一種測定鉛離子的dna酶組裝的手性傳感器的構建方法
【專利摘要】一種測定鉛離子的DNA酶組裝的手性傳感器的構建方法，屬于納米生物技術檢測領域。本發明包括：10nm和20nm的銀納米粒子分別用一對DNA探針進行修飾，修飾的銀納米粒子在DNA酶的作用下組裝成不對稱手性二聚體，銀納米粒子組裝體作為檢測傳感器用于Pb2+的檢測，應用圓二色光譜（CD）進行檢測。本發明應用了一種銀納米粒子探針，借助于Pb2+依賴的DNA酶的作用下，大小銀納米粒子組裝成不對稱的手性二聚體，通過CD信號對Pb2+進行檢測。本發明方法能夠實現對Pb2+的超靈敏檢測，檢測靈敏度高、特異性好，同時可以檢測水溶液中的痕量目標物。
【專利說明】—種測定鉛離子的DNA酶組裝的手性傳感器的構建方法
【技術領域】
[0001]一種測定Pb2+的DNA酶組裝的手性傳感器的構建方法，屬于納米生物技術檢測領域。
【背景技術】
[0002]Pb2+是最具毒性的重金屬離子之一，鉛的污染來自礦山開采、冶煉、橡膠生產、染料、印刷、陶瓷、鉛玻璃、焊錫、電纜及鉛管等生產廢水和廢棄物。另外，汽車尾氣中的四乙基鉛是劇毒物質。隨著我國工農業的迅速發展，環境中重金屬的污染越來越嚴重。重金屬污染引起的毒害持久存在，會隨土壤、水體再次循環而進入食物鏈，對食品安全構成威脅，危害人類生命和健康。目前為止，鉛在生物體內沒有已知的生理作用，任何人體內的鉛均被視為污染，鉛中毒會引發腸胃紊亂，肝、腎以及神經損傷。美國環保署規定飲用水中Pb2+的最高含量不得超過72nM。國家環保部的調查顯示，我國水體重金屬污染問題十分突出，江河湖庫底質的污染率高達80.1%。針對重金屬污染的特點，對其發現和檢測是至關重要的。
[0003]傳統的Pb2+檢測方法包括電感偶合等離子體法(ICP)和原子吸收光譜法，這些方法具有靈敏度高、定量準確等優點，但是所需儀器昂貴、樣品預處理復雜、耗時，且要求檢測人員具備一定的專業知識，分析成本高。化學、生物傳感器由于具有靈敏度高、選擇性好、體積小、造價低等特點，受到了人們的青睞。近年來，隨著納米技術的發展，基于寡核苷酸功能化的納米粒子在食品危害因子檢測方面進行了大量的研究和應用。由于納米粒子具有特殊的性質，如:光學特性、電化學特性、熒光特性、順磁性等，可以利用這些性質所特有的信號進行放大來達到檢測目標物的目的。等離子納米粒子組裝成的手性納米結構具有CD信號，這一發現對納米材料在檢測領域的應用成為一個新的進展，可以應用手性納米材料組裝體的CD信號作為檢測信號對有害物進行檢測。
[0004]DNA酶是經體外篩選得到的一種功能化的DNA分子，這種酶不同于蛋白酶，可以通過化學合成得到，具有良好的熱穩定性和反應活性，同時DNA分子可以修飾多種功能基團，并且可以固定到固相支持物上，目前，大量的目標物具有能夠識別的DNA酶。在重金屬離子存在的條件下，重金屬依賴的DNA酶的底物鏈在RNA堿基切割位點處被切開，Pb2+依賴的DNA酶被稱作“ 17 E"DNA酶，由一條酶鏈和一條底物鏈組成，應用DNA酶建立的Pb2+檢測傳感器引起了人們廣泛的研究興趣。
[0005]本發明是借助于DNA酶的作用將DNA探針修飾的大小銀納米粒子組裝成不對稱的銀納米粒子二聚體，在不同濃度Pb2+存在的條件下，二聚體發生不同程度的解聚，隨著Pb2+濃度的增加，二聚體的解聚程度越大，從而CD信號隨之降低，根據CD信號的強度與Pb2+濃度之間的建立的對應關系，從而對Pb2+含量進行檢測。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種對Pb2+進行檢測與定量的手性傳感器方法，借助于DNA酶的作用將DNA探針修飾的大小銀納米粒子組裝成不對稱的銀納米粒子二聚體，在不同濃度Pb2+存在的條件下，二聚體發生不同程度的解聚，最后通過CD光譜對銀納米粒子組裝體進行測定，從而間接檢測目標Pb2+的含量。
[0007]本發明的技術方案:一種測定Pb2+的DNA酶組裝的手性傳感器的構建方法，包括:IOnm和20nm的銀納米粒子分別用一對DNA探針進行修飾,銀納米粒子在DNA酶的作用下組裝成不對稱手性二聚體，該銀納米粒子組裝體作為檢測傳感器用于Pb2+的檢測，應用CD光譜進行檢測；具體步驟為:
(1)IOnm和20nm的銀納米粒子分別用一對DNA探針進行修飾
將新合成的10nm、20nm的銀納米粒子分別在10000r/min、8000r/min的轉速條件下通過離心濃縮十倍，然后將銀納米粒子分別重懸到包含有50mM NaCl的IOmM Tris-HCl緩沖液中，使得10nm、20nm的銀納米粒子的終濃度分別為50 nM、20 nM ;然后將DNA探針和銀納米粒子按照10:1的摩爾比例進行偶聯，具體如下:1 μ L的20 μ M SI核酸片段加入到100μ L 20 ηΜ的20 nm銀納米粒子中，I μ L的50 μ M S2核酸片段加入到100 μ L 50 ηΜ的10 nm銀納米粒子中，孵育12h后，成功偶聯的銀納米粒子離心三次，將未偶聯的DNA去除，最后納米粒子均重懸到50 UL 25 mM Tris-醋酸緩沖液中(pH 8.2，包含100 mM NaCl)，最終得到偶聯好的銀納米粒子；
51:5’-TCACAGATGA GT-SH-3'；
52:5’-SH-CACGAGTTGA CA-3’ ；
(2)銀納米粒子在DNA酶的作用下組裝成不對稱手性二聚體
整個組裝體系包括:70 μ L SI修飾的20 nm的銀納米粒子，30 μ L S2修飾的10 nm的銀納米粒子，I UL 100 μ M底物鏈(Sub)，2 yL 100 μ M酶鏈(17Ε);首先將整個反應體系加熱到70°C，然后將其自然冷卻至室溫以促進銀納米粒子的組裝；雜交8h后，將組裝產物離心三次，獲得純化好的不對稱銀納米粒子二聚體；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T(rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3'；
17E:5'-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3'；
(3)銀納米粒子組裝體作為檢測傳感器用于Pb2+的檢測，應用CD光譜進行檢測
在不對稱銀納米粒子二聚體中加入一系列不同濃度的Pb2+，在Pb2+的作用下，底物鏈斷裂，從而導致二聚體被分裂成單個的粒子，CD信號的強度降低，將不同目標物濃度下的反應體系用CD光譜進行檢測，得到200nm-800nm的CD光譜圖，隨著Pb2+濃度的增加，不對稱銀納米粒子二聚體的數量逐漸減少，CD信號逐漸降低，根據Pb2+濃度與CD信號強度之間的對應關系，繪制Pb2+濃度與 CD信號強度的標準曲線，從而應用CD信號對Pb2+的濃度進行定量。
[0008]所述的10nm、20nm的銀納米粒子通過硼氫化鈉還原硝酸銀的方法進行合成，合成步驟:0.6 mL 0.1 M硼氫化鈉溶解到20 mL冰水中，再加入5 mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為保護劑，另加入600 μ L 1%的檸檬酸三鈉以得到20nm銀納米粒子，以上混合物在冰浴中處于持續攪拌狀態。然后用兩個恒流泵以30 mL/h的速率，同時分別加入5 mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和5 mL 10 mM的硝酸銀。最后將反應溶液在80°C條件下孵育以去除過量的硼氫化鈉，3 h后得到合成好的IOnm的銀納米粒子，并放入4°C待用。
[0009]本發明的有益效果:本發明提供一種對Pb2+進行檢測與定量的手性傳感器方法，借助于DNA酶的作用將DNA探針修飾的大小銀納米粒子組裝成不對稱的銀納米粒子二聚體，在不同濃度Pb2+存在的條件下，二聚體發生不同程度的解聚，最后通過CD光譜對銀納米粒子組裝體進行測定，從而間接檢測目標Pb2+的含量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1 Pb2+檢測的CD光譜；
圖2 Pb2+檢測的標準曲線。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
測定Pb2+的DNA酶組裝的手性傳感器的構建方法。包括:10nm、20nm的銀納米粒子分別用一對DNA探針進行修飾，銀納米粒子在DNA酶的作用下組裝成不對稱手性二聚體，該銀納米粒子組裝體作為檢測傳感器用于Pb2+的檢測，應用CD光譜進行檢測；具體步驟為:
Cl) 10nm、20nm的銀納米粒子分別用一對DNA探針進行修飾
將新合成的10nm、20nm的銀納米粒子分別在10000r/min、8000r/min的轉速條件下通過離心濃縮十倍，然后將銀納米粒子分別重懸到包含有50mM NaCl的IOmM Tris-HCl緩沖液中，使得10nm、20nm的銀納米粒子的終濃度分別為50 ηΜ、20 ηΜ ;然后將DNA探針和銀納米粒子按照10:1的摩 爾比例進行偶聯，具體如下:1 μ L的20 μ M SI核酸片段加入到100μ L 20 ηΜ的20 nm銀納米粒子中，I μ L的50 μ M S2核酸片段加入到100 μ L 50 ηΜ的10 nm銀納米粒子中，孵育12h后，成功偶聯的銀納米粒子離心三次，將未偶聯的DNA去除，最后納米粒子均重懸到50 UL 25 mM Tris-醋酸緩沖液中(pH 8.2，包含100 mM NaCl)，最終得到偶聯好的銀納米粒子；
51:5’-TCACAGATGA GT-SH-3'；
52:5’-SH-CACGAGTTGA CA-3’ ；
(2)銀納米粒子在DNA酶的作用下組裝成不對稱手性二聚體
整個組裝體系包括:70 μ L SI修飾的20 nm的銀納米粒子，30 μ L S2修飾的10 nm的銀納米粒子，I UL 100 μ M底物鏈(Sub)，2 μ L 100 μ M酶鏈(17Ε);首先將整個反應體系加熱到70°C，然后將其自然冷卻至室溫以促進銀納米粒子的組裝；雜交8h后，將組裝產物離心三次，獲得純化好的不對稱銀納米粒子二聚體；
Sub: 5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T(rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3'；
17E: 5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3'；
(3)銀納米粒子組裝體作為檢測傳感器用于Pb2+的檢測，應用CD光譜進行檢測
在不對稱銀納米粒子二聚體中加入一系列不同濃度的Pb2+，在Pb2+的作用下，底物鏈斷裂，從而導致二聚體被分裂成單個的粒子，CD信號的強度降低。將不同目標物濃度下的反應體系用CD光譜進行檢測，得到200nm-800nm的CD光譜圖，隨著Pb2+濃度的增加，不對稱銀納米粒子二聚體的數量逐漸減少，CD信號逐漸降低，根據Pb2+濃度與CD信號強度之間的對應關系，繪制Pb2+濃度與CD信號強度的標準曲線，從而應用CD信號對Pb2+的濃度進行定量。
[0012](4)檢測靈敏度研究
根據每個目標Pb2+濃度下對應的CD信號強度，以DNA濃度為橫坐標，CD信號強度為縱坐標做出一條標準曲線，根據標準曲線計算出Pb2+的檢測限為0.02 ng mL'
[0013](5)特異性研究
以Mn2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Hg2+、Cu2+為檢測對象,進行特異性分析,加入濃度均為5 ngmL—1，操作方法與Pb2+檢測的操作方法一致，反應體系的CD信號與陰性空白樣品即未加入任何重金屬離子的CD信號進行對比，得到的CD信號與空白樣品的CD信號沒有明顯差別，由此得出其它重金屬離子不能識別Pb2+依賴的DNA酶，此方法的特異性良好。
[0014](6)添加回收實驗
將不同濃度的Pb2+加入到陰性自來水中，用以上方法建立的Pb2+檢測傳感器進行水樣品中的添加回收測定，最終得到的回收率范圍在94%-100%，可以進行實際樣品的檢測。
【權利要求】
1.一種測定Pb2+的DNA酶組裝的手性傳感器的構建方法，其特征在于包括:10nm和.20nm的銀納米粒子分別用一對DNA探針進行修飾，銀納米粒子在DNA酶的作用下組裝成不對稱手性二聚體，該銀納米粒子組裝體作為檢測傳感器用于Pb2+的檢測，應用CD光譜進行檢測；具體步驟為: Cl) 10nm、20nm的銀納米粒子分別用一對DNA探針進行修飾 將新合成的10nm、20nm的銀納米粒子分別在10000r/min、8000r/min的轉速條件下通過離心濃縮十倍，然后將銀納米粒子分別重懸到包含有50mM NaCl的IOmM Tris-HCl緩沖液中，使得10nm、20nm的銀納米粒子的終濃度分別為50 nM、20 nM ;然后將DNA探針和銀納米粒子按照10:1的摩爾比例進行偶聯，具體如下:1 μ L的20 μ M SI核酸片段加入到100μ L 20 nM的20 nm銀納米粒子中，I μ L的50 μ M S2核酸片段加入到100 μ L 50 nM的.10 nm銀納米粒子中，孵育12h后，成功偶聯的銀納米粒子離心三次，將未偶聯的DNA去除，最后納米粒子均重懸到50 μ L pH 8.2，包含100 mM NaCl的25 mM Tris-醋酸緩沖液中，最終得到偶聯好的銀納米粒子；
.51:5’-TCACAGATGA GT-SH-3’ ；
.52:5’-SH-CACGAGTTGA CA-3’ ； (2)銀納米粒子在DNA酶的作用下組裝成不對稱手性二聚體 整個組裝體系包括:70 μ L SI修飾的20 nm的銀納米粒子，30 μ L S2修飾的10 nm的銀納米粒子，I UL 100 μ M底物鏈Sub，2 μ L 100 μ M酶鏈17Ε ;首先將整個反應體系加熱到70°C，然后將其自然冷卻至室溫以促進銀納米粒子的組裝；雜交8h后，將組裝產物離心三次，獲得 純化好的不對稱銀納米粒子二聚體；
Sub:5’-ACTCATCTGT GAACTCACTA T (rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3’ ；
17E:5’-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3’ ； (3)銀納米粒子組裝體作為檢測傳感器用于Pb2+的檢測，應用CD光譜進行檢測 在不對稱銀納米粒子二聚體中加入一系列不同濃度的Pb2+，在Pb2+的作用下，底物鏈斷裂，從而導致二聚體被分裂成單個的粒子，CD信號的強度降低，將不同目標物濃度下的反應體系用CD光譜進行檢測，得到200nm-800nm的CD光譜圖，隨著Pb2+濃度的增加，不對稱銀納米粒子二聚體的數量逐漸減少，CD信號逐漸降低，根據Pb2+濃度與CD信號強度之間的對應關系，繪制Pb2+濃度與CD信號強度的標準曲線，從而應用CD信號對Pb2+的濃度進行定量。
【文檔編號】G01N21/76GK103698320SQ201310691536
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】徐麗廣, 胥傳來, 尹紅紅, 匡華, 劉麗強, 馬偉, 宋珊珊 申請人:江南大學