使用熒光染料fitc與mito鑒定混合精子的方法
【專利摘要】一種使用熒光染料FITC與MITO鑒定混合精子的方法，屬精子鑒定方法，將FITC粉末中加入DMSO配置FITC濃儲液，將MITO粉末中加入DMSO配置MITO濃儲液，HEPES、氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、葡萄糖、乳酸鈉、牛血清白蛋白和超純水配置stainingtalp精子染色緩沖液，精子FITC染色、MITO染色，將用FITC染色后的精子與用MITO染色后的精子等量混合，FITC、MITO染色后和FITC染色與MITO染色后的精子等量混合后3h熒光檢測。本發明的有益效果是：在不影響精子活力的條件下，只通過兩種熒光染光可將形態相近的精子在一定時間內區分出來。
【專利說明】使用熒光染料FI TC與MITO鑒定混合精子的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于一種精子鑒定方法，特別涉及一種使用熒光染料FITC與MITO鑒定混合精子的方法。
【背景技術】
[0002]不同物種的精子從形態上具有一定差別，可以通過形態進行辨別，但有些物種的精子形態相近、大小、精頭部輪廓、尾部的長度僅僅通過顯微鏡進行辨別具有一定難度，特別是將兩種精子混合后很難再區分彼此。目前對于形態相近的精子最好的方法就是通過不同的顏色進行辨別。將不同精子用不同染料染色后混合，可以通過各自的顏色來區分不同的精子，但熒光染料品種很多，由于染料沒有特異性，因此混合后的不同精子染色后極易發生串色現象，串色后染成不同顏色的精子就變成同樣顏色無法區分；有的對精子活力有影響；有的熒光持續時間短。為此，需要尋找出一種即能不影響精子活力，又可以不串色的將形態相近、無法通過顯微鏡進行區別的精子進行辨別的方法。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種使用熒光染料FITC與MITO鑒定混合精子的方法，該技術原理是利用FITC可以與精子膜蛋白結合發出黃綠色熒光，MITO與精子線粒體結合發出紅色熒光，FITC與MITO對精子活力均無影響，兩種不同精子用兩種染料各自染色后混合在熒光下可區分兩種精子。
[0004]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:一種使用熒光染料FITC與MITO鑒定混合精子的方法，其特征在于:它包括以下步驟:
[0005]一、配制試劑:
[0006]( I)配置FITC濃儲液:
[0007]將FITC粉末中加入DMS0，使其終濃度為0.5M，分裝后避光在_20°C保存，使用期限為I年；
[0008](2)配置MITO濃儲液:
[0009]將MITO粉末中加入DMS0，使其終濃度為0.069mM/L,分裝后避光在_20°C保存，使用期限為I年；
[0010](3)配置staining talp精子染色緩沖液:
[0011]
【權利要求】
1.一種使用熒光染料FITC與MITO鑒定混合精子的方法，其特征在于:它包括以下步驟: 一、配制試劑: (1)配置FITC濃儲液: 將FITC粉末中加入DMS0，使其終濃度為0.5Μ，分裝后避光在_20°C保存，使用期限為I年； (2)配置MITO濃儲液: 將MITO粉末中加入DMS0，使其終濃度為0.069mM/L,分裝后避光在_20°C保存，使用期限為I年； (3)配置stainingtalp精子染色緩沖液: HEPES40mM/L 氯化鎂0.4mM/L 氯化鈉95mM/L 氯化鉀3mM/L 磷酸氫二鈉0.3mM/L 碳酸氫鈉10mM/L 丙酮酸鈉2mM/L 葡萄糖5mM/L 乳酸鈉25mM/L 牛血清白蛋白3g/L 超純水其余為超純水； 二、精子染色: (1)精子FITC染色:①取500萬精子加入5ml的stainingtalp精子染色緩沖液，使精子終濃度為100萬/ml ； ②在步驟①的精子溶液中加入0.75μ1的FITC濃儲液，使其終濃度為0.077mM/L,輕輕搖動將染色液搖勻； ③在37°C避光染色40分，將染色的精子輕輕搖晃； ④染色結束后，1500rpm離心10分,棄上清,再加入5mlstaining talp精子染色緩沖液，輕輕搖動；⑤1500rpm離心10分,棄上清,再加入5mlstaining talp精子染色緩沖液,輕輕搖動； ⑥1500rpm離心10分，棄上清，加入250μ1staining talp精子染色緩沖液; (2)精子MITO染色:①取500萬精子加入5ml的stainingtalp精子染色緩沖液，使精子終濃度為100萬/ml ； ②在步驟①的精子溶液中加入1.8?μ1的MITO濃儲液，使其終濃度為3.45Χ 10_5mM/L，輕輕搖動將液體搖勻； ③在37°C避光染色10分；④染色結束后，1500rpm離心10分,棄上清,再加入5mlstaining talp精子染色緩沖液，輕輕搖動；⑤1500rpm離心10分,棄上清,再加入5mlstaining talp精子染色緩沖液,輕輕搖動； ⑥1500rpm離心10分，棄上清，加入250μ1staining talp精子染色緩沖液; (3)精子混合: 將步驟(1)用FITC染色后的精子與步驟(2)用MITO染色后的精子等量混合，放在37°C,3h ； (4)檢測: ①對步驟(1)用FITC染色后的精子、步驟(2)用MITO染色后的精子進行熒光檢測； ②對步驟(3)FITC染色后的精子與MITO染色后的精子等量混合后3h的混合精子進行熒光檢測。`
【文檔編號】G01N1/28GK103822816SQ201310685086
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】蘇杰, 李喜和, 趙高平, 胡樹香, 孫偉 申請人:內蒙古賽科星繁育生物技術股份有限公司