋樣品或 通過用于檢測或捕獲的選擇的抗體，影響平衡的分布。特別是對于游離抗原，在"體內"存 在的量和"體外"確定的量之間，可存在潛在的差別。除了預治療方法外，還可以通過分析 確定結合抗體的抗原和總抗原，之后，基于上述確定游離抗原來進一步克服。通常，用于確 定結合抗體的抗原和總抗原的測定方式的設置不同，例如在用于確定結合抗體的抗原的測 定和用于確定總抗原的測定之間，測定類型可能不同，用于捕獲和檢測的抗體可能不同，孵 育步驟的順序和時間可能不同。
[0216] 相反，在實施例9和圖13中描述了一種測定，上述測定可用于確定總抗原和結合 抗體的抗原。這一獨特的特征是由（治療性）抗體的雙特異性賦予的并且利用了針對第二 結合特異性的抗獨特型抗體。
[0217] 在體內樣品，例如血漿樣品，中直接確定結合的靶。
[0218] 簡而言之，通過體外添加過量的雙特異性抗體，將存在于樣品中的游離抗原轉化 為結合抗體的抗原。因此，通過再次實施與針對上述結合靶的完全相同的測定，確定總抗 原。體外添加或不添加雙特異性抗體的測定之間的差異反映了轉化靶的量，即，最初存在的 游離靶。
[0219] 提供下列實施例和附圖以幫助理解本發明，但所附權利要求陳述了本發明的實際 范圍。應理解，在不脫離本發明精神的條件下，可以對所述方法進行修飾。
[0220] 附圖描沭
[0221] 圖1結合藥物的靶（與雙特異性抗體結合的抗原）和游離靶（游離抗原）之間的 平衡
[0222] 圖2通過使用HER3耗盡與雙特異性抗C-MET/HER3抗體結合的c-MET ;固定在包被 了鏈霉抗生物素的磁珠上的生物素化HER3 ;在孵育這些磁珠與樣品（例如，血清樣品）后， 通過固定的HER3結合和耗盡雙特異性抗C-MET/HER3抗體；共-耗盡與雙特異性抗體結合 的c-MET ;游離c-MET(未與雙特異性抗體結合的）仍然位于樣品的上清中。
[0223] 圖3用于檢測c-MET的夾心ELISA :生物素化抗c-MET抗體與鏈霉抗生物素包 被的微滴度板結合；固定的抗c-MET抗體特異的結合游離的c-MET，而第二種，DIG標記 的抗c-MET抗體允許檢測結合的c-MET ;所述測定用于檢測耗盡后的樣品上清中的"游離 的" c-MET。
[0224] 圖4(A)免疫耗盡前后的緩沖液中的c-MET的測定信號水平：制備含100ng/ml c-MET和遞增量的雙特異性抗C-MET/HER3抗體的樣品；用與磁珠結合的生物素化HER3耗 盡bsmAb和結合的c-MET的復合物；圖表顯示了 ELISA確定的耗盡前后的c-MET濃度。
[0225] 圖4(B)免疫耗盡前后的血清中的c-MET測定信號水平：制備含100ng/ml c-MET 和遞增量的雙特異性抗C-MET/HER3抗體的樣品；用與磁珠結合的生物素化HER3耗盡 bsmAb和結合的c-MET的復合物；圖表顯示了 ELISA確定的耗盡前后的c-MET濃度。
[0226] 圖5㈧借助于其他抗原，檢測雙特異性抗體的抗原的ELISA :生物素化HER3與鏈 霉抗生物素包被的微滴度板結合，并用于固定雙特異性抗C-MET/HER3抗體；c-MET與固定 的雙特異性抗C-MET/HER3抗體結合；第二抗c-MET抗體（DIG標記的）與多克隆的HRP標 記的抗DIG抗體一起允許檢測結合的c-MET。
[0227] 圖5(B)借助于針對該雙特異性抗體的其他結合特異性的抗獨特型抗體，檢測雙 特異性抗體的抗原的ELISA :針對結合特異性的生物素化抗獨特型抗體（其特異的結合 HER3(idmAb < HER3 > -BI))與鏈霉抗生物素包被的微滴度板結合，并用于固定雙特異性 抗C-MET/HER3抗體；c-MET與固定的雙特異性抗C-MET/HER3抗體結合；第二抗c-MET抗體 (DIG標記的）與多克隆的HRP標記的抗DIG抗體一起允許檢測結合的c-MET。
[0228] 圖6借助于其他抗原，檢測雙特異性抗體的抗原的ELISA的校準曲線。
[0229] 圖7用抗ANG2/VEGF抗體（雙特異性抗體結合的VEGF)檢測VEGF的夾心ELISA : 將針對雙特異性抗體的ANG2結合特異性的生物素化抗獨特型抗體與鏈霉抗生物素包被的 微滴度板結合。固定的抗獨特型抗ANG2抗體與抗ANG2/VEGF抗體形成復合物。第二種地 高辛配基標記的抗VEGF抗體用于檢測與雙特異性抗體結合的VEGF。
[0230] 圖8用抗ANG2/VEGF抗體檢測VEGF復合物的ELISA的校準曲線。向含有500 μ g/ ml抗ANG2/VEGF抗體的血清中添加 Ong/ml至50ng/ml連續稀釋的VEGF，并在室溫孵育1 小時。如實施例6所述分析樣品。
[0231] 圖9用于檢測ANG2與抗ANG2/VEGF抗體的復合物（被雙特異性抗體結合的ANG2) 的夾心ELISA :針對雙特異性抗體的VEGF結合特異性的生物素化抗獨特型抗體與鏈霉抗生 物素包被的微滴度板結合。固定的抗獨特型的抗VEGF抗體的抗體與抗ANG2/VEGF抗體形 成復合物。第二種地高辛配基標記的抗ANG2抗體用于檢測結合的ANG2。
[0232] 圖10用于檢測ANG2與抗ANG2/VEGF抗體的復合物的ELISA的校準曲線。向含有 5 μ g/ml抗ANG2/VEGF抗體的血清中添加 Ong/ml至5000ng/ml連續稀釋的ANG2,并在室溫 孵育1小時。如實施例7所述分析樣品。
[0233] 圖11用于檢測VEGF與抗ANG2/VEGF抗體的復合物（被雙特異性抗體結合的VEGF) 的夾心ELISA :生物素化抗VEGF抗體與鏈霉抗生物素包被的微滴度板結合。固定的抗VEGF 抗體與抗ANG2/VEGF抗體-VEGF復合物形成復合物。地高辛配基標記的抗獨特型的抗ANG2 抗體的抗體用于檢測結合抗體的復合物。
[0234] 圖12用于檢測VEGF與抗ANG2/VEGF抗體的復合物的ELISA的校準曲線。向含有 抗ANG2/VEGF抗體的血清中添加 Ong/ml至10ng/ml連續稀釋的VEGF，并在室溫孵育1小 時。
[0235] 圖13用于檢測ANG2與抗ANG2/VEGF抗體的復合物（雙特異性抗體結合的ANG2) 的夾心ELISA :通過孵育樣品與雙特異性抗-ANG2/VEGF抗體，將游離的ANG2轉化為抗體結 合的ANG2。針對雙特異性抗體的VEGF結合特異性的生物素化的抗獨特型抗體與鏈霉抗生 物素包被的微滴度板結合。固定的抗獨特型的抗-VEGF抗體的抗體與ANG2-抗-ANG2/VEGF 抗體復合物形成復合物。特異性結合不同于抗-ANG2/VEGF抗體的ANG2上的表位的第二地 高辛配基標記的抗-ANG2抗體用于檢測總ANG2。
[0236] 實施例1
[0237] 在雙特異性藥物分子的情況下，耗盡結合藥物的靶（結合抗體的抗原）
[0238] A)裝配雙特異性抗C-MET/HER3抗體和c-MET的復合物
[0239] 將恒定濃度的c-MET與遞增量的雙特異性抗體在室溫孵育1小時，所述雙特異 性抗體的第一結合特異性特異結合c-MET，第二結合特異性特異結合HER3 (雙特異性抗 C-MET/HER3抗體）。然后，于耗盡步驟中使用這些樣品作為陽性對照。
[0240] B)耗盡步驟
[0241] 為了耗盡與雙特異性抗C-MET/HER3抗體結合的c-MET，將生物素化 HER3(HER3-BI)與lOyg/ml包被了磁性鏈霉抗生物素的珠子（SAbeads)結合。每個樣品 洗滌600 μ 1 SA-beads，并用磁性分離器從上清液中分離。將約600 μ 1含有HER3-BI的溶 液與SA-Beads混合，室溫孵育1小時。通過用磁性分離器洗滌珠子3次，去除過多的未結 合的HER3-BI。然后，孵育包被了抗原的珠子和250 μ 1含有雙特異性抗C-MET/HER3抗體 和c-MET的復合物的樣品。樣品在室溫下孵育振蕩1小時。在孵育后，用磁性分離器分離 樣品與珠子。采集上清液，用于在ELISA中分析"游離" c-MET (參見實施例2)。
[0242] 實施例2
[0243] 用于檢測 c-MET 的 ELISA
[0244] 將針對c-MET的生物素化單克隆抗體包被到第一步中的鏈霉抗生物素微滴度板 上。將耗盡步驟的上清液樣品（參見實施例1)稀釋10倍，添加到用抗c-MET抗體包被的 微滴度板的孔中。包含在樣品中的游離c-MET被包被在微滴度板的孔中的抗c-MET抗體結 合。在室溫孵育1小時后，洗滌平板3次，去除樣品。然后，向孔中加入具有與包被抗體不 同的特異性（即，表位）的單克隆DIG標記的抗c-MET抗體，再在室溫孵育1小時。在另一 個洗滌步驟后，向平板添加多克隆的HRP標記的抗DIG抗體，再孵育1小時。使用ABTS底 物溶液觸發顯色反應（參見圖3)。
[0245] 實施例3
[0246] 耗盡人血清和緩沖液中的藥物結合的c-MET
[0247] 根據實施例1，將雙特異性抗C-MET/HER3抗體分別稀釋為20/10/5/1/0. 5/0. 1和 〇μ g/ml的濃度，與恒定濃度的100ng/ml c-MET孵育。在兩種不同的基質中進行稀釋：
[0248] · PBS/BSA 緩沖液
[0249] ?人混合血清（Trina，NHS Base matrix)
[0250] 樣品在室溫下孵育振蕩1小時。然后，如實施例1所述耗盡樣品。
[0251] 使用HER3-BI捕獲c-MET與雙特異性抗C-MET/HER3抗體的復合物。
[0252] 在耗盡后，如實施例2所述，在c-MET ELISA中測量上清液。
[0253] 如圖4a所示，通過免疫耗盡，去除與雙特異性抗C-MET/HER3抗體結合的c-MET。 在存在5 μ g/ml或更多雙特異性抗體時，耗盡后的c-MET信號與測定背景信號近似。
[0254] 在圖4b所示的血清樣品中觀察到相似的行為。
[0255] 實施例4
[0256] 借助其他抗原檢測雙特異性抗體的抗原的ELISA
[0257] A)檢測樣品中的（總）c-MET的量
[0258] 將生物素化HER3與第一步中的鏈霉抗生物素微滴度板結合。與之平行的是，用 樣品/標準預孵育雙特異性抗C-MET/HER3抗體1小時。在預孵育過程中，樣品中的c-MET 與雙功能性抗C-MET/HER3抗體結合。在洗滌鏈霉抗生物素包被的平板后，將c-MET和抗 C-MET/HER3抗體的預孵育混合物添加到平板中，室溫孵育1小時。在從樣品中去除未結合 組分的另一個洗滌步驟后，加入地高辛配基標記的抗c-MET抗體（結合c-MET上與雙功能 性抗C-MET/HER3抗體不同的表位），孵育1小時。在另一個洗滌步驟后，向平板加入多克隆 的辣根過氧化物酶（HRP)標記的抗DIG抗體，孵育1小時。使用ABTS底物溶液觸發顯色反 應（參見圖5a)。
[0259] B)檢測樣品中（預存在的）雙特異件抗C-MET/HER3抗體和c-MET的復合物
[0260] 將生物素化HER3與第一步中的鏈霉抗生物素微滴度板結合。在洗滌平板后，將樣 品和標準添加到平板中，室溫孵育1小時。雙特異性抗C-MET/HER3抗體和c-MET的復合物 與固定的HER3-BI結合。在另一個洗滌步驟后，加入地高辛配基標記的抗c-MET抗體（特 異的結合c-MET上與雙功能性抗C-MET/HER3抗體不同的表位），孵育1小時。在另一個洗 滌步驟后，向平板加入多克隆的HRP標記的抗DIG抗體，孵育1小時。使用ABTS底物溶液 觸發顯色反應（參見圖5(A))。
[0261] 實施例5
[0262] 借助于針對該雙特異性抗體的第二結合特異性的抗獨特型抗體，檢測雙特異性抗 體的第一抗原的ELISA
[0263] a)檢測樣品中的（總）c-MET的量
[0264] 將針對特異結合HER3的結合特異性的生物素化抗獨特型抗體（抗獨特型的抗 HER3抗體的抗體-BI)與第一步中的鏈霉抗生物素微滴度板結合。與之平行的是，用樣品或 標準預孵育雙特異性抗C-MET/HER3抗體1小時。在預孵育步驟中，樣品中的c-MET被雙特 異性抗C-MET/HER3抗體特異的結合。在洗滌鏈霉抗生物素包被的平板后，將c-MET和雙特 異性抗C-MET/HER3抗體的預孵育混合物添加到平板中，室溫孵育1小時。在另一個去除未 結合組分的洗滌步驟后，加入地高辛配基標記的抗c-MET抗體（特異的結合c-MET上與雙 特異性抗C-MET/HER3抗體不同的表位），孵育1小時。在另一個洗滌步驟后，向平板加入多 克隆的HRP標記的抗DIG抗體，再孵育1小時。使用ABTS底物溶液觸發顯色反應（參見圖 5(B)) 〇
[0265] b)檢測樣品中（預存在的）抗C-MET/HER3抗體和c-MET的復合物
[0266] 將針對特異結合HER3的結合特異性的生物素化抗獨特型抗體（抗獨特型的抗 HER3抗體的抗體-BI)與第一步中的鏈霉抗生物素包被的微滴度板結合。在洗滌平板后，將 樣品和標準添加到平板中，室溫1小時。抗C-MET/HER3抗體和c-MET的復合物被固定的抗 獨特型抗體捕獲。在另一個洗滌步驟后，加入地高辛配基標記的抗c-MET抗體（特異的結 合c-MET上與雙特異性抗C-MET/HER3抗體不同的表位），孵育1小時。在另一個洗滌步驟 后，向平板加入多克隆的HRP標記的抗DIG抗體，孵育1小時。使用ABTS底物溶液觸發顯 色反應（參見圖5(B))。
[0267] 實施例6
[0268] 用于檢測VEGF與抗ANG2/VEGF雙特異性抗體的復合物的ELISA
[0269] 將生物素化的單克隆抗獨特型的抗ANG2抗體的抗體包被在鏈霉抗生物素包被的 微滴度板（MTP)上，所述抗體特異的結合抗ANG2/VEGF抗體的ANG2結合特異性。將具有未 知量的VEGF與抗ANG2/VEGF抗體的復合物的樣品稀釋10倍，添加到包被了抗獨特型的抗 ANG2抗體的抗體的MTP的孔中。特異結合ANG2和VEGF的雙特異性抗體被固定的抗獨特型 抗體復合，所述抗獨特型抗體針對雙特異性抗體的ANG2結合特異性的CDR。還結合雙特異 性抗體和VEGF的復合物。在室溫孵育1小時時間后，去除樣品/上清液，之后再洗滌平板 3次。之后，向孔中加入單克隆的地高辛配基標記的抗VEGF抗體（其結合VEGF上不同于 待檢測的雙特異性抗ANG2/VEGF抗體的表位），室溫孵育1小時。在洗滌步驟后，向平板加 入多克隆的辣根過氧化物酶（HRP)標記的抗地高辛配基抗體（抗DIG抗體），孵育1小時。 在去除上清液和洗滌后，添加 ABTS底物溶液用于顯色反應（參見圖7)。
[0270] 實施例7
[0271] 用于檢測ANG2與雙特異性抗ANG2/VEGF抗體的復合物的ELISA
[0272] 將生物素化的單克隆抗獨特型抗體包被在鏈霉抗生物素包被的微滴度板（MTP) 上，所述抗體特異的結合抗ANG2/VEGF抗體的VEGF結合特異性。將具有未知量的ANG2與 抗ANG2/VEGF抗體的復合物的樣品稀釋10倍，添加到包被了抗獨特型的抗VEGF抗體的抗 體的MTP的孔中。特異結合ANG2和VEGF的雙特異性抗體被固定的抗獨特型抗體復合，所 述抗獨特型抗體針對雙特異性抗ANG2/VEGF抗體的VEGF結合特異性的CDR。還結合雙特異 性抗體和ANG2的復合物。在室溫孵育1小時后，去除樣品/上清液，再洗滌平板3次。之 后，向孔中加入單克隆的地高辛配基標記的抗ANG2抗體（其特異的結合不同于雙特異性抗 ANG2/VEGF抗體的ANG2結合特異性的表位），室溫孵育1小時。在洗滌步驟后，向平板加入 多克隆的HRP標記的抗地高辛配基抗體，孵育1小時。在去除上清液和洗滌后，添加 ABTS 底物溶液用于顯色反應（參見圖9)。
[0273] 實施例8
[0274] 用于檢測VEGF與雙特異性抗ANG2/VEGF抗體的復合物的ELISA
[0275] 將針對VEGF的生物素化單克隆抗體包被在鏈霉抗生物素包被的微滴度板（MTP) 上。洗滌后，將具有未知量的VEGF與抗ANG2/VEGF抗體的復合物的樣品稀釋10倍，添加到 包被了抗VEGF抗體的MTP的孔中。針對VEGF的固定抗體在不同于雙特異性抗ANG2/VEGF 抗體的結合位點結合VEGF。VEGF與抗ANG2/VEGF抗體的復合物結合固定的抗VEGF抗體。 在室溫孵育1小時后，去除樣品/上清液，再洗滌平板3次。之后，向孔中加入地高辛標記 的單克隆抗獨特型抗體（其特異的結合抗ANG2/VEGF抗體的ANG2結合特異性），室溫孵育 1小時。在洗滌步驟后，向平板加入多克隆的HRP標記的抗地高辛配基抗體，孵育1小時。 在去除上清液和洗滌后，添加 ABTS底物溶液用于顯色反應（參見圖11)。圖12顯示了相應 的校準曲線。
[0276] 實施例9
[0277] 通過將游離ANG2轉化為結合抗體的ANG2并與雙特異性抗ANG2/VEGF抗體孵育， 檢測總ANG2的ELISA
[0278] 將特異的結合抗ANG2/VEGF抗體的VEGF結合特異性的生物素化單克隆的抗獨特 型抗體結合至包被了鏈霉抗生物素包被的微滴度板（MTP)。將具有未知量的ANG2的第一等 份樣品與1. 5 μ g/mL雙特異性抗ANG2/VEGF抗體孵育1小時，從而將游離ANG2轉化為結合 抗ANG2/VEGF抗體的ANG2。將第二（即，未孵育的）等份樣品和抗體孵育的等份樣品稀釋 10倍，添加到用抗獨特型抗體包被的MTP的孔中，所述抗獨特型抗體特異的結合雙特異性 抗體的VEGF結合特異性。雙特異性抗體被固定的抗獨特型抗體結合。同樣的，復合的ANG2 通過雙特異性抗體被結合。在室溫孵育1小時時間后，去除上清液（=樣品），再洗滌平板 3次。之后，向孔中加入單克隆的地高辛配基標記的抗ANG2抗體（其特異的結合于不同于 雙特異性抗ANG2/VEGF抗體的ANG2結合特異性的表位上），室溫孵育1小時。在洗滌步驟 后，向平板加入多克隆的HRP標記的抗地高辛配基抗體，孵育1小時。在去除上清液和洗滌 后，添加 ABTS底物溶液用于顯色反應（參見圖13)。從由第一等份獲得的結果和第二等份 獲得的結果之間的差異，計算游離ANG2的量。因此，使用該測定，確定了結合抗體的ANG2 和游離ANG2的量。
【權利要求】
1. 用于確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量的方法，其中待檢測的抗原 可以被雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，從而使抗原與雙特異性抗體復合（抗 原-雙特異性抗體-復合物），包括步驟： -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結 合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固相結 合。
2. 根據權利要求1的方法，其特征是方法包括步驟： -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結 合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固相結 合，和 -檢測抗原-雙特異性抗體-抗獨特型抗體的復合物，從而確定雙特異性抗體的抗原的 存在和/或量。
3. 根據權利要求1-2的任一項的方法，其特征是方法包括步驟： -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結 合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固相結 合，和 -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特異的 結合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量。
4. 根據權利要求1至3的任一項的方法，其特征是方法是用于確定與雙特異性抗體復 合的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量。
5. 根據權利要求1至4的任一項的方法，其特征是方法包括下列步驟： -提供包含抗原和雙特異性抗體的樣品，其中至少90%的抗原被雙特異性抗體復合， -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結 合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被固相結 合，和 -孵育在第一步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特異的 結合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量。
6. 根據權利要求1至4的任一項的方法，其特征是方法包括下列步驟： -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與一定量的雙特異性抗體，以提供其中至少 90%的抗原被雙特異性抗體復合的樣品， -孵育包含被雙特異性抗體復合的抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特 異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被 固相結合，和 -孵育在前步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特異的結 合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量。
7. 根據權利要求6的方法，其特征是雙特異性抗體的量在1 μ g/ml至10 μ g/ml樣品之 間。
8. 根據權利要求6-7的任一項的方法，其特征是至少95%的抗原被雙特異性抗體復 合。
9. 根據權利要求8的方法，其特征是至少98%的抗原被雙特異性抗體復合。
10. 用于確定樣品中的雙特異性抗體的結合抗體的抗原的量的方法，其中抗原可以被 雙特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括步驟： -孵育第一等份的包含抗原和雙特異性抗體的樣品與一定量的雙特異性抗體，以提供 其中至少90%的抗原被雙特異性抗體復合的樣品， -孵育包含被雙特異性抗體復合的抗原的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特 異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗體被 固相結合，和 -孵育在前步中形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特異的結 合抗原的抗體，從而確定樣品中的雙特異性抗體的抗原的存在和/或量，和確定樣品中存 在的抗原總量， -孵育第二等份的包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗 體特異的結合雙特異性抗體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性，其中抗獨特型抗 體被固相結合，和 -孵育形成的復合物與在不同于雙特異性抗體所結合表位的表位上特異的結合抗原的 抗體，從而確定樣品中存在的雙特異性抗體的游離抗原的量，和 -通過在樣品中存在的抗原總量與樣品中存在的游離抗原的量之間的差異，確定雙特 異性抗體的結合抗體的抗原的量。
11. 用于確定樣品中的多特異性抗體的抗原的存在和/或量的方法，其中抗原可以被 多特異性抗體的第一結合特異性特異的結合，包括步驟： -孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被多特異性抗 體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，和 -在確定抗原的存在和/或量之前，從樣品中去除第二抗原-多特異性抗體復合物。
12. 根據權利要求11的方法，其特征是第二抗原與固相綴合。
13. 根據權利要求11或12的方法，其特征是第二抗原與順磁珠綴合。
14. 根據權利要求11至13的任一項的方法，其特征是包括下列步驟： -孵育包含抗原和多特異性抗體的樣品與第二抗原，所述第二抗原可以被多特異性抗 體的不同于第一結合特異性的第二結合特異性特異的結合，形成第二抗原-多特異性抗體 復合物， -從樣品中去除第二抗原-多特異性抗體復合物，和 -確定在耗盡了多特異性抗體的樣品中的抗原。
15. 根據權利要求11至14的任一項的方法，其特征是抗原的確定包括下列步驟： -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異的結合抗原的捕獲抗體，形成捕獲抗體-抗 原復合物，和 -將形成的捕獲抗體-抗原復合物與樣品中的抗原的量關聯。
16. 根據權利要求11至15的任一項的方法，其特征是抗原的確定包括下列步驟： -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異的結合抗原的捕獲抗體，形成捕獲抗體-抗 原復合物， -孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，其中所述捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上 的非重疊表位，和 -將形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量關聯。
17. 根據權利要求11至16的任一項的方法，其特征是抗原的確定包括下列步驟： -孵育耗盡了多特異性抗體的樣品與特異的結合抗原的捕獲抗體，形成捕獲抗體-抗 原復合物， -孵育捕獲抗體-抗原復合物與示蹤抗體，其中所述捕獲抗體和示蹤抗體結合抗原上 的非重疊表位， -孵育捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與包括可檢測標記的檢測抗體，其中所述檢測 抗體在示蹤抗體的可變結構域以外的表位上特異的結合示蹤抗體，和 -將形成的捕獲抗體-抗原-示蹤抗體復合物與樣品中的抗原的量關聯。
18. 根據權利要求11至17的任一項的方法，其特征是多特異性抗體是具有第一結合特 異性和第二結合特異性的雙特異性抗體，所述第一結合特異性特異的結合第一抗原或抗原 上的第一表位，所述第二結合特異性特異的結合第二抗原或抗原上的第二表位。
19. 根據權利要求11至18的任一項的方法，其特征是確定的是多特異性抗體的游離抗 原。
20. 用于確定在樣品中與雙特異性抗體復合的雙特異性抗體的抗原的量的方法，包括 步驟： -孵育包含抗原和雙特異性抗體的樣品與抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體特異的結 合雙特異性抗體的結合特異性，該結合特異性不同于抗原所結合的結合特異性，其中抗獨 特型抗體被固相結合。
21. 根據權利要求20的方法，其特征是方法包括以下作為第二步驟： -孵育在第一步中形成的復合物與抗體，所述抗體在不同于雙特異性抗體所結合表位 的表位上特異的結合抗原，從而確定樣品中與雙特異性抗體復合的雙特異性抗體的抗原的 量。
【文檔編號】G01N33/543GK104105966SQ201380007278
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年1月29日 優先權日:2012年2月1日
【發明者】K-G·施圖本拉赫, U·韋塞爾斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司