一種解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型屬免疫檢測領域，具體公開了一種解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，其特征在于所提供檢測試劑盒由檢測條和塑料卡盒組成。檢測條是在襯板上將樣品墊a、膠體金墊、樣品墊b、硝酸纖維素膜、吸樣墊進行有序組合；硝酸纖維素膜上設置包被解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a的檢測線和羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體的質控線；膠體金墊上固化膠體金標記的解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b；檢測條安裝于塑料卡盒內。本實用新型提供的試劑盒應用“雙抗體夾心”免疫技術原理，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速、無需專門儀器設備的優點，適用于臨床對解脲支原體感染的快速檢測。
【專利說明】一種解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及醫學臨床免疫檢測領域，特別是涉及一種解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]解脲支原體(Ureaplasma urealyticum,UU)是一類介于細菌與病毒之間的最小原核微生物，屬支原體的一種，因生長需要尿素而得名。菌體微小，直徑僅有15?25um，屬于柔膜綱脲原體目脲原體科的脲原體屬，主要分布于人體泌尿生殖道，是除沙眼衣原體外最常見的非淋病性尿道炎的病原菌。解脲支原體，除引起非淋菌性尿道炎、宮頸炎、輸卵管炎，導致不孕不育，還可通過母嬰垂直傳播(宮內和產道)，引起宮內感染而導致流產、死胎、早產、新生兒呼吸道感染、腦膜炎等不良后果。國內外資料顯示，不孕癥夫婦的宮頸粘液、精液中解脲支原體培養陽性率高達50%以上；從流產的組織中檢查出解脲支原體的陽性率高達40%以上；解脲支原體占非淋球菌陰道炎的67.6% ;在宮頸炎和陰道炎病例中，解脲支原體檢出率為67%。近年來，泌尿生殖道支原體感染在性傳播疾病(STD)中發病率呈明顯上升趨勢，特別是在非淋球菌性尿道炎患者中解脲支原體的檢出率占首位。因此，解脲支原體的檢測在泌尿生殖系統疾病的診斷上具有重要意義。
[0003]目前臨床診斷工作中，檢測解脲支原體的主要方法有培養法、PCR法、免疫學方法等。培養法是傳統的“金標準”方法，特異性高，但敏感性低、培養耗時長，易污染等因素影響，尤其新生兒病情變化迅速標本不便采集，因此難以接受；PCR法憑借著敏感，特異等優點逐漸顯示出了其臨床診斷的優越性，但需要特殊的儀器和專門的人員操作，不利于基層醫院的推廣使用；免疫學方法包括ELISA法、單克隆或多克隆免疫熒光法(IFA)、膠體金法等，其快速、簡便、靈敏度高、易于標準化和商品化等優勢，使其在臨床快速檢測上具有很好的發展前景并易于開發成商品化試劑盒。
[0004]膠體金快速診斷技術是在20世紀90年代以來在單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新型層析材料基礎上發展起來的一項新型體外診斷技術，近年來發展迅速，在生物領域尤其是醫學檢驗中得到了廣泛應用。該技術基于以下原理:利用膠體金標記一種抗原或抗體，在硝酸纖維素膜檢測層上包被相應配對的特異性抗原或抗體，當待測樣品中含有相對應的特異性抗體或抗原時，通過毛細作用向前移動，與膠體金標記物相結合形成待測物膠體金標記復合物，在移動至特異性抗原或抗體包被區時，待測物膠體金標記復合物與之發生特異性結合而被截留，形成肉眼可觀察的色帶。通過檢測線的有無實現對結果的判定。該技術具有操作簡便、反應迅速、敏感性高、特異性強、適用于任何場地、經濟適用等優點。
[0005]目前國內外均未見到應用膠體金快速診斷技術檢測解脲支原體抗原的檢測卡。
【發明內容】
[0006]本實用新型是為了提供一種解脲支原體抗原的金標快速檢測試劑盒，用于臨床快速檢測、流行病學調查等。所述檢測試劑盒應用“雙抗體夾心”的免疫原理，具有靈敏度高、特異性強、檢測迅速，操作簡便、無需專門設施等特點，為臨床提供一種快速簡潔的診斷方法。
[0007]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，其使用方法包括下述步驟:取女性宮頸樣本或男性尿道樣本與樣品處理液混勻，再將混合液滴加于檢測試劑盒的加樣孔中，3^15分鐘即可判讀檢測結果。若樣品溶液中含有解脲支原體MB蛋白，則觀察窗處檢測線(C線)和質控線(T線)均顯色，結果判定為陽性；若樣品溶液中不含解脲支原體MB蛋白，則觀察窗處僅質控線(C線)顯色，結果判定為陰性。
[0008]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，由解脲支原體抗原金標快速檢測條、塑料卡盒和樣品處理液組成。
[0009]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，包括樣品墊a、膠體金墊、樣品墊b、硝酸纖維素膜、吸樣墊、襯板；檢測條是在襯板上依次設有樣品墊a、硝酸纖維素膜、吸樣墊；在膠體金墊下有樣品墊a，在膠體金墊上有樣品墊b ;在硝酸纖維素膜上包被有檢測線和質控線。
[0010]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒塑料卡盒，其特征在于塑料卡盒蓋上依次有加樣孔和觀察窗，塑料卡盒蓋靠近觀察窗設有產品簡稱和樣本編號，觀察窗上設有結果判別標識T和C ;塑料卡盒底部設有的單卡槽；塑料卡盒蓋和盒底通過凸起連接。
[0011]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條安裝在塑料卡盒底部的單卡槽內，樣品墊b和膠體金墊對應塑料卡盒的加樣孔處，所述硝酸纖維素膜對應塑料卡盒觀察窗處，所述檢測線和質控線分別對應觀察窗的T線和C線。
[0012]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑條膠體金墊標記物為解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b，膠體金的載體為無紡布或玻璃纖維。
[0013]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其特征在于質控線包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體。
[0014]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其特征在于檢測線包被解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a。
[0015]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其特征在樣品墊a/b為無紡布。
[0016]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其特征在于吸樣墊為吸水濾紙。
[0017]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒的檢測卡盒設有連接裝置，盒蓋和盒底可拆卸式連接，一方面盒蓋和盒底可重復使用，節省資源。
[0018]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其膠體金墊的制備方法如下:i膠體金的制備:在濃度為0.004%~0.012%的氯金酸中加入其體積的1.3%~2%、濃度為1%~3%的檸檬酸三鈉，煮沸10-20分鐘，可得到15~50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b:將(i)中所得膠體金溶液中用0.2M碳酸鉀溶液調pH至8.0-8.4，按4"l2mg/100ml加入解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b,攪拌均勻后,按0.1 "0.6g/100ml在溶液中加入動物血清蛋白，4°C靜置2~4小時；iii將(ii)中所得膠體金溶液經2000轉/分鐘離心10-15分鐘，去沉淀物，取上清液；iv將(iii)中所得上清液經10000轉/分鐘離心60~80分鐘，取上清液，取沉淀物；v將(iv)中所得沉淀物按4~10ml/100ml溶于0.02M pH7.4 Tris-Hcl緩沖液(該緩沖液中含0.2%~0.6%的動物血清蛋白和0.ΟΡ/1-Ο.06%疊氮鈉)中，得膠體金溶液；vi將玻璃纖維或無紡布浸入(V)中所得膠體金溶液中，待浸入的玻璃纖維或無紡布有液體滲出為止，37°C干燥，即得膠體金墊。
[0019]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其質控線和檢測線的包被方法如下:取解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a，調濃度為lmg/ml，加入適量甲醛，用專用噴膜機在NC膜中段噴檢測線；取羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體，調濃度為2mg/ml，加入適量甲醛，用專用噴膜機在NC膜中段，距檢測線0.5cm處噴質控線(11)，檢測線和質控線均按10-20 μ Ι/ml設置噴量，噴膜后37°C條件下干燥2小時；在37°C條件下，用含10%小牛血清的0.01M pH 7.0PBS液(磷酸鹽緩沖溶液)封閉30分鐘，用0.01M pH 7.0 PBS漂洗，37°C干燥，即得。
[0020]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，其特征在于所用樣品處理液包括樣品處理液A和樣品處理液B，樣品處理液A為0.01M pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液，樣品處理液B為0.9%的氯化鈉溶液。
[0021]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條采用免疫層析技術和抗原抗體特異性結合原理。本產品以膠體金標記解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b,以解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a、羊抗鼠IgG抗體分別包被硝酸纖維素膜的檢測線(T線)和質控線(C線)，當待測樣品中含有解脲支原體MB蛋白時，通過毛細作用向前移動，與膠體金標記物相結合形成待測物膠體金標記復合物，在移動至解脲支原體MB蛋白單克隆抗體包被區時，待測物膠體金標記復合物與之發生特異性結合而被截留，形成肉眼可觀察的紅色條帶；待測物膠體金標記復合物繼續向前移動，與包被在質控線(C線)上的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體結合，形成紅色條 帶。無論待測樣本中是否存在解脲支原體MB蛋白，質控線上包被的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體都會與膠體金標記的解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b結合形成一條紅色線(C線)。C線的顯色是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為該檢測卡的內部質控標準。若硝酸纖維素膜上質控線和檢測線均不出現，則檢測結果無效。
[0022]本實用新型使用以上技術方案，提供了一種解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒。本實用新型操作簡便、使用方便快捷、無需專門的設施，且能滿足臨床樣本快速檢測、體檢、流行病學普查等的要求，容易普及到基層醫院。以符號顯示結果，結果觀察更為直觀、快捷，同時也擺脫了對儀器設備、人員的特殊要求，縮短了檢測時間，提高了檢測效率，具有準確、快捷、方便、價廉的特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是本實用新型檢測卡的立體結構示意圖:
[0024]I 一檢測卡盒 2—加樣孔3—觀察窗
[0025]4 一樣品編號 5—廣品簡稱。
[0026]圖2是本實用新型檢測卡盒蓋的結構示意圖:
[0027]2 一加樣孔3—觀察窗6—凸起。
[0028]圖3是本實用新型檢測卡盒底的結構示意圖:
[0029]6—凸起7—單卡槽。
[0030]圖4本實用新型檢測卡中檢測條的結果示意圖:
[0031]8—檢測條9一樣品墊a10—膠體金墊
[0032]11 一樣品塾b 12—硝酸纖維素膜13—檢測線[0033]14 一質控線15—吸樣墊16—襯板。
【具體實施方式】
[0034]提供下述實施例是為了能更好的理解本實用新型，并不局限于所述最佳實施方式，任何人在本實用新型的啟示下或是將本實用新型與其他現有技術的特征進行組合而得出的任何與本實用新型相同或相似的產品，均落在本實用新型的保護范圍之內。
[0035]本實用新型用于檢測解脲支原體抗原，用于臨床樣本快速檢測、體檢、流行病學普查等。結果觀察更為直觀、快捷，擺脫了對儀器設備、人員的特殊要求，縮短了檢測時間，提高了檢測效率，具有操作簡便、使用方便、無需專門的設施、準確、快捷、方便、價廉的特點。
[0036]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，其使用方法包括下述步驟:取女性宮頸樣本或男性尿道樣本與樣品處理液混勻，再將混合液滴加于檢測卡的加樣孔中，3~15分鐘即可判讀檢測結果。若樣品溶液中含有解脲支原體MB蛋白，則觀察窗處檢測線(C線)和質控線(T線)均顯色，結果判定為陽性；若樣品溶液中不含解脲支原體MB蛋白，則觀察窗處僅質控線(T線)均顯色，結果判定為陰性。
[0037]本實用 新型的解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，包括解脲支原體抗原金標快速檢測條、塑料卡盒和樣品處理液。
[0038]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條(8)，包括樣品墊a (9)、膠體金墊(10)、樣品墊b (11)、硝酸纖維素膜(12)、吸樣墊(15)、襯板(16);檢測試劑條是在襯板(16)上依次設有樣品墊a (9)、膠體金墊(10)、硝酸纖維素膜(12)、吸樣墊(15);在膠體金墊(10)上有樣品墊b (11);在硝酸纖維素膜(12)上包被有檢測線(13)和質控線(14)。具體操作如下:在襯板(16)中部粘貼包被檢測線(13)和質控線(14)的硝酸纖維素膜(12)，樣品墊a (9)位于硝酸纖維素膜(12)的一側，并與其有部分重疊；在樣品墊a (9)上設有膠體金墊(10)，在膠體金墊(10)上設有樣品墊b (11)，并使膠體金墊(10)和樣品墊b (11)與硝酸纖維素膜(12)有部分重疊，在硝酸纖維素膜(12)的另一側粘貼有吸樣墊(15)，且與硝酸纖維素膜
(12)也有部分重疊，固定。然后按4-5毫米寬、8厘米長規格切條。參考附圖4。
[0039]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條制備方法主要包括膠體金墊(10)的制備和硝酸纖維素膜(12)上檢測線(13)和質控線(14)的包被。
[0040]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其膠體金墊(10)其制備方法包括以下步驟:i膠體金的制備:取IOOmg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、在濃度為1%的朽1檬酸三鈉，煮沸15分鐘，可得到15~50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記解脲支原體MB蛋白單克隆抗體:取(i)中所得膠體金溶液100ml，用0.2M碳酸鉀溶液調pH至8.2，加入4mg解脲支原體MB蛋白單克隆抗體，攪拌20分鐘后，在溶液中加入240mg牛血清白蛋白，繼續攪拌5分鐘，4°C靜置4小時；iii將(ii)中所得膠體金溶液經2000轉/分鐘離心15分鐘，去沉淀物，取上清液；iv將(iii)中所得上清液經10000轉/分鐘離心60分鐘，取上清液，取沉淀物；V將(iv)中所得沉淀物按5ml/100ml溶于0.02M pH 7.4 Tris-Hcl緩沖液(該緩沖液中含0.25%的牛血清白蛋白和0.02%疊氮鈉)中，得膠體金溶液；vi將無紡布浸Λ(ν)中所得膠體金溶液中，待浸入的無紡布有液體滲出為止，37°C干燥2小時，即得。
[0041]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條，其檢測線(13)和質控線(14)的包被方法為:取解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a，調濃度為lmg/ml，加入0.2%甲醛，用專用噴膜機在NC膜中段噴檢測線(13);取羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體調濃度為2mg/ml，加入0.2%甲醛，用專用噴膜機在NC膜中段，距檢測線0.5cm處噴質控線(14)，檢測線和質控線均按20 μ I/ml設置噴量，噴膜后37°C條件下干燥2小時；在37°C條件下，用含10%小牛血清的0.0lMpH 7.0 PBS液(磷酸鹽緩沖溶液)封閉30分鐘，用0.0lM pH 7.0 PBS漂洗，37°C干燥，即得。
[0042]所述解脲支原體抗原金標快速檢測條安裝在塑料卡盒底部的單卡槽內，樣品墊b
(11)和膠體金墊(10)對應塑料卡盒的加樣孔(2)處，所述硝酸纖維素膜(12)對應于塑料卡盒觀察窗處，所述檢測線(13)和質控線(14)分別對應于觀察窗(3)的T線和C線。
[0043]所述樣品墊a/b (9/11)為無紡布；所述膠體金墊(10)標記抗體為解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b ;所述質控線(14)包被的抗體為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體；所述檢測線(13)包被的抗體為解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a ;所述吸樣墊(15)為吸水濾紙；所述襯板(16)為PVC膠板。
[0044]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，其特征在于所用樣品處理液包括樣品處理液A和樣品處理液B，樣品處理液A為0.0lM pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液，樣品處理液B為0.9%的氯化鈉溶液。
[0045]所述解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒采用免疫層析技術和抗原抗體特異性結合原理。其具體使用方法如下:1將樣品處理液A液，滴6滴(300ul)加入樣品處理管中。II將樣品拭子放入滴有樣品稀釋液A液的處理管內，室溫2分鐘，在處理過程中要多次旋轉并在管壁上擠壓拭子，使液體不斷被擠出。III 2分鐘后加入6滴(300ul)樣品處理液B液，在管壁擠壓拭子，使液體盡量擠出，隨后將拭子丟棄在密封的醫療垃圾容器內，按有關規定進行處置。IV撕開鋁箔袋取出測試板平放，用吸管滴加約2滴處理好的樣品液在測試板右端的圓加樣孔中，3?5分鐘后觀察測試板中部檢視窗的結果，20分鐘內觀察結果有效。當待測樣品溶液中含有解脲支原體MB蛋白時，通過毛細作用向前移動，與膠體金標記物相結合形成待測物膠體金標記復合物，在移動至解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a包被區時，待測物膠體金標記復合物與之發生特異性結合而被截留，形成肉眼可觀察的紅色條帶；待測物膠體金標記復合物繼續向前移動，與包被在質控線(C線)上的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體結合，形成紅色條帶，則結果為陽性；當待測樣品溶液中含有解脲支原體MB蛋白時，只在質控線(C線)上出現紅色條帶。無論待測樣本中是否存在解脲支原體MB蛋白，質控線上包被的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體都會與膠體金標記的解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b結合形成一條紅色線(C線)。C線的顯色是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為該檢測卡的內部質控標準。若反應膜上質控線線和檢測線均不出現，則檢測結果無效。
[0046]本實用新型操作簡便、使用方便快捷、無需專門的設施，且能滿足臨床樣本快速檢測、體檢、流行病學普查等的要求，容易普及到基層醫院。以符號顯示結果，結果觀察更為直觀、快捷，同時也擺脫了對儀器設備、人員的特殊要求，縮短了檢測時間，提高了檢測效率，具有準確、快捷、方便、價廉的特點。
【權利要求】
1.一種解脲支原體抗原金標快速檢測試劑盒，包括檢測條和塑料卡盒；檢測條由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和襯板組成，樣品墊a、膠體金墊、樣品墊b、硝酸纖維素膜、吸樣墊，由下到上依次粘貼在襯板上；在硝酸纖維素膜上包被有檢測線和質控線；塑料卡盒由盒蓋與盒底組成，盒蓋上設有加樣孔和觀察窗，正面靠近觀察窗處標注有產品說明文字，盒底內面設有的卡槽，盒蓋與盒底通過凹凸連接；檢測條安裝在塑料卡盒底部的卡槽內，樣品墊b對應塑料卡盒的加樣孔處，硝酸纖維素膜對應塑料卡盒觀察窗處，檢測線和質控線分別對應塑料卡盒觀察窗T和C標示處。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述膠體金墊為固化膠體金標記解脲支原體MB蛋白單克隆抗體b的無紡布或玻璃纖維；所述檢測線上包被解脲支原體MB蛋白單克隆抗體a，所述質控線上包被的抗體為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗體。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述樣品墊a和樣品墊b為無紡布；所述吸樣墊為吸水濾紙；所述襯板為PVC膠板。
【文檔編號】G01N33/577GK203772870SQ201320634463
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年10月15日 優先權日:2013年10月15日
【發明者】李克生, 杜惠芬 申請人:李克生, 杜惠芬