專利名稱：孔雀石綠快速檢測裝置的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及生物技術領域，具體涉及一種孔雀石綠快速檢測裝置及其使用方法。
背景技術：
孔雀石綠(Malachite green, MG):又名堿性綠、鹽基塊綠,是一種帶有金屬光澤的綠色結晶體，屬三苯甲烷類染料，過去常被用于制陶業、紡織業、皮革業、食品顏色劑和細胞化學染色劑，近來常被用于水生動物中的真菌和原生物感染。孔雀石綠從1933年起其作為驅蟲劑、殺菌劑、防腐劑在水產中使用，后被廣泛用于預防與治療各類水產動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等，特別在治療水霉病上具有非常有效的作用。孔雀石綠是三個芳香胺的聚合物，存在潛在的致癌性，其陽離子化形式對人體的危害極大，其嚴重的“三致”毒性對人類健康與環境造成嚴重危害，這在各種毒理學實驗中已得到證實。隱孔雀石綠是已知的孔雀石綠在魚體及其他生物體內的主要代謝產物和存在形式，屬于脂溶性藥物，危害程度比孔雀石綠更大，在體內殘留時間更長，孔雀石綠Carbinol Base是孔雀石綠和隱孔雀石綠的相互轉化的中間產物。由于孔雀石綠及其代謝產物隱孔雀石綠在魚體內和環境中殘留時間長，并有致突變、致畸和致癌的危險性，FDA早已禁止孔雀石綠在漁業中應用。加拿大于1992年已禁止其作為魚場殺菌劑使用，且加拿大和美國均規定在食用魚等水產品中禁止檢出孔雀石綠和無色孔雀石綠。歐盟于2002年6月也頒布法令禁止其在作為食品魚的魚場中使用，我國也于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中。農業部2001年10年I日實施的NY5070-2001《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》中，將孔雀石綠列為不得檢出。2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(農業部公告193號)。農業部辦公廳于2005年7月7日發布了《關于組織查處“孔雀石綠”等禁用獸藥的緊急通知》，要求各地盡快組織開展孔雀石綠等禁用藥物的專項整治工作。但由于孔雀石綠低廉的價格及在水霉病防治方面尚無很好的替代品，一些不法商販仍在非法使用，致使孔雀石綠事件仍有發生，給國家經濟和人民健康造成了嚴重影響。2002年5月歐盟向我國通報在2批浙江舟山向德國出口鰻魚中檢出孔雀石綠(摘自國家質檢總局[2002]第65號文件“進出口食品安全警示通報”)。隨后，日本發現我國出口的鰻魚中發現孔雀石綠和隱孔雀石綠殘留。2005年6月5日，英國食品標準局在英國一家知名超市連鎖店出售的鮭魚體內發現“孔雀石綠”成分，弓丨發歐洲國家繼“蘇丹紅I號”之后的又一食品安全警報。在國內，重慶市執法部門在某水產交易市場查獲600多只含有孔雀石綠的甲魚。2006年3月韓國媒體報道中國產養殖淡水鰻魚被檢查出孔雀石綠，隨后日本又在我國魚粉中檢測出孔雀石綠。2006年11月香港食物安全中心日前在抽取淡水魚樣本化驗時發現，15個桂花魚樣本有11個含有孔雀石綠。上述孔雀石綠事件的發生給國家經濟和人民健康帶來一定影響。因此，在國際社會普遍關注食品安全的形勢下，鑒于孔雀石綠的危害性，為保證人民身體健康，保障國家經濟發展，建立孔雀石綠及其代謝物的快速檢測技術顯得尤為必要。[0004]孔雀石綠-隱孔雀石綠結構在體內相互轉化具有不確定性，有的實驗證明孔雀石綠在生物體內代謝轉化為隱孔雀石綠，也有文獻報道說隱孔雀石綠在在冰凍的魚體內轉化為孔雀石綠。因此，對于孔雀石綠及其代謝物的檢測現在仍以孔雀石綠和隱孔雀石綠的總量來計算其藥物殘留。儀器分析法具有準確度高、重復性好、適于定量檢測等優點，是孔雀石綠檢測的確證方法。但無論采用何種儀器分析方法，都存在著檢測費用高昂，需要專業人員操作等問題。針對此問題，國內外研究者開始研究能彌補儀器檢測法不足的快速檢測方法。其中免疫分析因具有的高特異性和極低檢測限等優點在臨床、生物制藥和環境化學等領域得到廣泛應用，該方法一般不需要貴重精密儀器，對于操作人員技術要求不高，容易普及和推廣，尤其適合現場篩選和大批量樣品快速篩查分析，現已成為當前最具競爭性和挑戰性的檢測分析技術之一。免疫層析技術是上世紀80年代初期的一種簡便快速免疫檢測技術，由該技術制成的免疫層析試紙條通常由以下幾部分組成:背襯及粘貼在背襯上的樣品墊、結合墊、纖維素膜、吸收墊等。檢測時，將樣品滴加到樣品墊上，樣品會通過毛細作用在層析條上遷移，在遷移的過程中，與結合墊上的標記物發生特異性反應，產生免疫復合物，該免疫復合物繼續遷移，與纖維素膜上檢測區域的相應抗原/抗體發生特異性結合，形成肉眼可見的檢測帶。現有的免疫層析試紙條產品常用的示蹤標記粒子有納米金、納米硒、乳膠等等，其中以納米金應用最為廣泛。目前，免疫層析試紙條產品已在疾病最為成熟的免疫層析產品已在醫學檢測、食品安全、藥物濫用等領域得到廣泛應用。目前，市場上已有檢測孔雀石綠的免疫層析試紙條，但普遍存在著靈敏性不理想的缺陷。
發明內容本發明旨在針對現有孔雀石綠檢測試紙條靈敏性不理想的缺陷提供一種高靈敏度的孔雀石綠快速檢測裝置。如上所述的檢測裝置，包括試紙條和反應杯兩部分:試紙條包括底板以及底板上依次搭接粘貼的樣品墊、層析膜、吸水紙組成；反應杯內含有標記物-孔雀石綠的抗體/受體復合物。如上所述的試紙條，其特征是在免疫層析復合膜上分別設有檢測區和質控區。如上所述的檢測區，其特征是檢測區包被有孔雀石綠-載體蛋白偶聯物。如上所述的免疫層析檢測裝置，其特征是其使用方法是將待檢樣本加入反應杯中，樣本中的孔雀石綠與標記物-孔雀石綠抗體/受體充分反應，反應結束后，將試紙條的樣品墊一端插入反應杯中，反應杯中的液體通過層析作用到達層析膜，與層析膜上檢測區和質控區中的分子發生反應，檢測區信號的強弱提示所檢測樣本中孔雀石綠含量的高低(濃度越高，信號越弱)。本實用新型具有以下有益效果:I)靈敏性好。本實用新型提供了一種含有標記物-孔雀石綠抗體/受體的反應杯。待檢樣品首先在該反應杯中與標記物-孔雀石綠抗體/受體發生充分的結合反應。與現有帶有結合墊的免疫層析試紙條相比，本實用新型反應更為充分，能夠有效提高檢測的靈敏性。2)簡便快捷。本實用新型提供的檢測裝置能夠快速檢測樣本中的孔雀石綠，檢測時間更短，檢測更為方便。整個檢測過程(包含樣品前處理)僅需50min左右。3)成本低，易于推廣。本實用新型生產工藝簡單，成本低廉，易于大規模生產，也易于推廣使用。
以下結合附圖對本實用新型做進一步說明。
圖1是本實用新型反應杯的結構示意圖。圖2是本實用新型試紙條的結構示意圖。圖1中9:反應杯；10:標記物抗體偶聯物(標記物-孔雀石綠受體/抗體)。圖2中1:樣品塾；18:檢測區；19:質控區；7:層析 旲；8:吸水塾。
具體實施方式
從圖1、圖2可以看出，一種孔雀石綠檢測裝置，其包反應杯(圖1)和試紙條(圖2)兩部分。反應杯(圖1)中含有標記物-抗體偶聯物10 (標記物-孔雀石綠受體/抗體)。試紙條(圖2)包括底板以及底板上依次搭接粘貼的樣品墊1、層析膜7、吸水墊8。層析膜7上設有檢測區18和質控區19。實施例
I)將魚蝦去皮取肉，用勻質器勻質樣品至糊狀；2)稱取5g左右均質好的樣品，放入50mL離心管中；3)并加入2mL提取試劑A和IOmL提取試劑B高速震蕩3_4min ；4)將試劑C中粉末全部倒入上述3)中，擰緊蓋子并上下充分搖晃20-30S，然后4000rpm 離心 5min ；5)從中轉移4mL上清溶液到新的15mL離心管中，加入50 μ L氧化劑混勻，室溫靜置 3min ；6)加入等體積的正己烷，擰緊蓋子上下充分顛倒混勻5-6次，室溫下靜置3min，然后小心吸棄上層后，并將約3mL下層倒入5mL離心管中，60°C下氮氣吹干；7)加入200 μ L樣品復溶液，震蕩15-20s，待測；8)吸取200 μ L的處理后的備用樣品于反應杯中，抽吸5-10次，混合均勻；9)室溫下計時3分鐘；10)第一次3分鐘溫育結束后，按下計時器停止計時，將試紙條插入到反應杯中(樣品墊一端朝下);11)開始室溫下第二次4分鐘溫育，并計時；12)當第二次4分鐘溫育結束，停止計時，從反應杯中取出試紙條，去掉試紙條的樣品墊并進行結果判讀:檢測線信號越弱，樣品中的孔雀石綠含量越高。
權利要求1.一種孔雀石綠檢測裝置，包括試紙條和反應杯兩部分:試紙條由底板以及底板上依次搭接粘貼的樣品墊、層析膜、吸水紙組成；反應杯內含有標記物-孔雀石綠的抗體/受體復合物。
2.如權利要求1所述孔雀石綠檢測裝置，其特征是在免疫層析復合膜上分別設有檢測區和質控區。
3.如權利要求1所述孔雀石綠檢測裝置，其特征是檢測區包被有孔雀石綠-載體蛋白偶聯物。
專利摘要本實用新型涉及生物技術領域，具體涉及一種孔雀石綠快速檢測裝置，包括試紙條和反應杯兩部分試紙條包括底板以及底板上依次搭接粘貼的樣品墊、層析膜、吸水紙組成；反應杯內含有標記物-孔雀石綠的抗體/受體復合物。檢測樣品時，將待檢樣本加入反應杯中，樣本中的孔雀石綠與標記物-抗體/受體充分反應，反應結束后，將試紙條的樣品墊一端插入反應杯中，反應杯中的液體通過層析作用到達層析膜，與層析膜上檢測區和質控區中的分子發生反應，檢測區信號的強弱提示所檢測樣本中孔雀石綠含量的高低(濃度越高，信號越弱)。本實用新型具有靈敏性好、簡便快捷、成本低，易于推廣等優勢。
文檔編號G01N33/558GK203164188SQ201320035529
公開日2013年8月28日 申請日期2013年1月24日 優先權日2013年1月24日
發明者朱海, 付輝, 李金峰, 張美娟, 馬濤, 李穎, 王西麗, 余優慧, 石錫蓮, 陳玉玲 申請人:深圳市易瑞生物技術有限公司