用于檢測nk細胞活性的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，包括盒體、盒蓋和設置在盒體內的襯墊，所述襯墊上設有小孔，裝有熒光標記CD69單克隆抗體的試劑管、裝有熒光標記CD56單克隆抗體的試劑管、裝有熒光標記CD3單克隆抗體的試劑管、裝有熒光標記HLA-DR單克隆抗體的試劑管、裝有熒光標記CD45單克隆抗體的試劑管、裝有紅細胞裂解液的試劑管和裝有PBS緩沖液的試劑管被設置在所述小孔內。該試劑盒結構簡單、設計合理，使用程序簡單，對實驗室條件要求不高，便于技術廣泛推廣。
【專利說明】用于檢測NK細胞活性的試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫學【技術領域】，涉及一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒。
【背景技術】
[0002]人的免疫系統中，T淋巴細胞擔負著免疫的主要功能，細胞毒性T淋巴細胞是一種特異的T淋巴細胞，它在抵御腫瘤形成、病毒疾病感染過程中發揮著重要的作用。細胞毒性T淋巴細胞在發揮殺傷作用時，T細胞受體要識別抗原提呈細胞或者靶細胞上的MHC分子所提成的抗原肽，在這個過程中，T細胞受體不僅需要識別抗原肽，還需要識別與抗原肽結合的MHC分子類型，此現象即MHC限制。但是，多數的腫瘤細胞以及部分病毒感染細胞為了逃逸機體的免疫監視，其細胞表面的MHC分子表達通常都明顯下調甚至消失(被稱為“缺失自己”)，這時T淋巴細胞就無法發揮作用。
[0003]20世紀70年代初學者在研究T細胞對靶細胞特異性殺傷時發現了 NK細胞(自然殺傷細胞)，NK細胞的主要活性也是殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞，但它介導天然免疫應答，不依賴抗體和補體，就能立即殺滅腫瘤細胞和病毒感染細胞。NK細胞活性可作為判斷機體抗腫瘤和抗病毒感染的指標之一，檢測NK細胞活性可以協助一些疾病的診斷，監測患者的免疫狀態。
[0004]目前檢測NK細胞活性的方法主要有:
[0005]一、LDH釋放法:活細胞的胞漿內含有LDH。正常情況下，LDH不能透過細胞膜，當細胞受到NK細胞的殺傷后，LDH釋放到細胞外。LDH可使乳酸鋰脫氫，進而使NAD還原成NADH，后者再經遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化四氮唑(INT)，INT接受H +被還原成紫紅色甲月贊類化合物，在酶標儀上用490nm比色測定；
[0006]二、MTT還原法:本法根據細胞代謝活動與活細胞數直接成比例的原理，通過測定靶細胞代謝活性的減少來反映效應細胞所致靶細胞的死亡。氧化型MTT進入細胞后被線粒體脫氫酶還原生成藍色formazan顆粒，經溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與活細胞數有關，與靶細胞對照孔比較可計算效應細胞殺傷靶細胞的百分比；
[0007]三、同位素釋放法:將用同位素3H_TdR標記的靶細胞與淋巴細胞共同培養時，靶細胞可被NK細胞殺傷。同位素便從被殺傷的靶細胞中釋放出來，其釋放的量與NK細胞活性成正比。通過測定靶細胞3H-TdR的釋放率即可反應NK細胞的活性；
[0008]四、流式細胞術:將pEGFP-Nl質粒轉染人NK細胞的天然靶細胞K562，經過G418篩選后進一步單克隆，得到穩定、均一表達綠色熒光蛋白的EGFP-K562細胞，將EGFP-K562細胞與人外周血單個核細胞按10: I的比例混合孵育2小時后，用碘化丙啶(PI)標記，用流式細胞儀分析呈紅、綠色熒光的細胞數，最后計算NK細胞的殺傷效率。
[0009]以上幾種方法均涉及細胞培養，程序復雜、操作時間長，不能在第一時間提供臨床所需資料，并且同位素釋放法涉及放射性物質的使用，實驗條件苛刻，大多數實驗室無法常規開展。實用新型內容
[0010]為了解決上述技術問題，本實用新型的目的在于提供一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，可以快速、準確地檢測活化的NK細胞數量，從而對NK細胞活性進行評估。
[0011]為實現上述目的，本實用新型采取的技術方案是:一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，包括盒體(I)、盒蓋(2)和設置在盒體(I)內的襯墊(3)，所述襯墊(3)上設有小孔，裝有熒光標記CD69單克隆抗體的試劑管(4)、裝有熒光標記CD56單克隆抗體的試劑管(5)、裝有熒光標記CD3單克隆抗體的試劑管(6)、裝有熒光標記HLA-DR單克隆抗體的試劑管
(7)、裝有熒光標記CD45單克隆抗體的試劑管(8)、裝有紅細胞裂解液的試劑管(9)和裝有PBS緩沖液的試劑管(10)被設置在所述小孔內。
[0012]其中，每個單克隆抗體的熒光標記不同；優選地，⑶69單克隆抗體使用FITC標記，CD56單克隆抗體使用PE標記，CD3單克隆抗體使用APC標記，CD45單克隆抗體使用PerCP
T 己 O
[0013]其中，所述紅細胞裂解液和PBS緩沖液為本領域常規試劑。
[0014]其中，所述襯墊(3)上設有7個小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列。
[0015]通過以上技術方案，本實用新型的有益效果如下:
[0016](I)本實用新型的試劑盒結構簡單、設計合理，方便攜帶、保存，不易受污染。
[0017](2)本實用新型的試劑盒在檢測NK細胞活性時，不涉及細胞培養，程序簡單，降低了檢測工作的強度；對實驗室條件要求不高，只要有流式細胞儀的實驗室即可開展檢測，便于技術廣泛推廣，檢測操作時間短、檢測精度高，上機操作和數據分析方法簡單，可以在第一時間得到臨床所需資料。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本實用新型的結構示意圖；
[0019]圖中，1-盒體，2-盒蓋，3-襯墊，4-裝有熒光標記⑶69單克隆抗體的試劑管，5_裝有熒光標記CD56單克隆抗體的試劑管，6-裝有熒光標記CD3單克隆抗體的試劑管，7-裝有熒光標記HLA-DR單克隆抗體的試劑管，8-裝有熒光標記CD45單克隆抗體的試劑管，9-裝有紅細胞裂解液的試劑管，10-裝有PBS緩沖液的試劑管。
[0020]圖2為正常人外周血檢測NK細胞活性的示意圖；
[0021]圖3為淋巴瘤患者外周血檢測NK細胞活性的示意圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例對本實用新型的【具體實施方式】作進一步描述，本實用新型的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本實用新型的范圍構成任何限制。
[0023]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0024]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0025]如圖1所示，本實用新型提供了一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，包括盒體1、盒蓋2和設置在盒體I內的襯墊3，所述襯墊3上設有7個小孔，所述小孔在所述襯墊3上分成兩排平行排列，裝有熒光標記CD69單克隆抗體的試劑管4、裝有熒光標記CD56單克隆抗體的試劑管5、裝有熒光標記CD3單克隆抗體的試劑管6、裝有熒光標記HLA-DR單克隆抗體的試劑管7、裝有熒光標記CD45單克隆抗體的試劑管8和裝有紅細胞裂解液的試劑管9和裝有PBS緩沖液的試劑管10被設置在所述小孔內。
[0026]其中，⑶69單克隆抗體使用FITC標記，⑶56單克隆抗體使用PE標記，⑶3單克隆抗體使用APC標記，⑶45單克隆抗體使用PerCP標記。
[0027]其中，所述紅細胞裂解液購自美國BD公司，所述PBS緩沖液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
[0028]檢測步驟如下:
[0029](I)取患者的外周血樣品，使用計數板對待檢標本進行細胞計數，然后調節白細胞濃度至5 X IO6個/ml ；
[0030](2)取70μl待測標本，加入FITC標記CD69單克隆抗體20μl/test、PE標記CD56單克隆抗體20 μ 1/test、APC標記CD3單克隆抗體5 μ 1/test、APC-CY7標記HLA-DR單克隆抗體5 μ L/test和PerCP標記CD45單克隆抗體20 μ L/test，混勻后室溫避光孵育20分鐘；
[0031](3)加入紅細胞裂解液，震蕩混勻后室溫避光10分鐘，使用1500rpm離心5分鐘后棄上清，再加入1000 μ I PBS緩沖液，震蕩混勻后使用1500rpm離心5分鐘，棄上清
[0032](4)加入 150 μ I PBS 緩沖液；
[0033](5 )使用BD Canto II流式細胞儀進行檢測，計算HLA-DR+、⑶69+的NK細胞分別占NK細胞和有核細胞的比例，得出檢測結果，檢測方法具體如下:
[0034](a)上機獲取 10000 個 CD3-CD56+ 的 NK 細胞；
[0035](b)在FSC-SSC點圖上設Pl門，去除雜質，在CD45-SSC點圖上設門圈出淋巴細胞、單核細胞、粒細胞等各群細胞；
[0036](c)在CD3-CD56點圖上設門圈出CD3-CD56+的NK細胞；
[0037](d)檢測數據主要以散點圖的形式顯示，在列表模式中將每個細胞的每個檢測參量依次存儲后，可以對數據進行計算分析，計算得出HLA-DR+、CD69+的NK細胞分別占NK細胞和有核細胞的比例。
[0038]圖2為正常人外周血檢測NK細胞活性，正常外周血活化的NK細胞的比例如下:
[0039]CD69+的NK細胞占NK細胞比例:范圍:0?11.26%，均值:0.69%，標準差:2.505 ；
[0040]CD69+的NK細胞占有核細胞比例:范圍:0?0.57%，均值:0.04%，標準差:0.128 ;[0041 ] HLA-DR+的NK細胞占NK細胞比例:范圍:2.15%?14.18%，均值:5.63%，標準差:
3.272 ；
[0042]HLA-DR+的NK細胞占有核細胞比例:范圍:0.05%?0.99%，均值:0.31%，標準差
0.267。
[0043]圖3為淋巴瘤患者外周血檢測NK細胞活性，⑶3-⑶56+的NK細胞約占有核細胞的
1.53%，CD69+的NK細胞約占NK細胞的1.62%，約占有核細胞的0.03% ；HLA-DR+的NK細胞約占NK細胞的42.47%，約占有核細胞的0.65% ;其HLA-DR+的NK細胞比例明顯升高，CD69+的NK細胞比例升高。
[0044]上面已經舉例說明了本實用新型的實施例，本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本實用新型的精神和范圍下可以對本實用新型技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本實用新型的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括盒體(I)、盒蓋(2)和設置在盒體(I)內的襯墊(3)，所述襯墊(3)上設有小孔，裝有熒光標記⑶69單克隆抗體的試劑管(4)、裝有熒光標記CD56單克隆抗體的試劑管(5)、裝有熒光標記CD3單克隆抗體的試劑管(6)、裝有熒光標記HLA-DR單克隆抗體的試劑管(7)、裝有熒光標記CD45單克隆抗體的試劑管(8 )、裝有紅細胞裂解液的試劑管(9 )和裝有PBS緩沖液的試劑管(10 )被設置在所述小孔內。
2.按照權利要求1所述的一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，其特征在于:每個單克隆抗體的熒光標記不同。
3.按照權利要求2所述的一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，其特征在于:CD69單克隆抗體使用FITC標記，CD56單克隆抗體使用PE標記，CD3單克隆抗體使用APC標記，CD45單克隆抗體使用PerCP標記。
4.按照權利要求1所述的一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(3)上設有7個小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列。
【文檔編號】G01N33/577GK203535053SQ201320687858
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】劉麗媛, 吳純斌, 秦曉明, 王顯鳳, 王緒華, 梁超, 方國偉, 黃士昂, 陳忠 申請人:北京海思特臨床檢驗所有限公司