檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒，包括酶標記的纖維連接蛋白的抗體或者酶標記的纖維連接蛋白的單克隆抗體或者酶標記的纖維連接蛋白的多克隆抗體；包被有纖維連接蛋白的抗體或者纖維連接蛋白的單克隆抗體或者纖維連接蛋白的多克隆抗體的載體；纖維連接蛋白校準品；化學發光底物和洗滌液。還提供了上述試劑盒的制備方法。本發明的試劑盒具有高特異性、高靈敏度、高精確性、高準確性、簡便快速等優點，并且使用成本低，更易推廣應用。
【專利說明】檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫分析及生物醫學領域，尤其涉及一種檢測試劑盒及其制備方法，特別是一種采用化學發光免疫分析法檢測尿液中纖維連接蛋白又稱纖維結合蛋白(FN)濃度的試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002]纖維連接蛋白又稱纖維結合蛋白(Fibronectin,簡稱FN),有兩條相類似的多肽鏈亞基組成，亞基的分子量為220-250KD。現有技術中采用免疫擴散法和ELISA雙抗體夾心技術測定尿液中纖維連接蛋白(FN)濃度，其缺點為操作繁瑣、工作強度大、保持時間長，一般需8-48小時、其定量的精確度差。
[0003]因尿液中纖維連接蛋白(FN)的濃度低，所以國內外至今未見有用試劑盒及方法的報導。本發明申請的測定尿液中纖維連接蛋白(FN)濃度的試劑盒及方法可用于泌尿系統的腫瘤早期篩查。
[0004]化學發光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay, CLIA)于 1977 年問世，1985年第一代化學發光免疫分析試劑盒研制成功并投放市場。進入九十年代，化學發光免疫分析試劑盒的研制和自動化測量儀的生產取得了突破性進展，從而進入高速發展階段。化學發光免疫分析是繼熒光、放射性同位素和酶免疫分析之后發展起來的一項新的免疫分析技術，根據大量的實驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及發展前景來看，在非放射性標記分析技術中化學發光免疫分析處于領先地位，它不僅具有免疫反應的特異性，而且具有高靈敏性和穩定性。
[0005]化學發光免疫分析技術具有靈敏度高、快速、準確、重復性好、效期長并安全無毒無污染等優點，成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術的首選。
【發明內容】
[0006]針對現有技術中存在的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒及其制備方法，本發明將化學發光技術與纖維連接蛋白(FN)的免疫分析學有效地結合，提供了一種高特異性、高靈敏度、高精確性、高準確性、簡便快速地檢測尿液中纖維連接蛋白(FN)的濃度的試劑盒，該試劑盒適于在產業上能有效地推廣應用。
[0007]本發明一種檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒，包括:酶標記的纖維連接蛋白(FN)的抗體或者酶標記的纖維連接蛋白(FN)的單克隆抗體或者酶標記的纖維連接蛋白(FN)的多克隆抗體；包被有纖維連接蛋白(FN)的抗體或者纖維連接蛋白(FN)的單克隆抗體或者纖維連接蛋白(FN)的多克隆抗體的載體；纖維連接蛋白(FN)校準品；化學發光底物和洗滌液。
[0008]進一步的，所述載體為聚苯乙烯微孔板、聚苯乙烯珠或管或磁性顆粒。
[0009]進一步的，所述的洗滌液為1，2-二氧乙烷類衍生物，所述的1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛燒)_1，2_ 二氧乙燒、或者3- (2’ -螺旋金剛燒)~4_甲氧基-4- (3’ -憐酸氧基)苯基-1，2- 二氧乙烷、精制的二磷酸胞苷(⑶P-Star )。
[0010]進一步的，所述化學發光底物為包含有緩沖液，每升緩沖液中含有24gTris、160gNaCl、4g KCl、15mL HCl、Iml Proclin300 和 200ml 的 3- (2，-螺旋金剛烷)-4-曱氧基_4_ (3’ -憐酸氧基)苯基_1，2- 二氧乙燒，余量為雙蒸水。
[0011]本發明還提供了上述試劑盒的制備方法，包括一個制備包被有纖維連接蛋白(FN)的抗體或者纖維連接蛋白(FN)的單克隆抗體或者纖維連接蛋白(FN)的多克隆抗體的載體的步驟，一個用堿性磷酸酶標記纖維連接蛋白(FN)的抗體或者纖維連接蛋白(FN)的單克隆抗體或者纖維連接蛋白(FN)的多克隆抗體的步驟；還包括一個以纖維連接蛋白(FN)純品配制纖維連接蛋白(FN)校準品的步驟，一個配制洗滌液的步驟，一個配制化學發光底物的步驟，以及分裝上述各組份并組裝為成品的步驟。
[0012]進一步的，在一個制備包被有纖維連接蛋白(FN)的抗體或者纖維連接蛋白(FN)的單克隆抗體或者纖維連接蛋白(FN)的多克隆抗體的載體的步驟中，首先將纖維連接蛋白(FN)的抗體或者纖維連接蛋白(FN)的單克隆抗體或者纖維連接蛋白(FN)的多克隆抗體用
0.05MpH為7.2的磷酸鹽緩沖液配制成所需濃度(如10ug/ml)的包被液；然后進行包被，在包被的過程中采用生理鹽水洗滌2-5次；最后使用pH值為7.0?7.5的磷酸鹽封閉液進行封閉。
[0013]進一步的，在一個用堿性磷酸酶標記纖維連接蛋白(FN)的抗體或者纖維連接蛋白(FN)的單克隆抗體或者纖維連接蛋白(FN)的多克隆抗體的步驟中，所述的堿性磷酸酶標記是采用戊二醛法進行標記。
[0014]進一步的，所述的酶可以為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0015]其中，所述纖維連接蛋白(FN)校準品為標準級，純度不低于90%、抗體包被板為48或96孔的微孔板條、酶標記纖維連接蛋白(FN)為偶聯堿性磷酸酶、化學發光底物液為AMPPD、濃縮洗滌液為Tris-HCl。
[0016]本發明的試劑盒可以準確地定量檢測出人尿液中纖維連接蛋白(FN)的含量。它具有高特異性、高靈敏度、高精確性、高準確性、簡便快速等優點。該尿纖維連接蛋白(FN)測定試劑盒(化學發光法)的各項指標均達到或超過透射(散射)比濁免疫分析法。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發光測量儀，特別適合廣大的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據本發明的試劑盒，酶標記的纖維連接蛋白(FN)抗體與載體上包被的纖維連接蛋白(FN)抗體和被測樣品的纖維連接蛋白(FN)抗原形成“雙抗體夾心”結構，因此本發明采用的“雙抗體夾心一步法”反應模式，既有效地利用了化學發光技術原理、又確保了檢測的靈敏性。
[0017]本發明的試劑盒應用的是酶催化發光底物，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，因而具有與透射(散射)比濁免疫分析法同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現今的透射(散射)比濁免疫分析法分析靈敏度提高約10倍，可為臨床診斷提供更為特異、快速、可靠的依據。
[0018]在本發明的研究過程中，本發明的發明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質量鑒定，包括標記抗體與包被抗體的活性、載體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、ALP的活性、化學發光底物的發光強度及發光持續時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和保護液進行實驗，選擇出最適合的包被緩沖液和保護液，通過抗體不同包被濃度實驗找到最佳的濃度條件。對于ALP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使酶標記物長期保持活性穩定的稀釋液。
[0019]本發明與已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發明將化學發光技術與纖維連接蛋白(FN)的免疫分析學有效地結合，提供了一種高特異性、高靈敏度、高精確性、高準確性、簡便快速地檢測尿液中纖維連接蛋白(FN)的濃度的化學發光免疫分析定量測定試劑盒，本發明的試劑盒可應用于開放式的化學發光測量儀，使用成本低，更易推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1檢測100例正常人尿液樣本中纖維連接蛋白(FN)濃度(mg/L)。
[0021]圖2是本試劑盒的線性范圍實驗結果。
【具體實施方式】
[0022]實施例1本發明的試劑盒的制備方法
[0023]一、酶標抗體制備
[0024]纖維連接蛋白(FN)抗體用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯，對PBS充分透析，加等體積甘油，-2 (TC以下保存。
[0025]酶標單抗稀釋液配制稱量12.12g的Tris，5g BSA和Iml Proclin300,將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水至1L，溶解混勻。
[0026]采用方陣法選擇酶標抗體的工作濃度大于1:5000。
[0027]二、纖維連接蛋白(FN)校準品的制備
[0028]用纖維連接蛋白(FN)純品配制，分裝0、20、40、60、100mg/L共5瓶。
[0029]三、固相包被板的制備
[0030](I)包被:稱量 2.20g 的 NaH2PO4.2H20,12.90g 的 Na2HPO4.12H20 和 9.0g 的 NaCl于IL的潔凈容器中，加入IL的雙蒸水溶解混勻后，PH為7.2，加入適量纖維連接蛋白(FN)抗體混勻,然后加入微孔板各孔中，每孔IOOul, 40C 24h。
[0031](2)洗滌:用生理鹽水洗三次。
[0032](3)封閉稱量 0.2g 的 NaH2PO4.2H20, 2.9g 的 Na2HPO4.12H20、lOgBSA、和 ImlProclin300,將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水至1L，溶解混勻，測定pH值為
7.0。
[0033]每孔分別加入封閉液lOOul，室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行封袋。貼簽后置2-8°C保存。
[0034]四、化學發光底物液
[0035]稱量24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15ml HCl、200ml3_(2’-螺旋金剛烷)_4_ 曱氧基-4-(3’ -磷酰氧基)苯基-1，2- 二氧乙烷和Iml Proclin300,將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水至1L，溶解混勻。
[0036]五、洗滌液
[0037]稱量24g Tris, 160g NaCl, 4g KCl和15ml HCl于潔凈容器中，加雙蒸水至1L,溶解混勻，調整PH至7.4。
[0038]六、半成品及成品組成
[0039]上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成纖維連接蛋白(FN)定量測定試劑盒(化學發光法)。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。
[0040]綜上，本發明的發明人還對試劑盒的反應模式和反應條件進行了實驗研究，最終確定了雙抗體夾心一步法反應模式，并就不同的反應時間對實驗結果的影響進行了實驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發光底物液發光持續時間的測定及不同發光時間對測定值的影響實驗表明:在加入化學發光底物液后30-90分鐘之間進行測量為最佳，其結果也較為準確。
[0041]實施例2?3本發明試劑盒的制備方法
[0042]除分別以聚苯乙烯珠、管作為載體、封閉液的pH值為7.5，其余均以與實施例1相同的方法制備纖維連接蛋白(FN)定量測定試劑盒。
[0043]實施例4本發明試劑盒的制備方法
[0044]除以磁性顆粒作為載體，用戊二醛將纖維連接蛋白(FN)的包被抗體與磁顆粒偶聯夕卜，其余均以與實施例1相同的方法制備纖維連接蛋白(FN)定量測定定劑盒。
[0045]實施例5本發明的試劑盒的使用方法
[0046]以上實施例1制備的尿液中纖維連接蛋白(FN)的濃度的化學發光免疫分析定量測定試劑盒的具體操作如下:
[0047]I)自4°C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。
[0048]2)取出包被板條，插入板架上。
[0049]3)加樣，每孔加樣lOOul，
[0050]4)用微量震蕩器充分振蕩混勻，用封板膜封板37°C水浴30分鐘。
[0051]5)用稀釋后的洗滌液洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。
[0052]6)加酶標記物，每孔lOOul，
[0053]7)重復 4)至 5)
[0054]8)加化學發光底物工作液IOOul
[0055]9)用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20-27°C )避光反應30分鐘。
[0056]10)測量必須于加化學發光底物液后的第30-90分鐘內測量，在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU)，測量時間0.2-1.0秒/孔。以校準品濃度為橫坐標，RLU值為縱坐標繪出標準曲線，以各待測尿液RLU值在標準曲線上查出該尿液的纖維連接蛋白(FN)的濃度。
[0057]圖1是檢測100例正常人尿液樣本中纖維連接蛋白(FN)濃度(mg/L)的數據，說明采用本發明的試劑盒和方法測定的尿液中纖維連接蛋白(FN)的濃度是準確的和可靠的。
[0058]實施例6本發明的試劑盒的方法學鑒定
[0059]按照本領域中常規的制造及檢定規程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定。
[0060](I)試劑盒分析靈敏度實驗(見表I)
[0061]具有定量含義的分析靈敏度通常以生物檢測限或功能靈敏度表示。某樣品單次檢測可能具有的最小響應量剛大于空白檢測低限響應量，該樣品內含有的分析物濃度或其他量值為生物檢測限。
[0062]本發明尿液中纖維連接蛋白(FN)的濃度的化學發光免疫分析定量測定試劑盒生物檢測限表達該試劑盒的分析靈敏度。估算采用叉±3；^)以保證99.7%的可能性。
[0063]實驗設計:
[0064]1.1試劑:尿纖維連接蛋白(FN)化學發光免疫分析定量測定試劑盒，批號:20120316
[0065]1.2 樣品:濃度分別為 0mg/L、20mg/L、40mg/L、600mg/L、100mg/L
[0066]1.3方法:各樣品連續檢測12次，讀取各濃度樣品的吸光度值并計算Y、SD。
[0067]表1試劑盒分析靈敏度檢測結果
[0068]
【權利要求】
1.一種檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒，其特征在于包括:酶標記的纖維連接蛋白的抗體或者酶標記的纖維連接蛋白的單克隆抗體或者酶標記的纖維連接蛋白的多克隆抗體；包被有纖維連接蛋白的抗體或者纖維連接蛋白的單克隆抗體或者纖維連接蛋白的多克隆抗體的載體；纖維連接蛋白校準品；化學發光底物和洗滌液。
2.如權利要求1所述的一種檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒，其特征在于:所述載體為聚苯乙烯微孔板、聚苯乙烯珠或管或磁性顆粒。
3.如權利要求1所述的一種檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒，其特征在于:所述的洗滌液為1，2_ 二氧乙烷類衍生物，所述的1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1，2_二氧乙燒、或者3- (2’ -螺旋金剛燒)~4_甲氧基-4- (3’ -憐酸氧基)苯基-1，2- 二氧乙燒、或者 CSPD、或者 CDP-Star。
4.如權利要求1所述的一種檢測尿液中纖維連接蛋白濃度的試劑盒，其特征在于:所述化學發光底物為緩沖液，每升緩沖液中含有24gTris、160gNaCl、4g KCl、15mL HCl、ImlProclin 300和200ml的3- (2’ -螺旋金剛烷)~4~曱氧基-4- (3’ -磷酰氧基)苯基_1，2-二氧乙烷，余量為雙蒸水。
5.權利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于:包括一個制備包被有纖維連接蛋白的抗體或者纖維連接蛋白的單克隆抗體或者纖維連接蛋白的多克隆抗體的載體的步驟，一個用堿性磷酸酶標記纖維連接蛋白的抗體或者纖維連接蛋白的單克隆抗體或者纖維連接蛋白的多克隆抗體的步驟；還包括一個以纖維連接蛋白純品配制纖維連接蛋白校準品的步驟，一個配制洗滌液的步驟，一個配制化學發光底物的步驟，以及分裝上述各組份并組裝為成品的步驟。
6.如權利要求5所述的試劑盒的制備方法，其特征在于:在一個制備包被有纖維連接蛋白的抗體或者纖維連接蛋白的單克隆抗體或者纖維連接蛋白的多克隆抗體的載體的步驟中，首先將纖維連接蛋白的抗體或者纖維連接蛋白的單克隆抗體或者纖維連接蛋白的多克隆抗體用0.05M、pH為7.2的磷酸鹽緩沖液配制成所需濃度的包被液；然后進行包被，在包被的過程中采用生理鹽水洗滌2-5次；最后使用pH值為7.0- 7.5的磷酸鹽封閉液進行封閉。
7.如權利要求5所述的試劑盒的制備方法，其特征在于:在一個用堿性磷酸酶標記纖維連接蛋白的抗體或者纖維連接蛋白的單克隆抗體或者纖維連接蛋白的多克隆抗體的步驟中，所述的堿性磷酸酶標記是采用戊二醛法進行標記。
8.如權利要求5所述的試劑盒的制備方法，其特征在于:所述的酶可以為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
【文檔編號】G01N33/68GK103645330SQ201310724374
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】朱曉敏, 劉穎成, 劉穎冰, 楊杰 申請人:上海北加生化試劑有限公司