二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法

二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法
【專利摘要】本發明公開了二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，屬于二硫代磷酸酯類農藥代謝物的檢測領域。所述方法包括：將含有二硫代磷酸酯類農藥代謝物的樣品進行前處理；用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸對樣品進行衍生化處理；衍生化產物用液相色譜-串聯質譜進行檢測。本發明檢測方法對于土壤中二硫代磷酸酯類農藥代謝物的回收率為79.3～90.7%，精密度為9.38%和5.93%，檢出限為0.01mg/kg和0.005mg/kg，在0.005～1.000mg/kg范圍內線性相關系數為0.9992和0.9997，具有良好的回收率、定量限、精密度和線性，符合農產品中農藥殘留及其代謝物檢測方法的要求。
【專利說明】二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種農藥代謝物的檢測方法，尤其涉及一種二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，屬于二硫代磷酸酯類農藥代謝物的檢測領域。
【背景技術】
[0002]有機磷農藥具有廣譜、高效等眾多優點，是當前農藥的三大支柱之一，廣泛用作農業殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、植物生長調節劑等，不論在品種的數量、產量的規模等都位居各種農藥首位(張強.有機磷農藥快速檢測方法研究綜述[J].廣東化工.2013，10 (40): 142-147)，有機磷農藥在農業的廣泛應用可能導致土壤、地表水及生物等被污染，并可能最終傳遞于食品(Ballesteros, E.，&Parrado, Μ.J..Continuous solid-phase extraction and gas chromatographic determinationof organophosphorus pesticidesin natural and drinking waters[J].Journal ofChromatography A，2004，1029，267-273.)。二硫代磷酸酯類有機磷農藥是農業生產中最常用一類農藥，部分農藥還在大量使用，多數為劇毒農藥，殺蟲效果好，降解周期長，主要種類有甲拌磷、乙拌磷、樂果、特丁硫磷及馬拉硫磷等，其主要代謝產物為0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯(圖1)。
[0003]傳統有機磷農藥的檢測一般采用氣相色譜或氣質聯用的方法，但在檢測二硫代磷酸酯類農藥代謝物過程中，都遇到了一些問題。
[0004]二硫代磷酸酯類農藥代謝物中磷原子接受巰基中的硫原子提供的孤對電子形成η鍵，其一對電子供給硫原子形成σ配鍵，因此氧原子上的氫易失去電子，發生親和取代反應(蘇壽承.有機磷農藥的分子結構和化學性質.浙江林學院學報.1988，5(3):318-327.)。痕量二硫代磷酸酯類農藥代謝物的檢測方法主要有氣相色譜法，由于代謝物結構不穩定，氣相色譜法采用五氟芐基苯(PFBBr)對代謝物進行衍生化處理，但存在衍生時間長，靈敏度不高等問題(楊玉林，芮振榮，王宏，等.氣相色譜法分析尿樣中六種有機磷農藥代謝產物[J].中國衛生檢驗雜志，2003, 13(1):24 ;鄔春華，鄭力行，周志俊.尿中有機磷農藥代謝產物的測定[J].復旦學報，2006，33 (4):552-554);采用五氟溴芐基苯(PFBBr)衍生時，將羥基屏蔽以減小0，O- 二甲基二硫代磷酸酯或0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的活性，再進行氣相色譜-FPD法進行檢測，實際測得土壤中0，O- 二甲基二硫代磷酸酯或0，O- 二乙基二硫代磷酸酯靈敏度分別為0.5mg/kg和1.0mg/kg，遠低于液相色譜_質譜法。
[0005]此外，O, O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯遇熱甲基化為三甲基硫代磷酸酯和0，O-二乙基-S-甲基二硫代磷酸酯(如圖1)，轉化效率不高，且轉化速率較慢，因而峰形對稱性不好，峰形不尖銳，無法準確定量。
[0006]二硫代磷酸酯類農藥代謝物極性較強，使用普通的液相色譜柱無法保留，即使使用對極性化合物保留較強的HILIC液相色譜柱，仍很難保留且無法將兩種化合物進行分離，因此無法采用液相色譜-質譜法直接進行檢測。采用液相色譜-串聯質譜法直接測定二硫代磷酸酯類農藥代謝物，色譜保留時間過短，代謝物無法完全分離，造成基質效應過高，實際樣品靈敏度較低(Schenke D..Analytical Method for the determinationof 0, O-diethylphosphate and 0，O-diethylthiophosphate in faecal sample[J].Chemosphere, 2000，41:1313-13201 ;劉倩，謝曼丹，朱育芬.硫逐磷酸酯和二硫代磷酸酯的電噴霧電離質譜[J].分析測試學報.2000, 19(5):24-27.)。
[0007]總之，采用氣相色譜測定二硫代磷酸酯類農藥代謝物(0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯)時，以五氟溴芐基苯作為衍生化試劑，存在衍生時間長，靈敏度低的缺陷，而且這種衍生化試劑不適合在液相色譜-串聯質譜上檢測；直接采用液相色譜-串聯質譜的檢測方法又存在無法保留，靈敏度低等問題。

【發明內容】

[0008]針對現有的二硫代磷酸酯類農藥代謝物檢測方法所存在的缺陷，本發明提供了一種新的二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法采用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸作為二硫代磷酸酯類農藥代謝物的衍生化試劑，所獲得的衍生化產物易溶于水相，適合液相色譜-質譜檢測，檢測靈敏度遠高于五氟溴芐基苯衍生后用氣相色譜進行檢測的方法，且衍生時間也顯著縮短。
[0009]為此，本發明首先提供了 3-溴甲基-4-硝基苯甲酸作為二硫代磷酸酯類農藥代謝物高效液相色譜-串聯質譜檢測的衍生化試劑的新用途；
[0010]本發明進一步提供了一種二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法包括:將待檢測的含有二硫代磷酸酯類農藥代謝物的土壤樣品進行前處理，得到二硫代磷酸酯類農藥代謝物提取物；用衍生化試劑將提取物進行衍生化處理，獲得衍生化產物；將衍生化產物用液相色譜-串聯質譜進行檢測，獲得樣品中二硫代磷酸酯類農藥代謝物的含量；其中，所述的衍生化試劑是3-溴甲基-4-硝基苯甲酸。
[0011]本發明通過實驗發現，3-溴甲基-4-硝基苯甲酸極性與二硫代磷酸酯類農藥相似，在乙腈中溶解度高，結構小于五氟溴芐基苯，親和取代位阻較小，更有利于衍生化反應的進行，采用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸對二硫代磷酸酯類農藥代謝物進行衍生化處理，衍生化產物易溶于水相，適合液相色譜-質譜檢測，檢測靈敏度遠高于五氟溴芐基苯衍生后用氣相色譜進行檢測，衍生時間縮短，更適合二硫代磷酸酯類農藥代謝物的檢測。
[0012]本發明中所述的二硫代磷酸酯類農藥代謝物優選為0，O- 二甲基二硫代磷酸酯或
O,O-二乙基二硫代磷酸酯；
[0013]本發明特別提供了一種0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法包括:將待檢測的含有0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的土壤樣品進行前處理，獲得0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和
O,O-二乙基二硫代磷酸酯的提取物；用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸對0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的提取物進行衍生化處理，獲得衍生化產物；將衍生化產物用液相色譜-串聯質譜進行檢測，獲得樣品中0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基~ 硫代憐Ife酷的含量。
[0014]本發明優選在氮氣保護加熱條件下對二硫代磷酸酯類農藥代謝物進行衍生化處理。
[0015]本發明檢測方法中所述的前處理方式依次包括:(1)從土壤樣品中提取得到二硫代磷酸酯類農藥代謝物提取物；(2)將提取物進行凈化處理。
[0016]步驟(I)中所述的從土壤樣品中提取得到二硫代磷酸酯類農藥代謝物提取物的方法包括:將土壤樣品風干后加入丙酮作為提取溶劑進行振蕩提取，將提取液離心后，取上清液；將上清液旋轉蒸發近干后用乙酸乙酯溶解得到二硫代磷酸酯類農藥代謝物提取物。有機磷農藥及其代謝產物在乙酸乙酯、乙腈及CHCl3等試劑中均有較好的溶解度，考慮到對環境的污染及乳化問題，通常提取試劑宜采用乙腈、丙酮或乙酸乙酯。土壤中成分較為復雜，腐殖質含量高的土壤色素含量較高，而乙酸乙酯對色素的提取效率不高，提取物色素類雜質含量較低，而且乙酸乙酯可以有效地降低土壤中各種無機鹽類的溶解，因此本發明優選采用乙酸乙酯作為提取溶劑從土壤中提取二硫代磷酸酯類農藥代謝物，再用活性炭小柱再除去殘留的色素，效果較為理想。
[0017]在對二硫代磷酸酯類農藥代謝物提取物進行凈化處理時，本發明最初的試驗中采用反相C18凈化小柱對提取物進行濃縮，濃縮后用5%甲醇的乙酸氨溶液溶解過柱，由于
O,O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯極性較強，固相萃取柱保留效果不好，損失較大；本發明通過進一步的試驗發現，將土壤樣品用乙酸乙酯溶解后用活性炭去掉殘留的色素后，再采用弗羅里硅土串聯小柱可以有效除去土壤中的色素及大分子的非極性有機物，凈化效果較好，因而本發明優選采用活性炭小柱加弗羅里硅土串聯固相萃取柱的正相凈化方式對提取物進行凈化。
[0018]本發明將衍生產物用ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱分離，流動相為乙腈和5mmol的乙酸銨，采用梯度洗脫模式，XEVO TQ三重四極質譜儀檢測，采用負多反應監測模式。
[0019]本發明將0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的衍生產物進行質譜分析發現，兩種物質的分子離子峰分別為336和365，豐度較高，說明反應產物純度較高，質譜電離較好。336和365進行二級電離，分別可以得到292、157、125和321、185、153等離子，也說明336和365分別為0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的衍生產物，292是0，O- 二甲基二硫代磷酸酯衍生產物脫掉羧基后的離子，157是0，O- 二甲基二硫代磷酸酯的離子峰，兩個離子都具有特征性，而292分子量大干擾少，且響應值較高；因此，本發明選擇192和157作為0，O- 二甲基二硫代磷酸酯衍生產物的監測離子，192為定量離子；0，O- 二乙基二硫代磷酸酯與0，O- 二甲基二硫代磷酸酯相似，衍生產物的監測尚子分別為321和185,321為定量尚子。
[0020]回收率、精密度、定量限及線性實驗表明，本發明檢測方法對于土壤中0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的回收率為79.3?90.7%，精密度為9.38%和
5.93%，檢出限為0.01mg/kg和0.005mg/kg,在0.005?1.000mg/kg范圍內線性相關系數為
0.9992和0.9997，具有良好的回收率、定量限、精密度和線性，符合農產品中農藥殘留及其代謝物檢測方法的要求，適合于科研或日常工作中有機磷農藥代謝物的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1 0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的結構式。[0022]圖2 3-溴甲基-4-硝基苯甲酸對二硫代磷酸酯類農藥代謝物進行衍生化反應的通式。
[0023]圖3 O, O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯衍生產物質譜圖。
[0024]圖4 0.01 μ g/mLO, O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯衍生產物多反應監測質譜圖。
【具體實施方式】
[0025]通過下列實施例將更具體說明本發明的實施方式，但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。儀器與試劑
[0026]液相色譜-質譜/質譜聯用儀(Waters公司)；振蕩器(IKA公司)；固相萃取裝置
坐寸ο
[0027]二硫代磷酸酯類農藥代謝產物標準品:0，O- 二甲基二硫代磷酸酯(0，0-dimethyldithiophosphrate, 97%,維賽諾化學技術有限公司)，0，O- 二乙基二硫代磷酸酯(O, 0-diethyl phosphorodithioate,97%,維賽諾化學技術有限公司)，標準品用乙腈溶解，4°C冰箱保存，使用時用流動相定容；衍生試劑:3_溴甲基-4-硝基苯甲酸(Sigma);500mg6mL活性炭固相萃取柱及500mg6mL弗羅里娃土固相萃取小柱(Supelco);乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純試劑。
[0028]實施例1 土壤中0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯含量的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法的建立
[0029]1、實驗方法
[0030]1.1、樣品前處理及衍生
[0031]土壤樣品風干后，過40目篩，稱取約5g (精確到0.0lg)于50mL離心管中，加入20mL丙酮,鏇潤混勻后,用振蕩器振蕩提取IOmin,然后4000r/min離心5min,取上層清液，殘渣在提取一次，合并提取液，旋轉蒸發至近干，用2mL乙酸乙酯溶解，過500mg6mL活性炭和500mg6mL弗羅里硅土串聯固相萃取柱(小柱經5mL乙酸乙酯活化處理)，再用ImL乙酸乙酯洗滌樣品瓶兩次，過串聯小柱，再用5mL乙酸乙酯洗脫固相萃取柱，流出液氮吹至近干。
[0032]殘渣用200 μ L乙腈溶解，加入干燥后的無水碳酸鉀約10mg，3_溴甲基_4_硝基苯甲酸30 μ L，充入氮氣后密封瓶口，置于50°C烘箱中衍生化反應5h，反應完成后加入ImL乙腈和5mmol乙酸銨(V:V=25:75)的流動相，盡快進行測定。
[0033]1.2、液相色譜條件
[0034]液相色譜為Waters ACQUITY Ultra Performance液相色譜系統,并配有溶劑管理器，液相色譜柱采用 ACQUITY UPLC BEH C18 (50mmX2.lmm1.d.，1.7um)，柱溫 30°C，流動相溶劑A為乙腈，溶劑B為5mmol的乙酸銨，采用梯度洗脫模式(表I)。
[0035]表I 0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯衍生產物優化后的液相色譜梯度洗脫條件
[0036]
【權利要求】
1.3-溴甲基-4-硝基苯甲酸作為二硫代磷酸酯類農藥代謝物衍生化試劑的應用。
2.按照權利要求1所述的應用，其特征在于:所述二硫代磷酸酯類農藥代謝物指示物是O，O- 二甲基二硫代磷酸酯或O，O- 二乙基二硫代磷酸酯。
3.—種二硫代磷酸酯類農藥代謝物的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法包括:將待檢測的含有二硫代磷酸酯類農藥代謝物的土壤樣品進行前處理，得到二硫代磷酸酯類農藥代謝物提取物；用衍生化試劑將提取物進行衍生化處理，獲得衍生化產物；將衍生化產物用液相色譜-串聯質譜進行檢測，獲得樣品中二硫代磷酸酯類農藥代謝物的含量；其特征在于:所述的衍生化試劑是3-溴甲基-4-硝基苯甲酸。
4.按照權利要求3所述的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，其特征在于:氮氣保護加熱條件下用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸對二硫代磷酸酯類農藥代謝物進行衍生化處理。
5.按照權利要求3所述的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，其特征在于，所述的前處理依次包括:(I)從土壤樣品中提取得到含有二硫代磷酸酯類農藥代謝物的提取物；(2)將提取物進行凈化處理。
6.按照權利要求5所述的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，其特征在于:步驟(I)中采用以下方式將土壤樣品中提取得到含有二硫代磷酸酯類農藥代謝物的提取物:將土壤樣品風干后加入丙酮作為提取溶劑進行振蕩提取，將提取液離心后，取上清液；將上清液旋轉蒸發近干后用乙酸乙酯溶解得到二硫代磷酸酯類農藥代謝物提取物；步驟(2)中采用正相凈化方式對提取物進行凈化。
7.按照權利要求6所述的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，其特征在于:步驟(3)中所述的正相凈化方式是采用活性炭小柱加弗羅里硅土串聯固相萃取柱的正相凈化方式對提取物進行凈化處理。
8.按照權利要求3所述的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，其特征在于:將衍生化產物用ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱分離，流動相為乙腈和5mmol的乙酸銨，采用梯度洗脫模式；收集的洗脫物用XEVO TQ三重四極質譜儀進行檢測，采用負多反應監測模式。
9.一種0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法包括:將待檢測的含有0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O-二乙基二硫代磷酸酯的土壤樣品進行前處理，得到含有0，O- 二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的提取物；用3-溴甲基-4-硝基苯甲酸對提取物進行衍生化處理，獲得衍生化產物；將衍生化產物用液相色譜-串聯質譜進行檢測，獲得樣品中0，O-二甲基二硫代磷酸酯和0，O- 二乙基二硫代磷酸酯的含量。
10.按照權利要求9所述的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，其特征在于:選擇192和157作為0，O-二甲基二硫代磷酸酯衍生化產物的監測離子，192為定量離子；選擇321和185作為0，O- 二乙基二硫代磷酸酯衍生化產物的監測離子，321為定量離子。
【文檔編號】G01N30/02GK103616456SQ201310674588
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】劉永, 宋金鳳, 丁為民, 王洋, 胡志偉 申請人:黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心