無蛋白包被板封閉液的制作方法
【專利摘要】本發明屬于臨床體外檢測【技術領域】，特別涉及一種無蛋白包被板封閉液含有pH=7.4的Tris-HCL緩沖液、大分子物質、表面活性劑、海藻糖、疊氮鈉，大分子物質為PEG-20000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或兩種的混合物。使用本發明的包被板封閉液，不但能夠與包被板表面上的空白位置結合，對包被板起到封閉效果，而且在包被板離開低溫環境后能夠更長時間地保持其表面抗原/抗體的生物活性。本發明提供的封閉液是一種無蛋白封閉液，成本低、操作簡單、性質穩定，封閉時間也較BSA短，能達到降低本底且穩定包被板的效果。
【專利說明】無蛋白包被板封閉液
[0001]【技術領域】
本發明屬于臨床體外檢測【技術領域】，特別涉及一種無蛋白包被板封閉液。
[0002]【背景技術】
1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linkedimmunosorbent assay, elisA)用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。這一方法的基本原理是:①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。該檢測體系中，保證一個穩定的固相載體包被板最為重要。
[0003]將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用力。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯結多發生在Fe段上，抗體結合點暴露于夕卜，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。
[0004]封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關大分子溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。如果封閉做的不好，造成制備的試劑盒出現假陽性的情況，因此封閉工作對于ELISA檢測試劑盒的準確檢測至關重要。
[0005]封閉液中的大分子物質可以與固相載體表面上的空白位置結合，以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在固相載體表面，有效地覆蓋了蛋白結合位點，避免樣本中的背側蛋白非特異性結合到固相載體表面，出現假陽性的現象。封閉劑應封閉所有的未結合位點而不影響表面上的靶蛋白，同時也不結合靶蛋白表位、不與抗體或檢測蛋白有交叉反應。
[0006]封閉液常用的物質有BSA、脫脂牛奶、絡蛋白等，但是大部分BSA中有抗體殘留，會導致抗原/抗體之間的交叉污染，產生高背景，使得本底水平增高；由于奶粉的成分復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用；絡蛋白雖然比較純凈，穩定性也較好，但是由于蛋白上的離子基團非特異性吸附，會導致封閉后的微孔板空白吸光度增高，影響試劑盒檢測的線性和靈敏度；同時幾種常見的封閉液封閉處理后的包被板在2?8°C冰箱存放一周或37°C破壞一天，其生物活性就損失了 50%以上。[0007]可見,常規的封閉液應用后,包被板的本底較高,而且封閉后的包被板穩定性較差。
[0008]
【發明內容】
針對于以上常規封閉液存在的問題，本發明采用一種以高分子物質為主體制備的無蛋白封閉液，分子呈中性，無特異性吸附，性質穩定，封閉時間也較BSA短，能達到降低本底且穩定包被板的效果。
[0009]本發明是通過以下措施實現的:
一種無蛋白包被板封閉液，含有以下原料: pH=7.4 的 Tris-HCL 緩沖液 0.01-0.lmol/L,
大分子物質0.5-lg/L,
表面活性劑0.5-5g/L，
海藻糖l-10g/L,
疊氮鈉0.1-lg/L,
所述大分子物質為PEG-20000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或兩種的混合物。
[0010]所述的無蛋白包被板封閉液，含有以下原料: ρΗ=7.4 的 Tris-HCl 緩沖液 0.lmol/L,
PEG-20000lg/L,
表面活性劑5g/L，
海藻糖10g/L，
疊氮鈉lg/L。
[0011]所述的無蛋白包被板封閉液，含有以下原料: pH=7.4 的 Tris-HCl 緩沖液 0.01mol/L,
聚乙烯吡咯烷酮0.5g/L，
表面活性劑0.5g/L，
海藻糖lg/L，
疊氮鈉0.lg/L。
[0012]所述的無蛋白包被板封閉液，含有以下原料: pH=7.4 的 Tris-HCl 緩沖液 0.05mol/L,
PEG-200000.5g/L,
聚乙烯吡咯烷酮0.5g/L，
表面活性劑lg/L，
海藻糖5g/L，
疊氮鈉0.5g/L。
[0013]優選所述表面活性劑為吐溫-20、曲拉通X-100和聚氧乙烯月桂醚中的一種。
[0014]本發明的有益效果:
借助于本發明提供的技術方案，使用本發明的包被板封閉液，不但能夠與包被板表面上的空白位置結合，對包被板起到封閉效果，而且在包被板離開低溫環境后能夠更長時間地保持其表面抗原/抗體的生物活性。本發明提供的封閉液是一種無蛋白封閉液，成本低、操作簡單、性質穩定，封閉時間也較BSA短，能達到降低本底且穩定包被板的效果。【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為對比實施例1得到的包被板檢測高低值質控品的結果，
圖2為實施例1得到的包被板檢測高低值質控品的結果。
【具體實施方式】
[0016]為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例來進一步說明。
[0017]對比實施例1
常規的包被板封閉液，其組分和濃度為:
BSA5g/L
吐溫-20 (Tween-20)5g/L
疊氮鈉lg/L
包被板封閉液使用方法:
首先，把抗原或抗體以PH7.4 0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋成一定濃度；其次，按100 μ L/孔加入稀釋好的包被液，在37°C下包被2小時；然后，棄去包被板內的包被液，將包被板拍干后，按100 μ L?300 μ L /孔加入上述配制好的包被板封閉液，在2?8°C下包被16?20小時；最后,棄去包被板內的封閉液,將包被板拍干后，放置于濕度小于30%的35?39°C干燥箱中供干4?6小時即可。
[0018]常規實驗包被的丙型肝炎核心抗原(HCV)單抗建立的丙型肝炎核心抗原檢測試劑盒(ELISA)包括以下步聚:
1、以抗HCV單抗包被白色微孔板，包被濃度為Syg/miaOOyL/孔，37°C包被2小時，洗板后，以包被板封閉液按200 μ L /孔4°C包被8小時后,棄去包被板內的封閉液,拍干后，放置于濕度為25%的37°C干燥箱中烘干4小時；再把多個包被好的包被板分別放置于37°C的恒溫箱中3天、7天、15天、30天、60天后取出，與2?8°C存放的包被板平行比較；
2、設定好加樣孔，將50μ I系列HCV定標品和質控品QCL (低濃度)、QCH (高濃度)加在存放在2?8°C的HCV包被板和分別放置于37°C的恒溫箱中3天、7天、15天、30天、60天破壞后的HCV包被板上，再加50μ1稀釋抗HCV單抗-HRP酶結合物，37°C反應I小時后，洗板5次，拍干；
3、每孔加入顯色液A液和B液各50uL，避光37°C顯色15min;
4、每孔加入終止液各50uL，用酶標儀在波長450nm/630nm處讀取吸光度(OD)值。
[0019]檢測結果如下表I所示:
表I不同存放條件檢測各個濃度標準品的OD值
【權利要求】
1.一種無蛋白包被板封閉液，其特征在于含有以下原料: pH=7.4 的 Tris-HCL 緩沖液 0.01-0.lmol/L, 大分子物質0.5-lg/L, 表面活性劑0.5-5g/L， 海藻糖l-10g/L, 疊氮鈉0.1-lg/L， 所述大分子物質為PEG-20000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或兩種的混合物。
2.根據權利要求1所述的無蛋白包被板封閉液，其特征在于含有以下原料: ρΗ=7.4 的 Tris-HCl 緩沖液 0.lmol/L, PEG-20000lg/L, 表面活性劑5g/L， 海藻糖10g/L， 疊氮鈉lg/L。
3.根據權利要求1所述的無蛋白包被板封閉液，其特征在于含有以下原料: pH=7.4 的 Tris-HCl 緩沖液 0.01mol/L, 聚乙烯吡咯烷酮0.5g/L， 表面活性劑0.5g/L， 海藻糖lg/L， 疊氮鈉0.lg/L。
4.根據權利要求1所述的無蛋白包被板封閉液，其特征在于含有以下原料: pH=7.4 的 Tris-HCl 緩沖液 0.05mol/L, PEG-200000.5g/L, 聚乙烯吡咯烷酮0.5g/L， 表面活性劑lg/L， 海藻糖5g/L， 疊氮鈉0.5g/L。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的無蛋白包被板封閉液，其特征在于所述表面活性劑為吐溫-20、曲拉通X-100和聚氧乙烯月桂醚中的一種。
【文檔編號】G01N33/543GK103616507SQ201310670766
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】譚柏清, 王進, 甘宜梧 申請人:山東博科生物產業有限公司