一種對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析試紙的制作方法
【專利摘要】本實用新型對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析試紙，包括：等寬的條帶狀樣品墊[1]、結合墊[2]、分析膜[3]、吸水墊[4]、粘性底襯[5]和Max線指示貼[6]，吸水墊與分析膜形成第一結合區，結合墊與分析膜形成第二結合區，樣品墊與結合墊形成第三結合區，Max線指示貼粘貼于結合墊與樣品墊上，一側與結合墊邊緣平齊，另一側比樣片墊略短，各結合區長度以及略短長度為相應墊體長度的1/2-3/5。本實用新型具有牢固穩定、尺寸精準、針對性強的特點，尤其適宜在現場對尿液中的氯胺酮進行快速定量檢測。
【專利說明】一種對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析試紙
發明領域
[0001]本實用新型涉及一種基于上轉發光免疫層析技術的試紙結構，特別涉及一種可對尿液中氯胺酮濃度進行精確定量檢測的基于上轉發光免疫層析技術的試紙。
【背景技術】
[0002]氯胺酮(KET)是苯環己哌啶(phencyclidine)的衍生物，別名K粉，是新型毒品的一種，是我國法律法規所規定管制的直接作用于人的中樞神經系統，使人興奮或抑制，連續使用能使人產生依賴性的精神藥物。吸食氯胺酮短期可使說話迷糊，并能引起幻覺、情緒抑郁、鎮靜、催眠，甚至昏睡。長期濫用可使人記憶力衰退及認知能力障礙，并會導致心功能受損害，亦可給人帶來軀體和心理依賴，并會因出現幻覺而傷及自己或他人。K粉通常可以采取氣霧法攝取、口服、靜脈注射、肌注、鼻吸等多種方式吸食，能興奮心血管，吸食過量可致死，具有很強的精神依賴性。K粉成癮后，在毒品作用下，吸食者會瘋狂搖頭，很容易搖斷頸椎；同時，瘋狂的搖擺還會造成心力、呼吸衰竭。吸食過量或長期吸食，可以對心、肺、神經都造成致命損傷，對中樞神經的損傷比冰毒還厲害。
[0003]氯胺酮的檢測方法幾乎包含了現代分析化學的各個領域，有色譜法、光譜法、質譜法等，還涉及生物學檢測的多種經典技術，如免疫層析法、酶聯免疫吸附法等。由于技術水平的限制，目前國際上對氯胺酮的檢測主要采用先篩查后確證的方法，即先采用快速定性檢測方法對吸毒群體進行篩查，然后再用精確定量方法對初篩陽性的樣本進行確證。
[0004]主流的初篩方法是膠體金免疫層析法，它是一種基于多種微孔材料側向毛細虹吸以達到特定靶標捕獲與示蹤的固相標記免疫測定技術。該方法具有簡便、快速和價格低廉等優勢，但是存在敏感性差、肉眼主觀判讀結果、無法精確定量等無法克服的技術缺陷。另外一些在初篩中涉及的技術還包括放射免疫分析法和酶聯免疫吸附法(ELISA)。放射免疫分析法的樣品用量少且無需預處理，準確度較高，但是對操作人員和環境有較大危害；ELISA成本較低，速度較快，靈敏度高，但是樣品需要一定的預處理，檢測時間長達2-3小時，需要酶標儀，且對操作人員的專業水平要求較高，難以實現真正意義的現場在線監控和檢測。
[0005]確證方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和氣/質聯用分析法(GC-MS)。HPLC和GC-MS法具有準確、重復性好，適用于定量檢測等優點，是目前應用最廣泛、最權威的確證毒品的定量方法。但是這兩種方法都需要對樣品進行預處理，操作繁瑣，對操作人員的專業素質和技術熟練水平有較高的要求；而且，這兩種方法的儀器比較昂貴，成本較高，因此只能定位為“初篩完成后針對陽性樣品，由專業技術人員在實驗室中進行結果復核”，不適合現場快速初篩。
[0006]針對氯胺酮初篩所依賴的免疫層析技術存在的技術缺陷，一種新型上轉發光材料(Up-Converting Phosphor, UCP)的出現為其提供了解決的突破點。UCP是新型的稀土金屬晶體光學材料，其獨特的物理結構以及化學組成使其具有自然界中不存在的上轉發光現象，即UCP顆粒可由紅外光激發、發射可見光，由此為所有以UCP顆粒作為生物示蹤物的檢測技術奠定了高信噪比、精確量化分析的堅實基礎；依靠上轉發光技術(Up-convertingPhosphor Technology, UPT)促成了免疫層析技術與UCP結合成為上轉發光免疫層析技術(Up-converting Phosphor Technology based Lateral Flow assay, UPT-LF assay),即通過一系列表面修飾與活化后將UCP顆粒作為示蹤物應用于免疫層析，在紅外光照射下以獨特的上轉發光現象揭示生物活性分子之間高敏感特異的識別。使用上轉發光免疫分析儀即可對UPT免疫層析試紙上由UCP產生的特異檢測信號進行激發、接收、轉換，從而實現目標被檢物的準確定量。UPT-LF試紙檢測過程中樣品無需預處理，加樣后數分鐘可完成檢測，市售上轉發光免疫分析儀價格低廉、操作簡便、易于攜帶，可在數秒內掃描獲取定量結果，因此無專業背景人員也可在現場快速實現特定靶標的精確定量檢測。由此可見，通過UCP獨特的光學特性針對性的解決了傳統免疫層析技術敏感性差、不可精確定量的問題，同時保留了層析技術簡便快捷的技術優勢。
[0007]綜上所述，利用UPT-LF對尿液中氯胺酮濃度進行精確定量檢測，將會大幅提升氯胺酮現場初篩的準確性、可靠性。
[0008]然而，目前已有的免疫層析試紙各區域結構相對松散，存在試紙裝載中易于散落的缺點，且試紙結構對氯胺酮特性針對性較差，因此有必要設計針對氯胺酮定量檢測的上轉發光免疫層析試紙。
[0009]發明技術
[0010]為了克服現有技術中存在的缺陷，本實用新型目的在于提供一種結構更牢固的對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙。
[0011]本實用新型提供的一種對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙，包括:等寬的條帶狀樣品墊、結合墊、分析膜、吸水墊、粘性底襯和Max線指示貼，其中，樣品墊、結合墊、分析膜和吸水墊依次粘貼于粘性底襯上，其中分析膜貼于粘性底襯的中間，吸水墊貼于分析膜的一側且與分析膜形成第一結合區，結合墊貼于分析膜的另一側且與分析膜形成第二結合區，樣品墊貼于結合墊的另一側之上且與結合墊形成第三結合區，Max線指示貼粘貼于結合墊與樣品墊上且覆蓋結合墊；所述第一結合區長度為吸水墊長度的1/2-3/5，所述第二結合區長度為結合墊長度的1/2-3/5 ;所述第三結合區長度為樣品墊長度的1/2-3/5。
[0012]其中，Max線指示貼與結合墊重疊一側的邊緣與結合墊平齊，與樣品墊重疊一側的邊緣比樣片墊略短，略短部分長度為樣品墊長度的1/2-3/5。
[0013]具體的，所述第一結合區長度為吸水墊長度的11/20 ;所述第二結合區長度為結合墊長度的11/20 ;所述第三結合區長度為樣品墊長度的11/20 ；
[0014]分析膜上在長度方向間距設置有平行的檢測帶T和質控帶C，檢測帶T中包被有氯胺酮-牛血清白蛋白交聯抗原，質控帶C中包被有兔抗羊IgG。
[0015]結合墊中固定有UCP結合物混合物，UCP結合物混合物中包括:檢測結合物和質控結合物，檢測結合物為UCP -氯胺酮單克隆抗體結合物，質控結合物為UCP -羊IgG結合物；
[0016]樣品墊為經緩沖液、表面活性劑、封閉蛋白、無機鹽處理的濾尿墊。
[0017]采用以上方案，本實用新型對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙，整個試紙涉及的重疊區域包括“吸水墊與分析膜重疊的第一結合區”、“結合墊與分析膜重疊的第二結合區”、“樣品墊與結合墊重疊的第三結合區”，均采用中度偏重度重疊方式，根據所確定的檢測目標物氯胺酮與試劑的結合及其在試紙上的移動特點，設計重疊幅度為各自的1/2-3/5 (即10/20-12/20)，同時兼顧液體樣本在試紙各部分內部側向流動的充分性以及液體樣本在樣品墊與結合墊中的充分浸潤混勻，一方面保證較為適宜的流動時間，另一方面使得樣本中的檢測靶標與檢測結合物通過樣品墊與結合墊的較大重疊得以充分反應；“Max線指示貼粘貼結合墊、樣品墊且覆蓋結合墊”的重疊方式，一方面，Max線指示貼全覆蓋且粘貼，相當于一個上蓋，可以使夾在其與粘性底襯之間的結合墊與樣品墊結合更牢固，保證重疊區域的穩定性，避免試紙裝載中出現散落，另一方面，Max線指示貼用隔水材料制成，Max線指示貼、結合墊、樣品墊、粘性底襯的依次疊置與固定，形成了在隔水的Max線指示貼和粘性底襯之間的液體流道，避免液體樣本直接跨區域流動。
[0018]本實用新型通過將UCP顆粒作為示蹤物與免疫層析技術相結合，利用UCP示蹤物無背景干擾的高信噪比光學信號，大幅提升了傳統層析技術的檢測敏感性，并賦予其精確定量的能力，同時完整保留了免疫層析技術操作簡便、快捷的優勢。因而，最終所建立的對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙，集成了操作簡便、快速、敏感性高、特異性好、可精確定量等諸多特性，尤其適宜在現場對尿液中的氯胺酮進行快速定量檢測。將會大幅提升氯胺酮現場初篩的準確性、可靠性。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0019]圖1:本實用新型氯胺酮定量檢測試紙立體結構圖；
[0020]圖2:本實用新型氯胺酮定量檢測試紙剖面結構示意圖；
[0021]圖3:本實用新型氯胺酮定量檢測試紙粘貼示意圖；
[0022]圖4:對尿液中氯胺酮標準品濃度檢測的標準曲線。
[0023]1、樣品墊、2、結合墊、3、分析膜、4、吸水墊、5、粘性底襯、6、Max線指示貼、7、UCP結合物混合物、8、UCP-氯胺酮單克隆抗體結合物、9、UCP-羊IgG結合物、10、檢測帶T、11、質控帶C。
[0024]下面結合附圖進一步說明本實用新型。
【具體實施方式】:
[0025]參見圖1和圖2所示，本實用新型提供對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙，由等寬的條帶狀樣品墊[I]、結合墊[2]、分析膜[3]、吸水墊
[4]、粘性底襯[5]、Max線指示貼[6]幾部分組成。其中:
[0026]樣品墊[I]為經緩沖液、表面活性劑、封閉蛋白、無機鹽處理的濾尿墊；
[0027]結合墊[2]中固定有UCP結合物混合物[7]，UCP結合物混合物[7]中包括:檢測結合物和質控結合物，檢測結合物為UCP-氯胺酮單克隆抗體結合物[8]，質控結合物為UCP-羊IgG結合物[9]；
[0028]分析膜[3]上設置有檢測帶T[10]、質控帶C[ll]，兩條帶在長度方向上相互平行且有一定間隔；檢測帶τ[ιο]包被有氯胺酮-牛血清白蛋白交聯抗原，質控帶C[ll]包被有兔抗羊IgG ；
[0029]樣品墊[I]、結合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼于粘性底襯[5]上，其中分析膜[3]貼于粘性底襯[5]的中間，吸水墊[4]貼于分析膜[3]的一側之上，兩者重合部分形成第一結合區，第一結合區長度LI為吸水墊[4]長度的1/2-3/5，較好為11/20 ;結合墊[2]貼于分析膜[3]的另一側之上，兩者重合部分形成第二結合區，第二結合區長度L2為結合墊[2]長度的1/2-3/5，較好為11/20 ;樣品墊[I]貼于結合墊[2]的另一側之上，兩者重合部分形成第三結合區，第三結合區長度3L為樣品墊[I]長度的1/2-3/5，較好為11/20 ;Max線指示貼[6]粘貼于結合墊[2]與樣品墊[I]之上且覆蓋結合墊[2]，其中與結合墊[2]重疊一側，邊緣與結合墊[2]平齊；與樣品墊[I]重疊一側，邊緣比樣片墊[I]略短，略短部分長度L4為樣品墊[I]長度的1/2-3/5,較好為11/20。
[0030]該上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙的制備方法為:
[0031]A.樣品墊[I]的制備:將4ml樣品墊處理液(ρΗ7.2磷酸鹽緩沖液，含0.01%SDS、
0.5%脫脂奶粉、2%NaCl)滴加到20cmX 1.5cm的濾尿墊上，于37°C下烘干2h，得樣品墊[I]，備用;
[0032]B.結合墊[2]的制備:將檢測結合物(UCP-氯胺酮單克隆抗體結合物[8])和質控結合物(UCP-羊IgG結合物[9])混合，得UCP結合物混合物[7]，用結合物稀釋液(PH7.2磷酸鹽緩沖液，含1%脫脂奶粉)將UCP結合物混合物[7]稀釋至終濃度為2mg/ml，將UCP結合物混合物[7]加于玻璃纖維、聚酯膜或無紡布上，于45°C下烘干1.5h，得結合墊[2]，備用；
[0033]C.分析膜[3]的制備:將2mg/ml氯胺酮_牛血清白蛋白交聯抗原和2mg/ml兔抗羊IgG噴點于硝酸纖維素膜或尼龍膜上分別作為檢測帶T[10]和質控帶C[ll]，于37°C下烘干lh，得分析膜[3]，備用；
[0034]D.將樣品墊[I]、結合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼于粘性底襯[5](可選擇PVC板等隔水材料)上，將Max線指示貼[6](可選擇PVC膜等隔水材料)粘貼于樣品墊[I]、結合墊[2]上，確保相互之間的重疊關系(如圖3所示)；將試紙剪切為4mm寬單獨可用的成品，得本實用新型尿液中氯胺酮濃度定量檢測試紙；成型的試紙可直接使用或置入塑料外殼中使用。
[0035]使用本實用新型對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙定量檢測氯胺酮的方法:
[0036]A.添加樣品:將待測樣品(尿液)100 μ I/條滴加至上述本實用新型氯胺酮定量檢測試紙的樣品墊[I]上；
[0037]B.層析反應:靜置數分鐘待層析反應完成；
[0038]C.結果判讀:用市售上轉發光免疫分析儀對試紙進行掃描，將檢測帶T [10]和質控帶c[ll]的信號強度(即峰面積)依次賦值于T和C，τ/c為氯胺酮的檢測值；
[0039]D.結果定量:依次對氯胺酮系列濃度標準品進行測定獲得與每個濃度對應的T/C值，以Τ/c值作為X、以標準品濃度作為Y，繪制標準濃度工作曲線并擬合定量計算公式，將每個樣品檢測獲得的Τ/c值代入定量計算公式即可獲得其中所含氯胺酮的精確濃度。
[0040]對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析(UPT-LF)試紙檢測氯胺酮標準品敏感性與線性范圍:
[0041]將購自公安部物證鑒定中心的氯胺酮標準品用標準尿稀釋后，100 μ I/條加到本實用新型氯胺酮定量檢測試紙上，層析數分鐘后掃描，標準曲線見圖4，得出的實驗結果如表1:
[0042]表1:本實用新型氯胺酮定量檢測試紙檢測氯胺酮標準品敏感性
【權利要求】
1.一種對尿液中氯胺酮濃度進行定量檢測的上轉發光免疫層析試紙，其特征在于，該試紙的組成結構包括:等寬的條帶狀樣品墊[I]、結合墊[2]、分析膜[3]、吸水墊[4]、粘性底襯[5]、Max線指示貼[6]，其中，樣品墊[I]、結合墊[2]、分析膜[3]和吸水墊[4]依次粘貼于粘性底襯[5]上，其中分析膜[3]貼于粘性底襯[5]的中間，吸水墊[4]貼于分析膜[3]的一側且與分析膜[3]形成第一結合區，結合墊[2]貼于分析膜[3]的另一側且與分析膜[3]形成第二結合區，樣品墊[I]貼于結合墊[2]的另一側之上且與結合墊[2]形成第三結合區，Max線指示貼[6]粘貼于結合墊[2]與樣品墊[I]上且覆蓋結合墊[2];所述第一結合區長度為吸水墊[4]長度的1/2-3/5，所述第二結合區長度為結合墊[2]長度的1/2-3/5 ;所述第三結合區長度為樣品墊[I]長度的1/2-3/5。
2.如權利要求1所述的上轉發光免疫層析試紙，其特征在于，Max線指示貼[6]與結合墊[2]重疊一側的邊緣與結合墊[2]平齊，與樣品墊[I]重疊一側的邊緣比樣片墊[I]略短，略短部分長度為樣品墊[I]長度的1/2-3/5。
3.如權利要求1或2所述的上轉發光免疫層析試紙，其特征在于，所述第一結合區長度為吸水墊[4]長度的11/20 ;所述第二結合區長度為結合墊[2]長度的11/20 ;所述第三結合區長度為樣品墊[I]長度的11/20。
4.如權利要求3所述的上轉發光免疫層析試紙，其特征在于，所述Max線指示貼[6]由隔水材料制成。
5.如權利要求4所述的上轉發光免疫層析試紙，其特征在于，分析膜[3]上在長度方向間距設置有平行的檢測帶τ[10]和質控帶C[ll]，檢測帶τ[ιο]中包被有氯胺酮-牛血清白蛋白交聯抗原，質控帶c[ll]中包被有兔抗羊IgG。
6.如權利要求5所述的上轉發光免疫層析試紙，其特征在于，結合墊[2]中固定有UCP結合物混合物[7]，UCP結合物混合物[7]中包括:檢測結合物和質控結合物，檢測結合物為UCP-氯胺酮單克隆抗體結合物[8]，質控結合物為UCP-羊IgG結合物[9]；
7.如權利要求6所述的上轉發光免疫層析試紙，其特征在于，樣品墊[I]為經緩沖液、表面活性劑、封閉蛋白、無機鹽處理的濾尿墊。
【文檔編號】G01N33/577GK203414472SQ201320551609
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】周蕾, 楊笑熳, 楊瑞馥, 黃艷鵬, 李靖, 林長青 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 中海智（北京）科技有限公司, 北京熱景生物技術有限公司